Name: Lutilisation de loropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer lhôte une réaction immunitaire chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Découvrez l'administration oropharyngée intratrachéale de LPS et le lavage bronchoalvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire chez la souris. Cette méthode simple permet une analyse précise des profils de cytokines et des changements histopathologiques pulmonaires.

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Les auteurs remercient le Collège régional VA-MD de la médecine vétérinaire pour fournir de base et de soutien technique pour ce projet. Ce travail est soutenu par un Career Development Award NIH (K01DK092355).

Toutes les études ont été menées sous l&#39;approbation du Comité des soins et institutionnel (IACUC) pour Virginia Tech et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Une. Intratrachéale (it) inoculation de LPS aide de l&#39;Administration de l&#39;oropharynx <ol><li> Assurez-vous que chaque animal est identifié en utilisant soit un coup de poing de l&#39;oreille, une étiquette d&#39;oreille, ou toute autre méthode approuvée institutionnellement. </li><li> Noter le poids corporel de base et la température du corps de chaque animal. </li><li> Préparer le stock de travail de LPS. Chaque souris reçoit une dose de 50 pi de 1 mg / kg de LPS dans 1 x tampon phosphate salin (PBS). Animaux traités Mock recevront une dose de 50 pi de PBS 1x. </li><li> Préparer une chambre chargée de l&#39;administration de l&#39;isoflurane en utilisant la méthode de la goutte suivante. Les directives institutionnelles varient en ce qui concerne l&#39;utilisation de l&#39;isoflurane et d&#39;autres agents anesthésiques et avant Initiattion des études, les personnes doivent communiquer avec le Service de protection des animaux / Bien-être de leur institution pour assurer les toutes les directives sont satisfaits. Si la méthode de chute isoflurane n&#39;est pas une option, d&#39;autres agents anesthésiques sont des alternatives acceptables. <ol><li> Dans une armoire de sécurité approprié, appliquer environ 3 ml d&#39;isoflurane à une serviette de papier absorbant plié et le placer dans le fond d&#39;un bécher de 500 ml. </li><li> Placer un petit morceau de papier d&#39;aluminium sur le dessus de la serviette en papier et couvrir le bol avec un couvercle transparent. </li></ol></li><li> Préparer les outils et les réactifs qui seront utilisés au cours de l&#39;inoculation il. Placez la bande de caoutchouc afin de garantir les animaux se dirigent sur le stand de l&#39;intubation. Cette procédure nécessite une paire de pinces droites, une paire de pinces inclinées ou courbes, et une pipette P200 avec des conseils. </li><li> Charge 50 pi de LPS dans la pointe de la pipette et le placer dans un endroit facilement accessible à côté du stand de l&#39;intubation. </li><li> Anesthésier la sourisen plaçant l&#39;animal dans la chambre de l&#39;isoflurane et recouvrant la chambre avec le couvercle transparent. Respecter les modes de respiration de l&#39;animal, qui sera rapide et superficielle lors de la première placée dans la chambre. L&#39;animal sera suffisamment anesthésiée quand les taux de respiration s&#39;approchent 1 souffle / 2 sec, qui est généralement atteint en 30 secondes à placer dans la chambre. La souris doit être anesthésié comme indiqué dans le protocole approuvé pour les animaux en utilisant la méthode de chute de l&#39;isoflurane. </li><li> Retirez la souris anesthésiée de la chambre et de suspendre l&#39;animal sur l&#39;intubation tenir ses incisives. S&#39;assurer que l&#39;animal est bien retenu et la bouche et la langue sont accessibles. </li><li> Garantir doucement la langue avec la pince droite. Saisir la languette avec la pince à angles et tirez-le doucement hors de la bouche jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère résistance se fait sentir. Cette action est suffisante pour bloquer l&#39;épiglotte et avoir accès à la trachée. </li><li> Tout en continuant à tenir la langue dans laposition étendue, administrer la dose de 50 ul de LPS dans le fond de la gorge et couvrir immédiatement les narines de l&#39;animal avec un doigt ganté. Le LPS sera visible à l&#39;arrière de la gorge jusqu&#39;à ce que la souris inhale. </li><li> Continuez à couvrir les narines et maintenez la langue étendu pendant 5-10 respirations supplémentaires. </li><li> Débranchez la souris de la position de l&#39;intubation et placez le dos de l&#39;animal dans une nouvelle cage jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie. </li><li> Surveillance de marqueurs de substitution associées à la progression de la maladie. Le poids corporel et la température du corps doivent être surveillés tous les 4-8 heures pour la durée de l&#39;étude. De même, évaluer les caractéristiques de comportement et de symptômes cliniques associés à une morbidité accrue. </li><li> Pour évaluer la progression de la maladie, les souris de récolte aux points de contrôle spécifiques suite à l&#39;exposition au LPS. Points de temps typiques de récolte après une exposition LPS comprennent 0, 6, 12, 18, 24, et 48 h. Pour évaluer le rétablissement et la survie, évaluer la souris pour 7 days après l&#39;inoculation. </li></ol> 2. Sérum et lavage broncho-alvéolaire fluide (LBA) Collection <ol><li> Sacrifier la souris en utilisant une méthode approuvée institutionnellement. </li><li> Placez l&#39;animal sur son dos et le fixer à un bord de l&#39;autopsie, idéalement 0,5 à (1,27 cm) de hauteur. </li><li> Mouillez l&#39;ensemble souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 27 G, procéder à une ponction cardiaque avant de faire des incisions. Il devrait être possible de retirer 500 à 800 pi de sang total à partir d&#39;une seule souris. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la seringue et transférer le sang total à un tube de 1,5 ml microtubes préalablement marqué. Pour la collecte de sérum, le sang total permet de coaguler pendant au moins 30 min à température ambiante. En plus de la collecte de sérum, ce procédé peut également être modifié par incorporation d&#39;un anti-coagulant dans le tube et d&#39;une seringue, avant de recueillir le sang entier, pour étudier les cellules immunitaires circulantes. </li><li> Faire une incision horizontale untraverser la longueur de la cavité péritonéale, et une incision verticale de la cavité peritoneale à la mâchoire inférieure de la souris. </li><li> En utilisant une pince, saisir des deux côtés de l&#39;incision et tirez doucement la peau à l&#39;écart des cavités péritonéale et thoraciques sous-jacents. </li><li> Faire une incision le long de la grande longueur de la cavité péritonéale des organes génitaux du sternum, en prenant soin d&#39;éviter de couper le diaphragme. Déplacer doucement l&#39;intestin dans la cavité péritonéale pour permettre l&#39;accès à l&#39;un des reins. </li><li> Couper la veine rénale conduisant à la rein à servir de point de perfusion de drainage. </li><li> Nick le diaphragme à l&#39;aide de ciseaux, en prenant soin d&#39;éviter les poumons et le cœur, pour exposer le côté gauche du cœur. </li><li> Perfuse manuellement le coeur à l&#39;aide d&#39;une seringue de 10 ml avec une aiguille de 27 G et une solution 1 x PBS. Éviter d&#39;appliquer une force excessive lors de la perfusion afin de s&#39;assurer que la solution saline n&#39;est pas forcé dans les poumons. Le sang restant devrait s&#39;écouler de l&#39;incision de la veine porte.</li><li> Découpez soigneusement la cage thoracique le long du sternum avec des ciseaux émoussés / émoussés, en prenant soin d&#39;éviter de couper le cœur et les poumons. Couper accidentellement les poumons au cours de cette procédure permettra de réduire considérablement la quantité de BALF recueillies et se traduira par une incapacité à gonfler correctement les poumons avec fixateur. </li><li> Isoler doucement le cœur et les poumons à l&#39;extérieur de la cage thoracique à l&#39;aide de pinces. Découpez soigneusement chaque section de la cage thoracique à l&#39;aide contondants / émoussé ciseaux à proximité de la colonne vertébrale que possible et complètement enlever les deux sections. </li><li> Séparez les glandes salivaires à l&#39;aide de forceps ou de les supprimer en utilisant des ciseaux, pour exposer la trachée. </li><li> Découpez soigneusement les muscles qui recouvrent la trachée avec des ciseaux. Il est essentiel que la trachée pas être coupé pendant ce processus. </li><li> Avec des ciseaux, séparer la clavicule recouvrant la trachée. </li><li> Saisir doucement le thymus aide d&#39;une pince et soulever le tissu du coeur. Retirez le thymus l&#39;aide de ciseaux, tout en veillant àéviter de couper le cœur ou les poumons. </li><li> Faire une petite incision horizontale dans la trachée 1-2 anneaux au-dessous du larynx à l&#39;aide des ciseaux inclinés (45-90 º d&#39;angle de, pointus / pointus). L&#39;incision doit être suffisamment grande pour fixer solidement la canule. </li><li> Insérer la canule, de sorte que l&#39;extrémité effilée s&#39;étend anneaux trachéaux 