L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris

L’objectif global de cette procédure est de démontrer l’utilisation de l’administration intratrachéale oropharyngée, de l’administration de LPS et du lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l’hôte chez la souris. Ceci est accompli en inoculant d’abord la souris avec le LPS à l’aide d’une administration oropharyngée. Dans la deuxième étape, une canule trachéale est insérée dans un liquide de lavage broncho-alvéolaire, ou est ensuite recueillie à travers la canule pour évaluer la réponse inflammatoire locale.

Dans la dernière étape, les poumons sont gonflés avec du formol pour l’évaluation histopathologique. En fin de compte, le profil cytokinique de l’intestin et l’histopathologie du poumon peuvent être analysés pour évaluer la réponse immunitaire de l’hôte au LPS. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’administration intranasale et l’administration intratrachéale chirurgicale, est que cette technique est relativement simple à réaliser et permet un dosage précis et un dépôt pulmonaire

Pour l’intratrachée, injectez d’abord le LPS. Suspendre une souris anesthésiée lors d’une intubation. Tenez-vous près de ses incisives avant, en vous assurant que l’animal est solidement attaché et que la bouche et la langue sont accessibles.

Fixez doucement la langue avec une pince droite, puis saisissez la langue avec une pince inclinée et tirez doucement le muscle hors de la bouche jusqu’à ce qu’une légère résistance se fasse sentir tout en tenant la langue. Dans cette position, administrez une dose de 50 microlitres de LPS à l’arrière de la gorge et couvrez immédiatement les narines de l’animal avec un doigt ganté pendant cinq à 10 respirations pour recueillir le bain après le sacrifice. Ensuite, faites une incision horizontale sur toute la longueur de la cavité péritonéale et une incision verticale de la cavité péritonéale à la mâchoire inférieure de la souris.

Saisissez ensuite les deux côtés de l’incision à l’aide de la pince et éloignez doucement la peau des cavités péritonéale et thoracique sous-jacentes. Ensuite, faites une grande incision sur toute la longueur de la cavité péritonéale des organes génitaux au sternum, en prenant soin d’éviter de couper le diaphragme. Ensuite, déplacez doucement les intestins dans la cavité péritonéale pour permettre l’accès à l’un des reins.

Coupez la veine rénale menant au rein pour servir de point de drainage pour la perfusion. Entaillez ensuite le diaphragme avec des ciseaux, en prenant soin d’éviter les poumons et le cœur. Pour exposer le côté gauche du cœur, utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 27 pour perfuser manuellement le cœur avec du PBS.

Le sang restant doit s’écouler de l’incision de la veine porte. Ensuite, utilisez des ciseaux émoussés pour couper soigneusement la cage thoracique le long du sternum. Prendre soin d’éviter de couper le cœur et les poumons.

Isolez doucement le cœur et les poumons, puis coupez soigneusement chaque section de la cage thoracique avec les ciseaux émoussés et émoussés aussi près que possible de la colonne vertébrale. Après avoir complètement retiré les deux sections de côtes, séparez les glandes salivaires pour exposer la trachée et coupez soigneusement les muscles recouvrant la trachée sans couper la trachée elle-même. Maintenant, séparez la clavicule et saisissez doucement le thymus, en l’éloignant du cœur.

Retirez ensuite le thymus avec des ciseaux pour éviter de couper le cœur ou les poumons. Ensuite, utilisez des ciseaux pointus et tranchants pour faire une petite incision horizontale suffisamment grande pour fixer fermement une canule dans la trachée, un à deux anneaux sous le larynx. Insérez ensuite une canule de manière à ce que l’extrémité effilée prolonge deux à trois anneaux trachéaux.

Sous l’incision, passez une suture en soie entre la trachée et l’œsophage, en tirant sur la canule pour la fixer. Remplissez ensuite une seringue d’un millilitre de HBSS et insérez doucement son leurre dans la canule en utilisant un mouvement lent mais constant. Ensuite, injectez environ 900 microlitres de HBSS dans la trachée pour gonfler les poumons, puis immédiatement avec le tirage de HBSS, distribuez la valve récupérée dans un tube conique de 15 millilitres.

Après avoir répété le lavage deux fois de plus pour recueillir environ trois millilitres de valve. Pour l’analyse histopathologique, insérez une seringue de 10 millilitres dans un support de gonflage pulmonaire et fixez le tube au leurre, le leurre au robinet d’arrêt et le robinet d’arrêt à la seringue, confirmez que le robinet d’arrêt est en position fermée, puis remplissez la seringue avec une solution de formol tamponnée neutre. Lorsque la seringue est complètement remplie de fixateur, placez une serviette absorbante sous l’extrémité ouverte du tube et ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre au fixateur de remplir le tube.

