Name: Préparation de neurones co-cultures avec lunité portable de précision (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Apprenez à préparer des co-cultures neuronales interconnectées en utilisant un dispositif microfluidique portable. Cette méthode permet l'arrangement de neurones uniques avec des entrées cellulaires minimales pour étudier les connexions neuronales.

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Les auteurs tiennent à remercier Ulrich Marggraf (ISAS) pour SU-8 de fabrication et Maria Becker (ISAS) pour l&#39;imagerie SEM. La recherche a été soutenue financièrement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), un Bundesministerium für Bildung und Forschung subvention (BMBF 0101-31P6541) et par le Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf grâce l&#39;École internationale d&#39;études supérieures Leibniz «biologie des systèmes Lab-on-a-Chip» pour un soutien financier.

Les protocoles sont conçus pour les neuroscientifiques, et sont résumées dans la figure 2. Comme tel, il est recommandé que la microfabrication des SU-8 maîtres utilisés pour la réplication PDMS est sous-traitée à des installations commerciales ou institutionnelles. Les deux modèles de masques de couche sont disponibles gratuitement que les informations complémentaires (ZIP) de la Société royale du site Chimie 12. Fait important, le SU-8 première couche doit être fabriqué sur une profondeur de 2,5 à 3,0 um, et le second à une profondeur de 25 à 30 um. Ce sont des dimensions clés nécessaires pour formation de réseaux de neurones efficace. La limite de taille de 3 microns est également nécessaire d&#39;éviter les neurones étant transportées ou de migrer entre les deux compartiments 12. 1. Microfluidique réplication de périphériques dans PDMS <ol><li> Mélanger le prépolymère PDMS à fond avec de l&#39;agent de durcissement (184) dans un rapport de 10:01 et dégazer le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 20 min en général. Vous pouvez aussi mettre le mélangeture dans un tube Falcon de 50 ml et utiliser faible g une centrifugation pour le dégazage. </li><li> Placer la couche microstructurée 2-SU-8 sur une plaquette plaque chauffante à 80 ° C et aligner des trames de polymère à chaque dispositif sur la tranche. Verser le PDMS dans les cadres jusqu&#39;à une profondeur de ≥ 5 mm et permettre&gt; 1 h afin d&#39;assurer le durcissement thermique complet. </li><li> Une fois durci, retirer la plaquette de la plaque de cuisson et laisser refroidir sur une surface plane. </li><li> Porter des lunettes de protection et de travail d&#39;un coin (loin des SU-8 microstructures) avec un scalpel rigide pour forcer doucement le cadre et PDMS de la plaquette. </li><li> Retirer le moule PDMS du cadre et utiliser une paire de ciseaux pour couper le dispositif de PDMS excès. Ce que l&#39;on appelle souvent clignotant est produit quand un mince film de PDMS s&#39;étend entre le bâti de polymère et la surface de la plaquette. </li><li> PDMS restants peuvent être appliqués sur toute la plaquette et on les durcit pour protéger la pastille durant le stockage. Enlever avant moulage d&#39;un dispositif ultérieur, et en faisant enlever tout particuler les contaminants de la surface. </li></ol> 2. Assemblée de l&#39;appareil et l&#39;interconnexion <ol><li> Préparer les ports d&#39;interface 6 en utilisant un 3 mm de diamètre biopsie punch. Travailler sur une surface sombre, dans de bonnes conditions d&#39;éclairage et les caractéristiques microstructurées tournées vers le haut pour faciliter l&#39;alignement des ports avec les canaux microfluidiques. </li><li> Inspectez l&#39;appareil pour les particules. Enlevez ces aide de ruban adhésif réversible. </li><li> Le circuit microfluidique est encapsulé à l&#39;aide d&#39;une couche de PDMS mince monté sur une lamelle de verre: Elles sont préparées par coulée d&#39;un petit volume (~ 0,5 ml) du mélange d&#39;agent de PDMS-durcissant (10:01, 601) sur la base d&#39;un flexible, qualité