Transcription et profilage des métabolites pour l'évaluation des arbres tabac et le peuplier comme matière première pour l'industrie de la bioéconomie

L’objectif global de cette procédure est d’établir et d’optimiser les données de séquençage des métabolites et des ARN à partir de feuilles de tabac pour des estimations orientées vers la biologie des systèmes. Pour ce faire, il faut d’abord recueillir le matériel biologique d’une série de feuilles en développement. La deuxième étape consiste à effectuer l’extraction du matériau à l’aide des solvants appropriés en fonction de l’analyse ultérieure.

Ensuite, les métabolites et les hydrocarbures sont mesurés à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse, de la spectrométrie de masse ou du GCMS et les transcrits sont analysés à l’aide de l’acquisition de données de séquençage de l’ARN. En fin de compte, la combinaison du profilage des métabolites et du profilage transcriptionnel via le séquençage de l’ARN est utilisée pour montrer comment les feuilles de tabac développent des hydrocarbures à longue chaîne et d’autres composés importants. Cette méthode peut être utilisée pour identifier et quantifier les métabolites utiles importants fabriqués dans les feuilles de l’arbre à tabac.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du métabolome du tabacier. Il peut également être utilisé pour d’autres systèmes tels que le tabac ou des espèces apparentées. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les feuilles de tabac sont difficiles à extraire de bon ARN.

Dans cette vidéo multi Bioo PRO, vous verrez les membres du groupe FERNA extraire et métaboliser leur profil. À l’aide du GCMS, vous verrez également un membre du groupe Fraser extraire des hydrocarbures et également un membre de mon propre groupe qui extraira l’ARN pour le séquençage de l’ARN Commencez par cultiver des plantes neko Oceana Glauca dans des pots de 30 centimètres de diamètre contenant M deux substrats de culture professionnels comme détaillé dans le protocole de texte pour préparer les métabolites primaires, Récoltez les feuilles et les tiges de la plante et congelez la matière, lyophilisez immédiatement les matières végétales congelées par lyophilisation pendant trois jours, puis broyez les échantillons lyophilisés par un mélangeur avec des billes métalliques, aliquote les matières sèches finement broyées résultantes dans un tube à centrifuger de deux millilitres ou un flacon en verre. Ensuite, aliquote 10 milligrammes de feuille ou 20 milligrammes de tige broyée de matière végétale sèche dans deux millilitres de bouchons à vis dans des tubes à fond rond.

Ajoutez 1,4 millilitre de méthanol à 100 % et agitez pendant 10 secondes. Ajoutez ensuite 60 microlitres d’atol de côtes comme étalon quantitatif interne avant de vortex. Pendant 10 secondes supplémentaires, ajoutez une bille en acier inoxydable et homogénéisez le matériau avec un broyeur mélangeur pendant deux minutes à 25 hertz après une centrifugation pendant 10 minutes.

À 11 000 fois la gravité, transférez le surnageant dans un flacon en verre. Ajoutez 750 microlitres de chloroforme et 1,5 millilitre d’eau avant de faire tourbillonner le mélange pendant 10 secondes. Transférez ensuite 150 microlitres de la phase supérieure dans un tube à centrifuger frais de 1,5 millilitre.

Ensuite, séchez les échantillons à l’aide d’un aspirateur rapide. Il est impératif que les échantillons soient réduits à sec pendant trois à 24 heures jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide résiduel. Une fois sec, ajoutez 40 microlitres de chlorhydrate de méthine.

Ensuite, secouez le mélange dans un agitateur à bloc de chaleur horizontal pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ajoutez 70 microlitres de mélange M-S-T-F-A avant de secouer à nouveau pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Faites tourner les gouttes sur le couvercle par une courte centrifugation avant, avant de transférer le liquide dans des flacons en verre adaptés à l’analyse GC MS.

Analyser les données à la suite du SMGC en configurant le logiciel d’analyse des données de spectrométrie de masse et en sélectionnant l’analyse des données à traiter. Préparez un tableau des pics d’intérêt détectés conformément à la classe composée. Identifier les pics par coalition de composés standard, puis annoter les pics détectés à l’aide de l’analyse par spectrométrie de masse, des algorithmes de caractérisation structurale, de l’étude de la littérature et de la recherche dans les bases de données de métabolites pour l’extraction d’hydrocarbures.