Une fois que le fixateur commence à s’écouler de la tubulure, fermez immédiatement le robinet d’arrêt et remplissez la seringue jusqu’en haut avec le fixateur. Ensuite, passe doucement un deuxième morceau de fil de suture sous la trachée, environ un à deux anneaux trachéaux. Sous l’extrémité de la canule, faites un seul nœud lâche dans la suture, puis insérez le tube du gonflage de la souris.

Tenez-vous debout dans la canule. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez les poumons se remplir par gonflage par gravité. Et puis, une fois que les poumons atteignent leur niveau de gonflage maximum, tirez sur la suture et faites un deuxième nœud.

Fermez le robinet d’arrêt et retirez le tube de la canule, puis saisissez la suture avec une pince. Tirez fermement la suture vers le bas vers la cavité thoracique et tirez doucement la canule vers le nez de la souris pour retirer la canule. Ensuite, soulevez doucement la trachée pour l’éloigner de la cavité cervicale et utilisez des ciseaux émoussés pour couper le dorlotement de la trachée à la suture de marée.

Une fois que la trachée est libérée des tissus sous-jacents, commencez à l’éloigner de la souris et soulevez doucement les poumons de la cavité thoracique. Ensuite, coupez soigneusement le tissu conjonctif qui maintient les poumons dans la cavité thoracique avec une force constante vers le haut et continuez à éloigner la trachée du corps de la souris, en prenant soin de ne pas couper les poumons. Enfin, fixez les poumons dans 10 millilitres de formine tamponnée.

Dans les modèles d’exposition au LPS, à la fois de la température corporelle et du poids, nos marqueurs de substitution typiques de la morbidité animale et de la progression de la maladie, la stimulation du LPS entraînera une diminution significative de la température corporelle au cours des six premières heures, comme l’illustre le graphique, qui augmente progressivement jusqu’à la valeur de référence au cours des 24 heures. Le poids corporel, cependant, diminue régulièrement au cours des 24 heures, puis il atteint son apogée et se rétablit progressivement au cours des 48 à 72 prochaines heures. Ainsi, la température corporelle est un marqueur plus approprié pour évaluer les premiers stades de l’initiation de l’inflammation.

Alors que le poids corporel est plus fiable aux stades ultérieurs de la pathogenèse et de la récupération, l’exposition au LPS des voies respiratoires entraîne un afflux important de leucocytes. Dans les poumons, au cours des six premières heures, les cellules associées à la réponse immunitaire innée de l’hôte peuvent être observées dans la valve valvulaire. La cellularité continue ensuite d’augmenter au cours des 24 à 48 heures suivantes lorsque la réponse immunitaire atteint son apogée et entre ensuite dans une période de résolution de l’inflammation

L’évaluation de la cellularité valvulaire fournit une technique robuste et quantifiable pour caractériser les cellules associées à la réponse immunitaire de l’hôte dans les poumons. Cette augmentation est compatible avec un afflux important de neutrophiles dans les voies respiratoires, les vaisseaux sanguins et le parenchyme pulmonaire. L’histopathologie pulmonaire peut être évaluée efficacement à l’aide d’un système de notation semi-quantitatif, comme on peut l’observer sur l’image.

Le LPS induit une augmentation significative de l’inflammation périvasculaire, péribronchiolaire et parenchymateuse. L’administration de LPS induit des niveaux élevés de médiateurs pro-inflammatoires locaux et systémiques, y compris plusieurs cytokines associées à la réponse immunitaire innée détectée par Eliza Les cytokines courantes qui sont régulées à la hausse dans les poumons après l’administration de LPS comprennent le TNF, l’alpha IL un bêta et l’IL six. Les taux de cytokines systémiques peuvent également être évalués dans le sérum en utilisant les mêmes techniques que celles démontrées pour les évaluations intestinales.

La méthode de fixation par déplacement gravitaire facilite des conditions optimales d’évaluation histopathologique par rapport aux poumons non gonflés ou aux poumons à gonflage manuel fixés par gravité. L’inflation présente des caractéristiques uniformes, permettant un score précis, une réduction des dommages alvéolaires, une visualisation améliorée et une résolution plus élevée. Les évaluations de l’inflammation, le gonflage manuel des poumons entraînent généralement des zones de gonflage non uniformes. Ces zones sont souvent partiellement gonflées, ce qui entraîne un affaissement des tissus qui est souvent confondu avec des caractéristiques pathologiques par les examinateurs novices.

Le gonflage manuel entraîne également des zones des poumons qui sont surgonflées, ce qui entraîne des espaces alvéolaires gravement endommagés. Les poumons non gonflés présentent des espaces alvéolaires affaissés et des zones difficiles à résoudre et à évaluer sans une formation approfondie. De même, en raison de l’affaissement de l’organe, cette technique ne permet pas de visualiser les poumons tels qu’ils apparaissent in situ.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire et d’évaluer l’inflammation pulmonaire aiguë médiée par le LPS chez la souris à l’aide d’une procédure simple d’administration oropharyngée et trachéale non chirurgicale et d’un prélèvement de tissus.