bactériologique boîte de Pétri. Appuyez doucement sur une lamelle sur la couche de PDMS, placer sur la plaque chauffante et le traitement thermique pendant quelques minutes. Rapidement après refroidissement, utiliser un scalpel pour découper et prix de la bicouche lamelle-PDMS de la boîte de Pétri. Couper avec des ciseaux si nécessaire. </li><li> liaison plasma de l&#39;appareil PDMSet la couche de support pour produire une bonne étanchéité: Conditions idéales instrument spécifique. Par exemple, un four à plasma fonctionnant à 70 W et 40 kHz, dans une atmosphère d&#39;oxygène de 0,2 mbar pendant 40 secondes produit une excellente liaison PDMS-PDMS. Une fois le plasma traité, appuyez sur les deux pièces ensemble et laisser reposer pendant une minute pour coller correctement. </li><li> Utiliser un tube en silicone (1,6 mm d&#39;identité; 3,2 mm OD) pour s&#39;interfacer avec des pompes et des seringues. </li></ol> 3. Biomatériaux Modélisation et opérations microfluidiques Les protocoles de biomatériau in situ structuration, de la culture des neurones et des traitements fluidiques sont illustrés dans la figure 2. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Des protocoles microfluidiques Illustrated. A) PL et PLL-g-PEG motif; ajout de la couche d&#39;adhésion cellulaire (par exemple,PL, vert), avec production d&#39;évaporation de l&#39;eau du masque aligné B) de traitement par plasma atmosphérique de l&#39;air de la PL exposé.; deux broches d&#39;antenne sont utilisés, avec l&#39;antenne d&#39;introduction de plasma illustré avec une étoile rose. C) PBS (bleu) lavage par aspiration est utilisé pour éviter de contaminer la région de plasma traité par PL. D) La livraison de PLL-g-PEG (rouge ) par aspiration à enrober les régions de plasma traité E) cellule de chargement.; formation de réseaux microfluidique simultanée des neurones à deux compartiments d&#39;accompagnement par aspiration, F) médias (perfusion rose) à l&#39;aide d&#39;un flux à entrainement hydrostatique La G) traitements fluidiques isolées.; traitement périphérique d&#39;un agent de test (noir) livré à partir du fond de flanc d&#39;entrée par aspiration et H) de traitement central délivré de l&#39;entrée centrale inférieure par aspiration. Figure et légende reproduites avec la permission de la Royal Society of Chemistry(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Plasma immédiatement après le collage des canaux microfluidiques PDMS sont très hydrophile (angle de contact ≤ 5 °). De telles surfaces sont adaptés à l&#39;adhérence et à la culture de lignées cellulaires telles que les cellules différenciées analogues à des neurones humains SH-SY5Y. Pour la culture ex vivo des neurones primaires et la culture de lignées de cellules précurseurs neuronales telles que la lignée Lund de cellules mésencéphaliques humain (LUHMES) un revêtement de polyamine, soit la polylysine (PL) ou la polyornithine (PO), est nécessaire comme point d&#39;ancrage électrostatique. En plus des protéines d&#39;adhésion comme la laminine ou la fibronectine sont souvent requis que le revêtement de l&#39;intégrine interfaçage. Toutefois, les revêtements PL et PO se lient facilement les neurones, ce qui entrave la distribution microfluidique aux sites de réseau et également imposer des contraintes de cisaillement indésirables. Pour résoudre ce problème biomatériau à la pucestructuration est nécessaire de localiser les matériaux d&#39;adhérence au niveau des sites de piégeage et les microcanaux de excroissance. Cela favorise également le développement des liaisons inter-compartiments et réduit l&#39;enchevêtrement local. Le protocole comprend également l&#39;ajout de matériaux PEG dans les zones voisines pour assurer les protéines et les neurones sont limitées aux endroits désirés pendant une longue culture. Le protocole suivant est décrit dans la figure 3: <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. L&#39;eau de masquage pour la modélisation biomatériau par pochoir