Name: Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Apprenez à mesurer simultanément le pH vésiculaire et cytosolique dans les cellules vivantes par microscopie confocale. Cette méthode utilise les sondes HPTS et SNF F1 pour étudier la dynamique du pH intracellulaire.

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Nous remercions le Dr Gilles Dupuis pour la lecture critique du manuscrit. 
Financement
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada, subvention # MOP-126173. C.M.D est membre du Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel, financé par le Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ).

1. Préparation des solutions pour cellulaire pH Calibration <ol><li> Ajouter les composés suivants à cinq tubes de 50 ml coniques distincts 5 pour préparer des solutions à utiliser pour l&#39;étalonnage: <ul><li> De NaCl (1 ml de NaCl 1 M) (1 M NaCl = 0,58 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> Glucose (1 ml de 1 M de D-glucose) (1M D-Glucose = 1,80 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml d&#39;HEPES 1M) (1 M HEPES = 2,38 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> CaCl 2 (0,05 ml de CaCl2 1 M) (1 M CaCl2 = 1,47 g dans 10 ml H 2 0) Préparer toutes les solutions double distillée H 2 O (le trou DDH 2 O). </li></ul></li><li> Remplissez chaque solution avec 35 ml de ddH 2 O et mélanger avec un agitateur magnétique jusqu&#39;à sortelution est atteint. </li><li> Ajuster le pH de chaque solution de KOH 1 N ou HCl 1 N pour obtenir des valeurs de pH de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 et 7,5. Ensuite, régler le volume avec de l&#39;eau déminéralisée à un volume final de 50 ml. </li><li> Mesure 5 mg de nigéricine et l&#39;ajouter à 670 pi d&#39;EtOH absolu pour préparer un 10 mM nigéricine solution stock. Attention: nigéricine est très toxique et doit être manipulé avec grand soin (gants, lunettes de protection et masque). Mélanger la solution par inversion jusqu&#39;à la nigéricine est complètement dissous. </li><li> Ajouter 0,05 ml de 10 mM de nigéricine (concentration finale de 10 pM) à chaque solution d&#39;étalonnage. Nigéricine est un ionophore qui augmente la perméabilité de la membrane cellulaire et provoque l&#39;équilibration du pH intracellulaire et extracellulaire en présence d&#39;une concentration de dépolarisation de K + extracellulaire. </li><li> Les solutions d&#39;étalonnage peuvent être stockés jusqu&#39;à 1 mois à 4 ° C </li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> En vertu d&#39;un Safet biologiquey capot, des cellules de semences en 35 mm x boîtes de culture de 10 mm dans 2 ml de milieu de croissance supplémenté par 10% de sérum et d&#39;antibiotiques de veau fœtal. Utiliser la quantité de cellules nécessaire pour assurer environ 50% de confluence après 24 h. NOTE: Dans nos expériences, nous utilisons la lignée cellulaire HT-1080 et la plaque 1 x 10 5 cellules par boîte de culture. </li><li> Déterminer le nombre de boîtes de culture nécessaires pour l&#39;expérience et la plaque 5 boîtes de culture supplémentaires qui seront utilisés pour l&#39;étalonnage. </li><li> Plats place de la culture dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 24 heures. </li></ol> 3. Préparation des sondes de détection de pH <ol><li> Préparer une solution stock de 1M de la sonde de pH fluorescent 8 hydroxypyrène-1, 3,6 trisulfonique, sel trisodique (HHP / pyranine) dans le trou DDH 2 0. Cette solution doit être conservé à température ambiante et protégé de la lumière. </li><li> Préparer une solution stock de 1 mM 5 - (et 6)-carboxy seminaphthorhodafluor acétoxyméthylique ester acétate (C-SNARF-une heures; appelé Thereafter SNARF-1) en dissolvant 1 mg de SNARF-1 dans 1,76 ml de DMSO. Bien mélanger par pipetage répété. SNARF-1 solution doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière. </li></ol> 4. Portable étiquetage <ol><li> Seize heures avant imagerie des cellules vivantes, ajouter 2 pi de 1M HPTS solution stock (concentration finale 1 mM) à chaque boîte de culture contenant 2 ml de milieu complet. </li><li> Retour des boîtes de culture à l&#39;incubateur. La sonde est HPTS cellulaire imperméant, donc étiquette organites la sonde doit être prise par pinocytose. Cette condition exige que les incubations de cellules avec HPTS sont effectuées dans un milieu de culture additionné de sérum. </li><li> Après incubation avec HPTS, laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu exempt de sérum pendant au moins 2 heures. L&#39;incubation avec SNARF-1 doit être effectuée dans un milieu sans sérum, car le sérum peut empêcher l&#39;absorption de la sonde. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;une SNARF-1 solution 1 mM pour obtenir afconcentration inal de 5 uM et permettent aux cellules incuber pendant 20 min à 37 ° C, sous une lumière faible. C-SNARF-1 et de concentration temps d&#39;incubation peuvent varier en fonction du type de cellule. </li><li> A la fin de l&#39;incubation, laver les cellules deux fois dans du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu sans sérum. </li></ol> 5. Ajout de pH modulateurs <ol><li> Pour évaluer si la méthode peut détecter des changements de pH dans les cellules, les différents réactifs qui modulent le pH intracellulaire peuvent être utilisés: <ul><li> Bafilomycine A1, un inhibiteur spécifique de la V-ATPase 5 </li><li> Na + / H + échangeur isoforme 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH 4 Cl, une base faible qui augmente le pH intracellulaire 7 </li></ul><ol><li> Préparer des solutions de des réactifs mentionnés ci-dessus: <ul><li> Bafilomycine A1: ajouter 10 pg de bafilomycine A1 160 ul de DMSO pour obtenir une solution stock de 100 um </li><li> IEAP: ajouter 25 mg de l&#39;IEAP à 1,67 ml de méthanol à obtena concentration finale de 50 mM </li><li> NH 4 Cl: dissoudre 0,53 g de chlorure d&#39;ammonium dans 10 ml de trou DDH 2 O pour obtenir une concentration finale de 1 mM. </li></ul> Remarque: Toutes les solutions mères doivent être conservés à 4 ° C sauf pour bafilomycine A1 qui doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière. </li><li> Dans des cultures distinctes, ajouter l&#39;un des réactifs tels que décrits ci-dessous: <ul><li> 2 pl de 100 uM bafilomycine A1 (concentration finale de 100 nM) </li><li> 1 pl de l&#39;IEAP 50 mM (concentration finale de 25 uM) </li><li> 40 pl de 1 M de NH 4 Cl (concentration finale 20 mM) </li></ul></li><li> Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C. </li></ol></li><li> Procéder à l&#39;acquisition de l&#39;image. </li></ol> 6. Spécifications du microscope d&#39;imagerie des cellules vivantes et des paramètres d&#39;acquisition <ol><li> Effectuer imagerie des cellules vivantes en utilisant un objectif 40x monté sur un balayage inversé microsco confocale spectralepe équipé d&#39;une platine XY motorisée, une chambre pouvant accueillir des plats de verre de la culture de fond dans un (température, humidité, CO 2) incubateur à environnement contrôlé de phase. </li><li> L&#39;instrument confocal (Olympus FV1000) utilisé ici est équipé de: <ul><li> Un laser à diode de 405 nm </li><li> A 40 mW laser argon (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Un laser hélium néon (543 nm) </li><li> Objectif fluorite 10X, NA0.4 </li><li> Un objectif LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Un objectif de l&#39;huile PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4 </li><li> Un miroir dichroïque DM 405/458/488/543 </li><li> Un SDM 560 et un SDM 640 filtres dichroïques </li><li> Un filtre de barrière BA655-755 </li><li> Un BS20/80 de diviseur de faisceau </li><li> logiciel d&#39;analyse de données pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse d&#39;images, </li></ul></li><li> Une fois l&#39;incubateur d&#39;étape a réchauffé à 37 ° C et le microscope est mis en place, placer une boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1 dans la chambre d&#39;imagerie confocale stade. </li><li> Après avoir localiser une zone d&#39;intérêt, régler les paramètres d&#39;acquisition de logiciels Figure 1. <ul><li> Mettre en place deux ensembles de canaux virtuels. </li><li> Initier la première phase qui correspond à HPTS excitation à 405 nm et la collecte d&#39;émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d&#39;émission à 570-600 nm. </li><li> Lancer la deuxième phase qui correspond à HPTS excitation à 458 nm et la collecte d&#39;émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d&#39;émission à 640-650 nm. </li><li> L&#39;ouverture confocale est fixé à 175 um par défaut et l&#39;ouverture optimale doit être réglé manuellement à 300 um. </li><li> Prenez l&#39;image par l&#39;empilement des sections optiques horizontales série (800 x 800 pixels) de 0,4 um d&#39;épaisseur. </li></ul></li></ol> NOTE: Un objectif 40X est utile d&#39;observer plusieurs cellules simultanément et fonctionne bien pour organite visualisation. Cependant, la résolution spatiale et de l&#39;intensité du signal sont better obtenue en utilisant un objectif 60x huile. En outre, il n&#39;y a pas d&#39;excitation ou d&#39;émission de la diaphonie entre les deux colorants. 7. Étalonnage de sondes pH-détection <ol><li> Avant l&#39;étalonnage, éliminer le milieu de la boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1, laver deux fois avec du PBS stérile, puis ajouter 2 ml d&#39;une des solutions d&#39;étalonnage cinq. </li><li> Placez la boîte de culture dans la chambre de stade confocale. </li><li> Procéder à une acquisition d&#39;image temps-lapse selon les paramètres suivants: <ol><li> Définissez le nombre d&#39;images et de durées d&#39;intervalle pour l&#39;expérience. NOTE: Nous utilisons généralement un intervalle de 1 min entre les images pour un maximum de 30 minutes. </li><li> Programmer le déclencheur pour fermer entre l&#39;acquisition de chaque image. </li></ol></li><li> Enregistrer l&#39;intensité de fluorescence par minute dans un logiciel de feuille de calcul et de déterminer le moment où l&#39;intensité de fluorescence est stable. PH intracellulaire est généralement stable après le 15 - 20 min. </li><li> REPEAT les étapes 7.1 à 7.4 en utilisant une nouvelle boîte de culture pour chaque solution d&#39;étalonnage restant. </li></ol> 8. D&#39;acquisition de données <ol><li> Une fois le calibrage a été fait, l&#39;acquisition de données de l&#39;échantillon 4-5 champs choisis au hasard