3.2 ci-dessous de l&#39;incision et de fixer la canule en place à l&#39;aide d&#39;une suture de soie. Assurez-vous que le fil de suture passe entre la trachée et l&#39;œsophage et il est tendu sur la canule. </li><li> Remplir une seringue de 1 ml avec 1 ml de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS) et introduire délicatement sa luer dans la canule. </li><li> En utilisant un mouvement lent, mais constant, injecter ~ 900 pi dans la trachée, ce qui gonfle les poumons, et de retirer immédiatement le HBSS. Placer le BALF récupéré dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Répétez cette lavage 2 fois supplémentaires pour recueillir environ 3 ml de BALF pour une analyse future. Rangez le BALF sur la glace ou à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol><ol><li> Insérer une seringue de 10 ml dans la position de gonflage du poumon. Assembler les tubes à la luer, le luer sur le robinet et le robinet de la seringue. S&#39;assurer que le robinet est en position fermée. La seringue de 10 ml servira de réservoir d&#39;écoulement par gravité. Le réservoir doit être fixé à l&#39;inflation 4,75 distingue en dessus de l&#39;animal et de la partie supérieure du réservoir doit s&#39;étendre au-dessus de 10,5 dans l&#39;animal. </li><li> Remplir la seringue avec neutre solution de formol tamponné. S&#39;assurer que la seringue est complètement remplie avec le fixateur. </li><li> Placer une serviette absorbante sous l&#39;extrémité ouverte du tube et d&#39;ouvrir le robinet d&#39;arrêt pour permettre le fixateur pour remplir le tube. Une fois le fixateur commence coule du tuyau, fermer immédiatement le robinet et remplir la seringue vers le haut avec un fixateur. Il est important que la seringue soit complètement rempli de fournir la quantité appropriée de la pression de gonflage du poumon. </li><li&gt; Passer doucement un second morceau de fil de suture sous la trachée, environ 1-2 anneaux trachéaux dessous de l&#39;extrémité de la canule. </li><li> Faire un nœud simple en vrac dans la suture; cependant, ne tirez pas sur le noeud serré. </li><li> Insérez le tube de l&#39;inflation de la souris se dans la canule. </li><li> Ouvrir le robinet et laisser les poumons se remplissent par gravité inflation. </li><li> Une fois que les poumons atteignent leur niveau de gonflage maximale, tirez le fil de suture serré et attacher un deuxième noeud. </li><li> Fermer le robinet et retirez le tube de la canule. </li><li> Retirer délicatement la canule de la trachée en saisissant le fil de suture avec une paire de pinces et en maintenant la canule avec les doigts. Tirez fermement le fil de suture vers le bas vers la cavité thoracique et la canule de retour vers le nez de la souris. </li><li> Saisir doucement la trachée ou les sutures avec une pince et soulever la trachée loin de la cavité du cou. </li><li> Couper la caudale de la trachée à la suture attaché avec des ciseaux émoussés. </li><li> Une fois que le Trachea est libre dans les tissus sous-jacents, de commencer à tirer sur la trachée à une distance à partir de la souris. Soulevez doucement les poumons de la cavité thoracique. </li><li> Découpez soigneusement le tissu conjonctif tenant les poumons dans la cavité thoracique. Continuer à tirer la trachée à distance du corps de la souris et appliquer une force constante à la hausse tout en réduisant les connexions sous-jacentes. Prenez soin de ne pas couper les poumons. Notez que le coeur doit être laissé attaché aux poumons en utilisant cette méthode. </li><li> Une fois que les poumons ont été retirés, placez-les dans 10 ml de formol tamponné. </li><li> Supprimer une section de la queue de la souris pour le génotypage. </li><li> Disposer de la carcasse de la souris suivant les directives institutionnelles appropriées. </li></ol> 4. Évaluation de cytokines <ol><li> Centrifuger le sang total, recueillis à l&#39;étape 2.5, à 12 000 g pendant 5 min à isoler le sérum. Transférer le sérum dans un tube de 1,5 ml microtubes pré-marqués et conserver à -80 ° C. </li><li> Évaluer la serum niveaux de cytokines par ELISA ou un autre test similaire. Diluer le sérum 01 heures 05-à-01:20 dans un tampon de dilution approprié, en fonction du dosage, suivant les instructions du fabricant. Ces dilutions doivent être déterminés de façon empirique avant l&#39;exécution de la masse des échantillons. </li><li> En raison du faible volume de sérum recueilli, de réduire le volume de l&#39;échantillon chargé sur la plaque ELISA de moitié. Par exemple, la plupart des tests ELISA commerciaux utilisent des