plasma. A) Illustration du processus de masquage de l&#39;eau avec les PDMS micropiliers épingler le ménisque d&#39;eau en place pour pochoir plasma. Courbure du ménisque dans le plan vertical a été négligée. B) de l&#39;eau masque visualisés avec un colorant rouge et positionné par ménisque pmanche. C) Le motif revêtement PL-FITC imagée après plasma pochoir. D) L&#39;addition de protéines de rejet et anti-cellule PLL-g-PEG-TRITC à un PL-FITC revêtement de plasma à motifs. Cela a été utilisé pour l&#39;enregistrement des cellules SH-SY5Y et également pour un motif d&#39;une couche supplémentaire de la fibronectine des cellules LUHMES. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> masquage de l&#39;eau pour in situ biomatériaux Modélisation par pochoir plasma <ol><li> Peu de temps après le collage de plasma pipette d&#39;un volume de 0,5 ul de PL ou PO (100 ug / ml dans du PBS 1x) dans l&#39;orifice central inférieur. En quelques secondes, l&#39;ensemble du circuit microfluidique est rempli par capillarité. Laissez agir quelques minutes pour enrober complètement les PDMS surfaces hydrophiles avec le polyamines. </li><li> Éliminer les molécules de polyamines non liés par lavage entraîné aspiration-avec 1x PBS (voir figure 2C) pendant 1 min. </li><li> Retirez tous PBS à partir des ports et chauffer l&#39;appareil par un éclairage avec un microscope. Cela augmente l&#39;évaporation à partir des ports pour la formation rapide du masque de l&#39;eau. Le masque de l&#39;eau (illustré sur la figure 3A et documentés dans la figure 3B) est établi à l&#39;intérieur de ~ 5 min. </li><li> Inspecter le dispositif par microscopie à assurer masquage d&#39;eau est terminée. S&#39;il vous plaît noter structures de réservoir en amont du site de réseau sont incluses dans la conception de masque pour prolonger la stabilité du masque de l&#39;eau (~ 15 min). </li><li> Insérer les broches en acier inoxydable dans les ports (figure 2B). Ceux-ci sont utilisés pour coupler le plasma généré par une décharge corona pression atmosphérique à main ou d&#39;un générateur Tesla (par exemple, fonctionnant à 2 MHz, le signal de 30 kV) 19,20 dans les canaux microfluidiques vacants. Pointer le bout de til plasmatique source proche de la pointe d&#39;une épingle et plasma traiter la microcanaux pour ≤ 1 sec. Utilisez conditions de faible éclairage pour observer la structuration de plasma. </li><li> Retirer le masque de l&#39;eau avec une étape de lavage. Utilisez aspiration parallèle des 3 ports supérieurs. Utiliser quatre longueurs égales de tubulure en silicone reliés par un adaptateur 4 voies à une pompe d&#39;aspiration pour réaliser une aspiration parallèle. Lancer aspiration et de distribution de PBS dans les 3 ports bas pour attirer PBS dans le circuit microfluidique. De cette manière, un contraste de matériau PDMS-polyamine est produit (voir la figure 3C). Évacuer PBS du circuit microfluidique et laisser reposer pendant plusieurs heures pour le restaurer, état hydrophobe natif. Ceci rend les PDMS entièrement non permissive de l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Si, nécessaires matériaux d&#39;adhésion supplémentaires, telles que la laminine ou la fibronectine les étapes suivantes sont nécessaires et doivent être effectuées immédiatement après avoir enlevé le masque de l&#39;eau: la pipette un de volume de 10 ul de la greffe co-polymère de poly-L- Lysine-poly (éthylène glycol) (PLL-g-PEG, 100 pg / ml, dans du PBS) dans les deux canaux de transmission indirecte de fond, suivi par aspiration à partir des canaux supérieurs flanquantes pendant 2 min. </li><li> Sans interruption de l&#39;écoulement, enlever l&#39;excès de PLL-g-PEG par échange avec un tampon PBS. Cette sélectivement enrobe les régions non revêtues de polyamine avec le fragment PEG agissant pour empêcher l&#39;adsorption de protéines et l&#39;adhésion cellulaire 17,21. </li><li> les protéines d&#39;adhésion comme la laminine ou la fibronectine peuvent ensuite être co-localisées avec