Immergez environ 200 milligrammes de feuilles de glauco ncoa fraîchement récoltées insolvables pendant deux à 20 minutes, retirez les feuilles et séchez complètement les solvants par évaporation rotative. Ensuite, mettez les échantillons en suspension dans un millilitre d’hexane de qualité HPLC. Procédez à l’analyse GCM des échantillons en utilisant les paramètres détaillés dans le protocole texte.

Traitez d’abord les composants du chromatogramme à l’aide d’un MS automatisé. Système de déconvolution et d’identification et le NIST 98 MS. Bibliothèque. Confirmer l’identification des hydrocarbures saturés d’acan à longue chaîne en comparant les temps de rétention et les modèles de fragmentation classiques à des normes authentiques connues. Ensuite, déterminez quantitativement les hydrocarbures en comparant les aires de pics intégrées avec les courbes dose-réponse.

Construit à partir de normes authentiques, calculez les moyennes et l’erreur type des moyennes à l’aide du logiciel Excel. Ce protocole combine l’extraction de l’ARN TRIOL avec un kit RN easy pour obtenir un broyage d’ARN de haute qualité de 100 milligrammes de matière végétale congelée dans des tubes à centrifuger de deux millilitres avec une bille métallique par un broyeur mélangeur. Après l’homogénéisation de l’échantillon, ajoutez un millilitre de triol après avoir centrifugé le matériau pendant 10 minutes à 12 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube de réaction. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme et retournez le tube plusieurs fois avant de l’incuber pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé le mélange pendant 15 minutes.

Comme précédemment, transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de réaction. Ajoutez environ 2,5 volumes d’éthanol. Retournez le tube plusieurs fois et incubez pendant 30 minutes à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, déplacez l’échantillon, y compris tout précipité, vers une colonne de spin. Centrifugez la colonne pendant 15 secondes à 8 000 fois la gravité et jetez le flux. Ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage RW one, qui est fourni dans le kit d’extraction, à la colonne d’essorage et à la centrifugeuse.

Encore une fois, après avoir jeté le flux, ajoutez 500 microlitres du deuxième tampon de lavage, RPE également fourni par le kit à la colonne d’essorage. Centrifugez à nouveau la colonne et éliminez le flux avant d’ajouter plus de tampon RPE et de centrifugation. Comme précédemment, placez ensuite la colonne de spin dans un nouveau tube de réaction de 1,5 millilitre et ajoutez 50 microlitres de centrifugeuse à eau libre d’ARN, la colonne pendant une minute à 8 000 fois la gravité pour éluer l’ARN.

Retirez l’ADN résiduel à l’aide d’un kit sans ADN selon les instructions du fabricant. Comme dernière étape, déterminez la qualité de l’ARN. L’ARN doit avoir un nombre d’intégrité de l’ARN supérieur à huit avant d’être envoyé pour le séquençage de la prochaine génération.

Le profil HPLC montre un résultat représentatif de l’analyse isoprénoïde des extraits de feuilles de ncoa glauca. Les différents ISOPRÉNOÏDES de C 40 et plus ont été détectés à l’aide d’un détecteur à barrettes de photodiodes. Les pics ont été annotés sur la base d’une chromatographie codée et d’une comparaison spectrale entre des étalons authentiques.

Les deux chromatogrammes MS sont le résultat de l’analyse des métabolites primaires du ncoa, de la feuille de glauco et de la tige. Le spectre MS d’un pic correspondant à la sérine est également donné, à titre d’exemple, la sortie représentative du bioanalyseur utilisé pour déterminer la qualité de l’ARN est montrée. Les deux pics principaux du chromatogramme correspondent à 18 s et 25 s de ribosomal, l’ARN indiquant la présence d’ARN intact dans cet échantillon.

Des pics supplémentaires d’ARN ribosomique fragmenté apparaîtraient en cas d’ARN partiellement ou fortement dégradé Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée rapidement et elle est compatible avec l’analyse d’autres métabolites suite à cette procédure. D’autres méthodes telles que la PCR en temps réel ou d’autres méthodes d’analyse de l’ARN peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la production de petits ARN ou l’expression de gènes spécifiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’extraire et d’évaluer les données sur les métabolites de l’arbre à tabac.