volumes de 100 pi de normes et des échantillons. Pour conserver les échantillons, charge 50 pi de normes et de sérum dilué par puits. </li><li> Centrifugeuse la BALF dans une centrifugeuse de table réfrigérée à 200 g pendant 5 min. Transférer le surnageant acellulaire en deux préalablement marqué de 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li><li> Évaluer cytokines BALF par ELISA ou un autre test similaire sans diluer. </li><li> Magasin sérum utilisé et BALF à -80 ° C. </li></ol> 5. Différentiel coloration et BAL évaluation Cellularity <ol><li> Suite à la centrifugation et BALF élimination complète du HBSS, lyser les globules rouges en culot à l&#39;aide de la solution saline hypotonique. Remettre en suspension les cellules dans 900 ul d&#39;eau distillée. Immédiatement ajouter 100 ul de PBS 10x. </li><li> Lyser individuellement chaque échantillon. Si les échantillons contiennent une quantité excessive de cellules rouges du sang, les cellules peuvent être rassemblées en un culot dans la centrifugeuse de paillasse à 400 xg pendant 5 min et le sang protocole de lyse des globules rouges peut être répété. </li><li> Déterminer la cellularité totale de BALF dans la suspension de 1 ml en utilisant un hématimètre à 10X ou 20 X grossissement avec coloration au bleu Trypan. Évaluer et présenter ces données comme cellules / ml. </li><li> Préparer le matériel pour la cytospin et coloration différentielle. Étiqueter les lames de microscope standard à l&#39;aide d&#39;un crayon ou stylo solvant résistant. Fixer les lames dans une tranche d&#39;cytospin et entonnoir. Fixez l&#39;ensemble de diapositives dans le rotor de cytospin. </li><li> Cytospin 150 ul de BALF à 100 xg pendant 5 min. Si la densité cellulaire est trop grand pour effectivementévaluer la morphologie des cellules, de réduire le volume filé vers le bas sur les diapositives. Laisser les lames à l&#39;air sécher pendant la nuit. </li><li> Différentiel colorer les lames suivant les protocoles fabrique. Laisser les lames à l&#39;air sécher pendant la nuit. Les lames couvre-objet en utilisant du Permount et évaluer les lames à l&#39;aide d&#39;un microscope équipé d&#39;un objectif 20X et 40X. </li><li> Récolter les cellules restantes pour une analyse ultérieure, telles que FACS, microscopie électronique, microscopie confocale, l&#39;extraction de l&#39;ARN pour l&#39;évaluation de l&#39;expression des gènes, et / ou l&#39;extraction des protéines de transfert de western. </li></ol> 6. évaluation histopathologique <ol><li> Préparer les poumons pour l&#39;évaluation histopathologique. Après 24-48 heures de la fixation au formol, orienter le ventre les poumons entiers gonflés et inclus en paraffine. Couper les blocs qui en résultent pour exposer le principal conducteur voies respiratoires. </li><li> Pour améliorer la précision de pointage, positionner les poumons dans la même position et couper chaque bloc pour obtenir la visualisation longitudinale maximale de til intrapulmonaires principal voies respiratoires axiale. De ce point, couper 5 microns de coupes en série et la tache avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E). Des sections supplémentaires peuvent être découpés et préparés pour l&#39;hybridation in situ en utilisant des protocoles standards. </li><li> Évaluer l&#39;histopathologie l&#39;aide d&#39;un système de notation semi-quantitative basée sur les paramètres inflammatoires suivantes, qui sont notés entre 0 (absent) et 3 (sévère): mononucléaires et polynucléaires infiltration de cellules; des voies respiratoires hyperplasie des cellules épithéliales et des blessures; extravasation; périvasculaire et menottes peribroncheolar; et le pour cent du poumon associé à une inflammation. Poumon histopathologie doit être évaluée par un pathologiste expérimenté. </li><li> Moyenne de l&#39;ensemble des scores de paramètres pour générer un score total de l&#39;histopathologie ou utiliser scores individuels de quantifier les aspects spécifiques de la progression de la maladie. Effectuer tous notation dans un mode à double insu, avec les examinateurs en aveugle à la fois le génotype et le traitement. Ce système de notation a été previously décrit 6,7,10. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes les plus critiques pour l&#39;évaluation avec succès la réponse immunitaire de l&#39;hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d&#39;évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l&#39;évaluation histopathologique. Le choix de la souche de souris est un facteur important dans l&#39;é...

Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l&#39;hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l&#39;impact de ces infections. L&#39;objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l&#39;utilisateur une méthode flexible pour évaluer l&#39;hôte réponse immunitaire innée à l&#39;infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l&#39;agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut pour les bactéries vivantes. La majorité des études antérieures évaluant l&#39;hôte réponse immunitaire innée aux bactéries ont mis l&#39;accent sur les modèles péritonéale en raison de la relative facilité d&#39;exécution. Bien que ces modèles sont très utiles et ont donné lieu à des avancées significatives dans le domaine des interactions hôte-pathogène et l&#39;inflammation systémique, les données générées à partir de ces modèles ne sont pas toujours appropriés pour les études involving le système respiratoire. Ici, un modèle d&#39;inflammation pulmonaire aiguë du poumon est proposé comme une extension pratique et cliniquement pertinente de l&#39;intra-péritonéale (ip), les modèles d&#39;injection classiques. La technique proposée permet l&#39;évaluation locale de la réponse immunitaire innée dans un système de modèle spécifique d&#39;organe. Les méthodes décrites ici sont conçues pour fournir une technique simple et robuste pour permettre aux utilisateurs d&#39;évaluer la réponse immunitaire de l&#39;hôte au LPS, qui est un PAMP commun. Les méthodes sont basées sur intratrachéale (it) instillation de LPS, ce qui induit une réponse immunitaire innée robuste dans les poumons de souris et imite de nombreuses caractéristiques physiopathologiques observés chez des patients humains souffrant d&#39;infections respiratoires et de lésions pulmonaires aiguës 1. Un avantage principal de cette technique est qu&#39;elle permet à l&#39;utilisateur d&#39;évaluer la réponse immunitaire de l&#39;hôte sans les facteurs de confusion et des problèmes de sécurité liés à la réalisation des études in vivoà l&#39;aide de bactéries vivantes. De même, l&#39;administration de ce parcours oropharyngée de l&#39;exposition décrite dans ce protocole présente des avantages significatifs par rapport aux autres techniques couramment utilisées, y compris par voie intranasale (dans) l&#39;administration et la gestion de ce chirurgical. Par exemple, l&#39;administration du dosage, il permet oropharyngée relativement précise et dépôt dans les poumons, comparativement à l&#39;administration, qui souffre généralement d&#39;une augmentation de la variabilité de dépôt dans les poumons à cause de la perte d&#39;agents dans la cavité nasale, des sinus de 2-4. La voie d&#39;administration de ces cavités, il contourne et permet un accès direct à la trachée et les voies respiratoires. De même, l&#39;approche chirurgicale est une méthode d&#39;administration beaucoup plus morbide et nécessite une formation approfondie à maîtriser. Les protocoles décrits ici comprennent également une description des techniques courantes et des marqueurs de substitution utilisés pour évaluer la progression de l&#39;inflammation et se terminer par un protocole décrivant les techniques appropriées pour la préparation de la luNGS pour l&#39;évaluation de l&#39;histopathologie. Ces protocoles sont concentrés sur la réduction du nombre de souris requis pour chaque étude en maximisant les données générées à partir de chaque animal individuel. Les protocoles décrits sont très flexibles et peuvent être facilement modifiés pour évaluer une diversité PAMP de gamme et des modèles moléculaires de dommages associé (atténue). En outre, moyennant quelques modifications supplémentaires, ces protocoles peuvent également être appliqués à des études évaluant allergique des voies aériennes progression de la maladie ou des interactions hôte-pathogène avec des bactéries vivantes, des virus ou des champignons 5-10.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Balance compacte</td><td>Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre rectal pour petits animaux</td><td>Braintree Scientific</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>Sonde rectale pour rongeurs</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>Ear Punch</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide de E. coli 0111 :B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>Intratrachael Administration et gonflage pulmonaire Stand</td><td>ICAP Manufacturing</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stand d’intubation de rongeurs</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (émoussés/tranchants)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>pinces (droites)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>pinces (45&ordm ;, courbes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (émoussés/émoussés)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (200 &micro ; l Capacité)</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>BD Medical</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml</td><td>BD Medical</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 g x 0,5 po</td><td></td> Microcentrifugeuse réfrigérée BD Medical <td>305109 Fisher</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Canules trachéales de 1,2 mm avec adaptateur Luer</td><td>Appareil Harvard</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgicale tressée en soie 4-0</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>Kits de connecteur Luer à tube</td><td>Appareil Harvard</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>Kit Luer Stopcock Appareil</td><td>Harvard</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Tygon formula E-3603 Tubulure de laboratoire</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-1&beta ; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>souris IL-6 OptEIA Kit ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>souris TNF-&alpha ; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre Lunettes de protection</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>Clips d’entonnoir de cytologie</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Entonnoirs de cytologie</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Cartes filtres</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Kit de coloration rapide</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>47733150</tr><tr><td>Permount Support de montage</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de l&#39;oropharynx intratrachéal pamp administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