le revêtement de poly-amine: Introduire à la pipette volumes de 10 ul de ces protéines de la MEC (typiquement 10 pg / ml) dans tous les trois orifices de fond. Aspirer des trois premiers ports jusqu&#39;à ce que le dispositif est rempli de la solution de protéine et incuber pendant 1 heure pour produire un revêtement de bonne qualité. </li><li> Éliminer les protéines en excès par aspiration PBS à partir des 3 ports de fond. </li></ol></li><li> Microfluidique unique neurone rangeant <ol><li> Prime appareils avec appropriémangé médias. Ajouter des volumes de 20 pi à 3 orifices de fond et par aspiration parallèle à partir des trois ports supérieurs remplir rapidement le circuit microfluidique avec les médias. Utiliser un raccord de tubulure à 4 voies pour coupler les trois orifices supérieurs par l&#39;intermédiaire de tube en silicone de longueur égale à une pompe d&#39;aspiration. </li><li> Ajouter 20 ul d&#39;une suspension de cellules désagrégées (1 x 10 6 cellules / ml) à chacun des ports d&#39;entrée (0 flanquantes, dans la figure 1). </li><li> Équipé d&#39;une pompe d&#39;aspiration avec un régulateur de débit ou utiliser une seringue pour l&#39;aspiration douce des 3 ports supérieurs. Neurone complet de formation de réseau nécessite généralement 1 min. </li><li> Récolter les neurones excédentaires restantes dans les quatre ports d&#39;accompagnement avec une pipette pour rangeant dans des dispositifs microfluidiques ultérieures. </li><li> Retirez le tube. Remplissez tous les ports avec les médias et placer l&#39;appareil dans l&#39;incubateur. En quelques heures, les cellules deviennent totalement adhérente sur le modèle biomatériau. </li></ol></li><li> Neuron Culture, sélective traitement fluidique, et Immunostaining <ol><li> Échanger les médias par perfusion périodique utilisant l&#39;avance hydrostatique (2 mm de différence de hauteur de la colonne est lent approprié). </li><li> Alternativement, submerger le dispositif microfluidique dans les médias, d&#39;échanger les médias périodiquement (2-3 jours) avec des cultures de cellules standard. </li><li> Fluidiques traitements sélectifs de chaque neurone compartiment de culture ou de l&#39;excroissance des neurites compartiment central sont obtenus comme suit: Distribuer 20 ul de la substance d&#39;essai dans l&#39;orifice de fond du canal d&#39;intérêt, et aspirer de l&#39;orifice au dessus. Pour de longs traitements réduisent le débit à l&#39;aide d&#39;un régulateur de débit et de reconstituer la substance d&#39;essai au besoin. </li><li> Protocoles IMMUNOCOLORATION varient pour chaque cible moléculaire et réactifs associés. Afin de lutter contre le risque potentiel de dommages induits par cisaillement aux neurones un débit lent a été utilisé. Il en résulte une augmentation des temps d&#39;application pour perfuser pleinement le système, un allongement des délais de protocole normales. Hyperfusion drostatic utilisant les ports avec différentes hauteurs de la colonne (par exemple, par 2 mm) a été utilisé pour fournir des réactifs. Plus réactif et plus rapide suppression à l&#39;aide d&#39;une pompe peuvent être utilisés pour réduire les délais d&#39;expérimentation. Connectez une pompe d&#39;aspiration pour les trois ports supérieurs à attirer réactifs des 3 ports de fond. </li></ol></li></ol>

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<li>Magalães, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li>
<li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La technique de formation de réseau microfluidique est le premier de son genre qui permet une manipulation simple neurone de précision pour établir cultures minimalistes. Couplé avec la méthode in situ de structuration biomatériau, une approche puissante pour aligner les modèles de cellules avec des structures microfluidiques, ces cultures minimalistes ont des niveaux de connectivité haut de intercompartment à une réduction de l&#39;enchevêtrement local. Ces caractéristiques peuvent être utilisées pour...

<html> Tissu neuronal est très complexe; un mélange cellulaire hétérogène spatialement ordonné dans des couches et des compartiments définis et avec une connectivité plastique par des contacts cellulaires et en particulier par l&#39;intermédiaire des axones et dendrites excroissances. De nouvelles techniques sont nécessaires pour conférer une plus grande liberté d&#39;expérimentation pour gagner une compréhension plus profonde et mécanismes démêler centrales à la maladie, le développement et la fonction saine. La chambre Campenot 1,2 et, plus récemment, des modes de réalisation microfabriqué 3,4 peuvent être utilisés pour la préparation ex vivo des co-cultures de neurones en réseau ayant la capacité de perturber sélectivement les différentes populations somatiques et également leurs excroissances de neurites. Ces dispositifs microfluidiques ont par exemple été utilisés pour étudier la dégénérescence axonale et la régénération chimique suivante 5,6 ou laser axotomie 6-8, tauopathie 9, la diffusion virale 10,11, et la localisation des ARNm dans les axones 4. ent &quot;&gt; Pour étendre la portée des neurobiologistes, les développements technologiques sont nécessaires pour préparer les co-cultures de neurones minimalistes. Cela permet désenchevêtrement du réseau neuronal pour l&#39;étude du système avec une seule cellule et une précision sub-cellulaire. L&#39;obligation pour les nombres de cellules minimaux ouvre la possibilité d&#39;analyser les différents types de cellules rares, y compris les cellules de la substantia nigra dopaminergiques pertinents pour la maladie de Parkinson, les ganglions de la spirale de l&#39;oreille, des neurones périphériques, et les cellules souches. Au-delà, l&#39;économie cellulaire est pertinente à l&#39;initiative 3R. L&#39;utilisation de ces plates-formes microfluidiques, des écrans de toxicité à grande échelle ou d&#39;autres haut débit, riche en données série expérimentale nécessitant des neurones des animaux peut maintenant être considérée. Dans ce document, les protocoles pour la fabrication et l&#39;utilisation d&#39;un dispositif microfluidique sont décrits. Formation de réseau microfluidique en combinaison avec un biomateri in situProcédé de formation de motifs al peut être utilisé pour l&#39;enregistrement des co-cultures de neurones fortement interconnectés en utilisant les nombres de cellules minimal. Formation de réseaux microfluidique est basé sur une approche de flux différentiel 12-15, où les pièges microstructurées sont placés dans un circuit fluidique (illustré avec des images MEB de la figure 1). Le chemin 0 → 1 présente la plus faible résistance fluidique (R 2&gt; R 1) pour le transport de neurones à une rangée linéaire d&#39;ouvertures microstructurées - les ports d&#39;entrée vers les canaux de la croissance des neurites. Occupation du piège par une seule cellule empêche localement le flux de détourner les lignes de courant pour piéger les cellules suivantes dans les pièges voisins. Occupation totale des pièges contenus dans le tableau commute le rapport fluidique (R 1&gt; R 2) pour dévier les lignes de courant dans le trajet sinueux (0 → 2) pour produire un mode de fonctionnement en dérivation pour l&#39;élimination des excès de neurones. Figure 1. Microfluidique circuit. A) Le circuit de résistance différentielle fluidique pour seule formation de réseaux de neurones, avec accompagnement des chambres de culture reliés entre eux par des canaux de la croissance des neurites. B, C images) au MEB de la bicouche neurone compartimentée matrice de co-culture avec des ménisques micropiliers goupiller. Avec cette conception, structures neurone piégeage en forme de trident ont été utilisés pour promouvoir fasciculation des excroissances de neurites. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> La préparation des réseaux neuronaux microélectrodes sur des substrats planaires peut facilement être atteint (pour exampl<html> es de notre groupe, voir Frimat et al. 16 et Heike et al. 17). Cependant, l&#39;encapsulation des motifs de matériau bioactif dans des dispositifs PDMS et à l&#39;exigence d&#39;alignement échelle micrométrique de ceux-ci aux canaux microfluidiques pose un défi technique majeur. Dans la section 3.1 un protocole pour l&#39;en-puce, ou in situ, la préparation de modèles de biomatériaux est présenté. Ces modèles permettent l&#39;enregistrement des neurones pendant de longues échelles de temps de la culture et de promouvoir des excroissances entre les compartiments. Microstructures ménisque-épinglage sont utilisées