La réponse immunitaire de l&#39;hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d&#39;injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d&#39;interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d&#39;inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l&#39;hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d&#39;administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d&#39;utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l&#39;hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l&#39;étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l&#39;inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.

Les parois cellulaires des bactéries Gram-négatives sont constituées de LPS, ce qui est très abondant dans l&#39;environnement. L&#39;inhalation de LPS dans les populations humaines sensibles exacerbe réactivité des voies respiratoires et est capable de déclencher une response11 immunitaire robuste. LPS est également un PAMP commun utilisé dans des modèles de souris pour induire une réponse immunitaire innée robuste. Dans le protocole décrit ici, les souris ont reçu une dose de LPS il isolé de E. coli (sérotype...

La réponse immunitaire de l&#39;hôte à l&#39;infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d&#39;exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation de l'administration intratrachéale oropharyngée de LPS et du lavage bronchoalvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l'hôte chez la souris. Cela est réalisé en premier lieu par l'inoculation de la souris avec du LPS par administration oropharyngée. Dans une deuxième étape, une canule trachéale est insérée, puis le liquide de lavage bronchoalvéolaire est recueilli à travers la canule afin d'évaluer la réponse inflammatoire locale.Dans la dernière étape, les poumons sont gonflés avec du formol pour l'évaluation histopathologique. En fin de compte, le profil des cytokines de l'intestin et l'histopathologie du poumon peuvent être analysés afin d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte à l'endotoxine (LPS). Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'administration intranasale et l'administration intratrachéale chirurgicale réside dans sa relative simplicité d'exécution et sa capacité à assurer un dosage précis et un dépôt pulmonaire contrôlé.Pour administrer une injection intratrachéale, injecter d'abord le LPS. Suspendre une souris anesthésiée sur un dispositif d'intubation. Se placer près de ses incisives supérieures, en veillant à ce que l'animal soit solidement immobilisé et que la bouche et la langue soient accessibles.Fixez délicatement la langue avec une pince droite, puis saisissez la langue avec une pince angulée et tirez doucement le muscle hors de la bouche jusqu'à ce qu'une légère résistance soit ressentie tout en maintenant la langue. Dans cette position, administrez une dose de 50 microlitres de LPS à l'arrière de la gorge et couvrez immédiatement les narines de l'animal avec un doigt ganté pendant cinq à dix respirations afin de recueillir le bain après le sacrifice. Ensuite, pratiquez une incision horizontale sur toute la longueur de la cavité péritonéale et une incision verticale allant de la cavité péritonéale jusqu'à la mâchoire inférieure de la souris.Ensuite, saisissez les deux côtés de l'incision avec la pince et tirez doucement la peau loin des cavités péritonéale et thoracique sous-jacentes. Ensuite, pratiquez une large incision le long de la cavité péritonéale, depuis les organes génitaux jusqu'au sternum, en prenant soin d'éviter de couper le diaphragme. Puis déplacez délicatement les intestins à l'intérieur de la cavité péritonéale afin d'accéder à l'un des reins.Couper la veine rénale menant au rein afin de servir de point de drainage pour la perfusion. Ensuite, inciser le diaphragme avec des ciseaux, en prenant soin d'éviter les poumons et le cœur. Pour exposer le côté gauche du cœur, utiliser une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 27 afin de perfuser manuellement le cœur avec du PBS.Le sang restant doit s'écouler par l'incision de la veine porte. Ensuite, utilisez des ciseaux mousse pour couper soigneusement la cage thoracique le long du sternum, en prenant garde de ne pas endommager le cœur et les poumons.Isolez délicatement le cœur et les poumons, puis coupez soigneusement chaque section de la cage thoracique avec des ciseaux contondants aussi près que possible de la colonne vertébrale. Après avoir complètement retiré les deux parties de la cage thoracique, séparez les glandes salivaires afin d'exposer la trachée et coupez prudemment les muscles recouvrant la trachée sans endommager la trachée elle-même. Séparez ensuite la clavicule et saisissez doucement le thymus en le soulevant loin du cœur.Ensuite, retirez le thymus avec des ciseaux en prenant soin de ne pas endommager le cœur ou les poumons. Puis, utilisez des ciseaux pointus à bout incurvé pour pratiquer une petite incision horizontale, suffisamment grande pour fixer fermement une canule dans la trachée, à un ou deux anneaux sous le larynx. Insérez ensuite une canule de manière à ce que son extrémité effilée dépasse de deux à trois anneaux trachéaux.En dessous de l'incision, passer un point de suture en soie entre la trachée et l'œsophage, puis tendre fermement le fil autour de la canule pour la fixer. Ensuite, remplir une seringue d'un millilitre avec du HBSS et insérer doucement l'embase de la seringue dans la canule à l'aide d'un mouvement lent mais constant. Puis injecter environ 900 microlitres de HBSS dans la trachée afin de gonfler les poumons, puis immédiatement réaspirer le HBSS et transférer la lavage récupéré dans un tube conique de 15 millilitres.Après avoir répété la lavage deux fois supplémentaires afin de recueillir environ trois millilitres de valve, conserver la valve sur de la glace pour disséquer les poumons. Pour l'analyse histopathologique, insérer une seringue de 10 millilitres dans un support d'insufflation pulmonaire et raccorder le tube à l'embout, l'embout au robinet à trois voies et le robinet à trois voies à la seringue. Vérifier que le robinet à trois voies est en position fermée, puis remplir la seringue avec une solution de formol tamponnée neutre. Lorsque la seringue est complètement remplie de fixateur, placer une serviette absorbante sous l'extrémité ouverte du tube et ouvrir le robinet à trois voies pour permettre au fixateur de remplir le tube.Dès que le fixateur commence à s'écouler du tube, fermez immédiatement le robinet d'arrêt et remplissez à nouveau la seringue jusqu'en haut avec du fixateur. Passez ensuite délicatement un deuxième morceau de fil de suture sous la trachée, à environ un à deux anneaux trachéaux, en dessous de l'extrémité de la canule. Faites un seul nœud lâche avec le fil de suture, puis insérez le tube pour l'insufflation de la souris.Se tenir dans la canule. Ouvrir le robinet et laisser les poumons se remplir par une insufflation gravitationnelle. Ensuite, une fois que les poumons ont atteint leur niveau maximal d'insufflation, serrer le fil de suture et faire un deuxième nœud.Fermez le robinet et retirez le tube de la canule, puis saisissez le fil de suture avec une pince. Tirez fermement le fil vers la cavité thoracique et retirez doucement la canule vers le nez de la souris afin de l'extraire. Ensuite, soulevez délicatement la trachée de la cavité du cou et utilisez des ciseaux contondants pour sectionner la trachée près du nœud de suture.Une fois la trachée dégagée des tissus sous-jacents, commencez à tirer doucement la trachée hors de la souris et soulevez délicatement les poumons de la cavité thoracique. Ensuite, coupez soigneusement le tissu conjonctif maintenant les poumons dans la cavité thoracique en exerçant une force ascendante régulière, tout en continuant à tirer la trachée hors du corps de la souris, en prenant soin de ne pas sectionner les poumons. Enfin, fixez les poumons dans 10 millilitres de formol tamponné.Dans les modèles d'exposition au LPS, la température corporelle et le poids corporel, qui sont nos marqueurs indirects typiques de la morbidité animale et de la progression de la maladie, subissent des modifications significatives après une injection de LPS : on observe une diminution marquée de la température corporelle au cours des six premières heures, comme illustré sur le graphique, suivie d'une remontée progressive vers la valeur de base sur une période de 24 heures. Le poids corporel, en revanche, diminue progressivement pendant les 24 premières heures, atteint un minimum, puis se rétablit graduellement au cours des 48 à 72 heures suivantes. Ainsi, la température corporelle constitue un marqueur plus approprié pour évaluer les premiers stades de l'initiation de l'inflammation.Alors que le poids corporel est un indicateur plus fiable lors des stades ultérieurs de la pathogenèse et de la récupération, l'exposition des voies respiratoires au LPS entraîne un afflux important de leucocytes. Dès les six premières heures, des cellules associées à la réponse immunitaire innée de l'hôte peuvent être observées dans la valve. La cellularité continue ensuite d'augmenter durant les 24 à 48 heures suivantes, période au cours de laquelle la réponse immunitaire atteint son pic, puis entre dans une phase de résolution de l'inflammation. À 24 heures, un nombre significatif de neutrophiles est présent dans les poumons et peut être observé dans la valve après coloration différentielle.Les évaluations de la cellularité valvulaire fournissent une technique robuste et quantifiable permettant de caractériser les cellules associées à la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons. Cet accroissement est compatible avec un afflux important de neutrophiles dans les voies respiratoires, les vaisseaux sanguins et le parenchyme pulmonaire. L'histopathologie pulmonaire peut être évaluée efficacement à l'aide d'un système de notation semi-quantitatif, comme on peut l'observer sur l'image.Le LPS induit une augmentation significative de l'inflammation périvasculaire, péribronchiolaire et parenchymateuse. L'administration de LPS provoque des concentrations élevées de médiateurs pro-inflammatoires locaux et systémiques, notamment plusieurs cytokines associées à la réponse immunitaire innée, comme détecté par ELISA. Parmi les cytokines courantes surexprimées dans les poumons après l'administration de LPS, on trouve le TNF, l'IL-1β et l'IL-6. Les niveaux systémiques de cytokines peuvent également être évalués dans le sérum à l'aide des mêmes techniques que celles utilisées pour les évaluations intestinales.La méthode de fixation par déplacement gravitationnel facilite des conditions optimales d'évaluation histopathologique par rapport aux poumons non insufflés ou aux poumons insufflés manuellement et fixés par gravité. L'insufflation présente des caractéristiques uniformes, permettant une quantification précise, une réduction des lésions alvéolaires, une meilleure visualisation et des évaluations de l'inflammation à plus haute résolution. L'insufflation manuelle des poumons entraîne généralement des zones d'insufflation non uniformes. Ces zones sont souvent partiellement insufflées, ce qui provoque un effondrement tissulaire fréquemment confondu avec des caractéristiques pathologiques par les examinateurs novices.Le gonflage manuel entraîne également des zones des poumons qui sont surexpandues, provoquant des espaces alvéolaires largement endommagés. Les poumons non gonflés présentent des espaces alvéolaires effondrés et des régions difficiles à distinguer et à évaluer sans une formation approfondie. De même, en raison de l'effondrement de l'organe, cette technique ne permet pas de visualiser les poumons tels qu'ils apparaissent in situ.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire et d'évaluer l'inflammation pulmonaire aiguë induite par le LPS chez la souris à l'aide d'une procédure simple d'administration oropharyngée et trachéale non chirurgicale, ainsi que de la récolte tissulaire.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Des mesures répétées de la physiologie respiratoire rongeurs et prélèvement de cellules inflammatoires des voies respiratoires sont souhaitables, mais généralement pas possible. Nous décrivons ici une méthode reproductible pour intubation par voie orale souris qui permet des mesures répétées de l'hyperréactivité des voies aériennes et prélèvement de cellules inflammatoires des voies aériennes.