pour aligner une dite masque de l&#39;eau avec le neurone sites et des canaux de l&#39;excroissance de neurites rangeant. Le masque protège les revêtements de l&#39;eau des molécules d&#39;adhésion pendant le traitement au plasma, tandis que les surfaces exposées sont désintégrées pour définir le motif de biomatériau. En outre, les protocoles sont prévus pour la culture de cellules et pour l&#39;isolation fluidique nécessaire pour le traitement sélectif des différents compartiments de co-culture. ve_content &quot;&gt; Les protocoles sont conçus pour tirer parti des principes conviviales de lithographie douce pour la réplication de poly (diméthyl) (PDMS) des dispositifs microfluidiques 18. De même, biomatériau in situ structuration en est simple, l&#39;exploitation évaporation de surface et les phénomènes de tension, et seulement nécessitant une source de plasma portatif peu coûteux. Circuit microfluidique efficacement les traitements spécifiques des programmes de chargement de la cellule et des soutes qui rend ces opérations simplement une question de la distribution des matériaux dans l&#39;orifice inférieur correspondant et l&#39;aspiration par le haut. De cette manière, il est destiné à donner les neurobiologistes la liberté de préparer et d&#39;utiliser des dispositifs microfluidiques dans leurs propres laboratoires.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Coverslips VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>3 mm poinçons de biopsie</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Manipuler avec soin - extrêmement tranchant</td></tr><tr><td>Tube Tygon</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1,65 mm ID ; 3,35 mm OD</td></tr><tr><td>1 ml seringue ( Inkjekt et Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur de tube 4 voies</td><td>VWR ou Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de débit</td><td>Harvard Appareil</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>broches de 0,5 mm</td><td>Départements</td><td></td><td></td>de couture</tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>La stabilité en stockage peut être un problème</td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Polyornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exemple de pompe d’aspiration</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>Appareil à décharge corona portatif</td><td>Leybold-Heraeus, USA</td><td>VP23</td><td>Peut ne pas être conforme aux normes de sécurité de votre pays</td></tr><tr><td>Four à plasma femto</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide ou centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Réalisation microfluidiques de la chambre Campenot ont suscité un grand intérêt de la communauté des neurosciences. Ces plates-formes de co-culture interconnectés peuvent être utilisés pour étudier une variété de questions, allant de la neurobiologie développementale et fonctionnelle à l&#39;infection et la propagation de la maladie. Cependant, les systèmes classiques nécessitent des apports importants cellulaires (plusieurs milliers par compartiment), l&#39;insuffisance de l&#39;étude des cellules de faible abondance, comme primaire nigra dopaminergique substance, les ganglions spirale, et les neurones de melanogaster de drosophile, et peu pratique pour l&#39;expérimentation à haut débit. Les cultures denses sont également hautement enchevêtrées localement, avec quelques excroissances (&lt;10%) interconnectant les deux cultures. Dans cet article, les protocoles microfluidiques et structuration simples qui sont décrits relever ces défis: (i) un seul neurone microfluidique méthode rangeant, et (ii) un procédé de masquage de l&#39;eau pour la modélisation de plasma revêtements de biomatériaux à REGIster neurones et favoriser l&#39;excroissance entre les compartiments. Co-cultures de neurones minimalistes ont été préparés avec de haut niveau (&gt; 85%) connectivité autre et d&#39;peuvent être utilisés pour des expériences à haut débit de la neurobiologie avec une précision d&#39;une cellule unique.

exploits de masquage de l&#39;eau de surface tension. La tolérance à la pression à l&#39;interface air-liquide échelles inversement avec le rayon de courbure [ <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Produisant des interfaces très stables à des dimensions microfluidiques. Les micropiliers ancrer efficacement le masque de l&#39;eau en place. formation d&#39;un masque de l&#39;eau est conduite par évaporation à partir des ports microfluidiques, avec l&#39;augmentation du taux...

Les protocoles pour seul neurone de formation de réseau microfluidique et le masquage de l&#39;eau pour le motif de revêtements de biomatériaux plasma dans la puce sont décrits. Co-cultures fortement interconnectés peuvent être préparés en utilisant les entrées de cellules minimales.

Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

L'objectif général de cette procédure est de disposer des neurones individuels dans deux compartiments microfluidiques afin de préparer une co-culture neuronale connectée. Cela est réalisé en premier lieu par le moulage par réplique du dispositif microfluidique en PDMS, puis en encapsulant le dispositif par liaison au plasma. La deuxième étape consiste à dessiner un motif de polylysine à l'intérieur du dispositif microfluidique.Cela est réalisé en remplissant le dispositif avec de la polylysine, en permettant la formation d'une masse d'eau par évaporation, puis en utilisant un traitement au plasma pour éliminer la polylysine exposée et créer ainsi le motif de biomatériau. Ensuite, utilisez une seringue pour aspirer les neurones à travers le circuit microfluidique afin d'obtenir un alignement de neurones individuels. Le dispositif est placé dans l'incubateur de culture tissulaire pour permettre aux prolongements neuritaux de s'étendre et de relier les deux populations de neurones.La dernière étape consiste à utiliser une pompe d'aspiration pour traiter sélectivement un compartiment et surveiller la propagation des matériaux et de la pathologie au sein du circuit neuronal. La démonstration de la procédure sera effectuée par Yayu Chang et Sarada du laboratoire ISIS. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les chambres à composants PDMS disponibles commercialement, est que les cocultures de neurones sont préparées avec une position cellulaire unique permettant l'analyse d'algorithmes neuronaux individuels.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences. Par exemple, quelle est le mécanisme sous-jacent à la propagation des agrégats hyperphospho-relatés aux protéines Tau dans la maladie d'Alzheimer, ou comment un agent infectieux se propage-t-il dans tout le cerveau ? La technique est particulièrement adaptée aux applications à haut débit, car seulement quelques centaines de neurones sont nécessaires pour chaque condition expérimentale.Commencez la procédure en mélangeant soigneusement le prépolymère de PDMS avec l'agent de réticulation dans un rapport de 10 à 1. Ensuite, dégazez le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant environ 20 minutes. Puis, placez la plaquette en silicium SU-8 à deux couches sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius et alignez les cadres polymères avec chaque dispositif sur la plaquette.Verser le PDMS dans le cadre et laisser une heure pour garantir une réticulation thermique complète. Une fois réticulé, retirer la plaquette de la plaque chauffante et la laisser refroidir sur une surface plane. Ensuite, tout en portant des lunettes de protection, utiliser un scalpel rigide pour décoller délicatement le cadre et le PDMS de la plaquette à partir d'un coin.Retirez le moule en PDMS du cadre et utilisez une paire de ciseaux pour découper l'appareil. Appliquez le PDMS restant sur toute la plaquette afin de la protéger pendant le stockage. Lors du retrait de cette couche de PDMS de la plaquette, toutes les particules contaminantes sont éliminées de la surface, la préparant ainsi à un nouveau moulage en PDMS.Préparez maintenant les six ports d'interface à l'aide d'un poinçon de biopsie de trois millimètres, en orientant les structures micro-usinées vers le haut afin de faciliter l'alignement des ports avec les canaux microfluidiques. Inspectez le dispositif à la recherche de particules et retirez-les à l’aide d’un ruban adhésif réversible. Ensuite, préparez une fine couche de PDMS montée sur une lame de verre en versant une petite quantité du mélange durcisseur de PDMS dans la boîte de Pétri.Appuyez une lame couvre-objet sur la couche de PDMS. Placez-la sur la plaque chauffante et polymérisez-la thermiquement pendant environ 10 minutes. Peu après le refroidissement et en portant des lunettes de protection, utilisez un scalpel pour décoller délicatement la lame