Une réversible, méthode non-invasive pour les mesures de résistance des voies aériennes et d&#39;échantillonnage du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez des souris

Nous illustrons non-chirurgical de livraison du matériel de test dans les poumons des souris anesthésiées par la trachée. Cette méthode permet l'exposition des poumons à des agents pathogènes bactériens et viraux, les cytokines, des anticorps, des perles, des produits chimiques, ou des colorants. En outre, nous décrivent la récolte et la transformation des poumons et les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) pour la cytométrie de flux.

Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux

Nous avons développé une méthode simple, fiable et relativement peu coûteux pour l'intubation endotrachéale chez des souris par laryngoscopie directe en utilisant un otoscope avec un 2.0 mm spéculum. Cette technique est atraumatique et peut être utilisé pour des mesures répétées dans des expériences chroniques. Nous trouvons supérieure de trachéotomie ou précédemment rapporté des techniques non chirurgicales.

Intubation endotrachéale chez des souris<em&gt; Par</em&gt; Laryngoscopie directe en utilisant un otoscope

L'intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l'étude de la maladie respiratoire, ainsi qu'un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

Alors que l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène permet de caractériser des réponses immunitaires spécifiques, des modèles in vivo sont nécessaires pour observer les effets de réponses complexes. En utilisant l’exposition à Candida albicans suivie d’une infection pulmonaire médiée par Pseudomonas aeruginosa, nous avons établi un modèle murin des interactions microbiennes impliquées dans la pathogénicité de la pneumonie associée à la ventilation assistée.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Nous démontrons la procédure d’inoculation intra-trachéale d’Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures de souris. Il s’agit d’un outil très utile pour étudier les voies de signalisation qui régulent l’inflammation des voies respiratoires dans des modèles murins.

Administration intra-trachéale de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

Nous détaillons ici la méthodologie suivie pour comparer l’efficacité protectrice et la réponse immunitaire pulmonaire induites par l’immunisation intranasale et sous-cutanée avec le BCG dans un modèle murin. Nos résultats montrent les avantages de la vaccination pulmonaire et suggèrent un rôle de la réponse médiée par l’IL17 dans la protection induite par le vaccin.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour la modélisation de la pneumonie bactérienne chez les souris. Nous décrivons ici un peu coûteux, un procédé rapide et non invasif destiné à induire une pneumonie par aspiration ( par exemple, inhalation) , d'un inoculum bactérien pipeté dans l'oropharynx. méthodes en aval pour l'évaluation de la réponse immunitaire innée pulmonaire sont également détaillées.

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Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l&#39;infiltration cellulaire inflammatoire

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Ici, nous proposons un protocole pour l’administration intratrachéale de lipopolysaccharides (LPS) via une intubation endotrachéale oropharyngée non invasive. Cette méthode minimise le traumatisme de l’intervention chirurgicale pour l’animal et délivre avec précision le LPS à la trachée, puis aux poumons.

Instillation intratrachéale non invasive de lipopolysaccharides chez la souris

Découvrez l'administration oropharyngée intratrachéale de LPS et le lavage bronchoalvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire chez la souris. Cette méthode simple permet une analyse précise des profils de cytokines et des changements histopathologiques pulmonaires.

Lutilisation de loropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer lhôte une réaction immunitaire chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal

L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris

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