couvre-objet.PDMS bicouche depuis la boîte de Pétri pour encapsuler le dispositif. Une bonne liaison P-D-M-S-P-D-M-S est nécessaire. Placer le bicouche de PDMS et le dispositif microfluidique dans le four à plasma pendant 40 secondes.Une fois le traitement au plasma effectué, appuyez fermement les deux parties l'une contre l'autre et laissez-les adhérer complètement. Peu de temps après le collage au plasma, introduisez à l’aide d’une pipette 0,5 microlitre de polylysine dans l’orifice inférieur central. Tout le circuit microfluidique doit être rempli par action capillaire en quelques secondes. Laissez ensuite reposer pendant quelques minutes afin que la polylysine recouvre complètement les surfaces hydrophiles de PDMS.Ensuite, éliminez le polylysine non lié par un lavage par aspiration. Utilisez un raccord en croix pour connecter la pompe aux trois orifices supérieurs à l’aide de tubulures de même longueur et démarrez l’aspiration. Ajoutez du PBS aux trois orifices inférieurs et effectuez un lavage pendant une minute. Par la suite, déconnectez les tubulures et retirez tout le PBS restant des orifices.Transférez l'appareil sous un microscope et chauffez à l'aide de l'illumination afin d'augmenter l'évaporation depuis les orifices pour une formation rapide du masque d'eau. Examinez l'appareil au microscope pour vous assurer que le masquage par l'eau est complet. Ensuite, insérez des broches en acier inoxydable dans les orifices afin de coupler le plasma généré par un générateur de décharge coronale portatif aux canaux microfluidiques vides.Dirigez la pointe de la source de plasma près de l'extrémité d'une broche et du plasma. Traitez le microcanal pendant une seconde. Ensuite, retirez les broches et reliez les trois ports supérieurs à la pompe.Commencez l'aspiration et délivrez du PBS dans les trois orifices inférieurs. Afin de faire circuler le PBS à travers le circuit microfluidique. Éliminez tout le PBS du circuit microfluidique et laissez toute la nuit pour permettre l'achèvement du façonnage du biomatériau.Ici, le motif est visualisé à l'aide de polylysine marquée avec la fluorescéine. Dans cette procédure, amorcez le dispositif avec le milieu approprié en ajoutant 20 microlitres à chacun des trois orifices inférieurs. Ensuite, utilisez une aspiration parallèle à partir des trois orifices supérieurs pour remplir rapidement le circuit microfluidique avec le milieu.Ajoutez 20 microlitres d'une suspension de cellules désagrégées dans chacun des orifices inférieurs latéraux. Utilisez une seringue pour aspirer doucement par les trois orifices supérieurs. La migration complète des neurones vers l'organoïde prend généralement une minute.Ensuite, à l’aide d’une pipette, récoltez les neurones excédentaires restants dans les orifices pour former un anneau sur des dispositifs microfluidiques ultérieurs. Cet exemple montre comment les neurones sont disposés avec une précision au niveau de la cellule unique. Après cela, immergez le dispositif dans le milieu et placez-le dans l’incubateur afin que les cellules adhèrent complètement au motif de biomatériau en quelques heures.Comme pour les cultures normales, le milieu doit être renouvelé périodiquement afin de traiter de façon sélective soit le compartiment de culture neuronale, soit le compartiment central de bourgeonnement nerveux. Ajoutez 20 microlitres de la substance testée dans le port inférieur, relié au canal d'intérêt, et aspirez depuis le port situé directement au-dessus. Dans cet exemple, un traitement sélectif a été appliqué au compartiment central, et dans cet exemple, le compartiment latéral a été traité.Les traitements ont été établis en une minute et maintenus pendant 60 minutes. Les cocultures de neurones peuvent ensuite être surveillées afin de mesurer la propagation de matériaux ou de pathologies. Une fois maîtrisée, de nombreuses dispositifs microfluidiques peuvent être préparés en une seule matinée.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de préparer des cultures neuronales minimalistes dans vos propres laboratoires et de les utiliser pour étudier les mécanismes sous-jacents à la propagation de matériaux et de maladies dans le cerveau.

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