contenant 15-20 cellules par champ. Deux images sont obtenues pour chaque domaine: l&#39;un pour l&#39;étiquetage HPTS (vésicules) et le second pour SNARF-1 étiquetage (cytosol). </li><li> Fluorescence de fond (zone extracellulaire) est numériquement soustrait des images fluorescentes de deux sondes. Vésicules marquées et cytosol de leurs images stockées respectives sont sélectionnés à l&#39;aide d&#39;un masque binaire. Pour chaque sonde pH-détection, les intensités de fluorescence sont mesurées sur une échelle numérique (0-4,095 échelle de niveaux de gris). Une intensité moyenne de tous les pixels dans le cytoplasme ou organelle est calculée et les valeurs sont utilisées pour calculer les rapports de fluorescence. </li></ol> 9. Analyse des données <ol><li> Divers logiciels sont disponibles dans le commerce pour l&#39;analyse des données. DireFluoview logiciel. </li><li> Dans une feuille de calcul, valeurs de l&#39;enregistrement et le calcul des ratios de fluorescence comme suit: Dans le cas de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) et, dans le cas de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Tracer les données en utilisant un logiciel graphique scientifique comme GraphPad Prism. La parcelle doit présenter des ratios de fluorescence (axe Y) en fonction du pH (axe X). d&#39;ajustement de courbe est réalisé en utilisant une régression non linéaire. </li><li> Recueillir les intensités de fluorescence des échantillons de la manière décrite dans l&#39;étape 8.2 et de calculer les rapports de fluorescence. Utilisation des courbes d&#39;étalonnage pour transformer en ratios des valeurs de pH. </li></ol>

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<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
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<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
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</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Mesure du pH quantitative en imagerie des cellules vivantes de différents compartiments cellulaires est nécessaire de mesurer avec précision les variations de pH dans les réponses cellulaires aux défis extérieurs. Cependant, l&#39;un des principaux obstacles qui reste est de cibler facilement et précisément compartiments cellulaires. A cet égard, un certain nombre d&#39;études ont mis en évidence l&#39;utilisation de HPTS comme indicateur de pH intracellulaire introduit dans les cellules par électroporation ou micro-inj...

<table><tbody><tr><td>Solutions pour l’étalonnage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose (dextrose)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Eau déminéralisée</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Toxique par inhalation ou par contact avec la peau</td></tr><tr><td colspan="4">Tenir à l’abri de la lumière à 4 &deg ; 35mm</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>sondes</td><td></td><td></td><td></td>de détection du pH</tr><tr><td>8-Hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>Tenir à l’abri de la lumière à température ambiante</td></tr><tr><td>5-(et-6)-Carboxy SNARF&reg ;-1, Acetoxymethyl Ester, Acétate</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>Tenir à l’abri de la lumière et de l’humidité à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sufoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp ;</td><td>nocif</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Eau déminéralisée</td><td>N/A</td><td>N/A Porter</td><td>à 1 L</td></tr><tr><td>l Autoclave et ajuster le pH à 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Eau déminéralisée</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Porter à 5 L</td></tr><tr><td>les modulateurs</td><td></td><td></td><td></td>du pH</tr><tr><td>Bafilomycine A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-éthyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure simultanée du ph dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Le pH intracellulaire est étroitement régulé et des différences de pH entre le cytoplasme et les organites ont été signalées1. La régulation du pH cellulaire est cruciale pour le contrôle homéostatique des processus physiologiques qui comprennent : la synthèse des protéines, de l’ADN et de l’ARN, le trafic vésiculaire, la croissance cellulaire et la division cellulaire. Les altérations de l’homéostasie du pH cellulaire peuvent entraîner des changements fonctionnels préjudiciables et favoriser la progression de diverses maladies2. Diverses méthodes sont disponibles pour mesurer le pH intracellulaire, mais très peu d’entre elles permettent de mesurer simultanément le pH dans le cytoplasme et dans les organites. Ici, nous décrivons en détail une méthode rapide et précise pour la mesure simultanée du pH cytoplasmique et organellaire par microscopie confocale sur cellules vivantes3. Cet objectif est atteint grâce à l’utilisation de deux colorants ratiométriques sensibles au pH qui possèdent une partition sélective du compartiment cellulaire. Par exemple, SNARF-1 est compartimenté à l’intérieur du cytoplasme tandis que HPTS est compartimenté à l’intérieur des organites endosomaux/lysosomaux. Bien que le HPTS soit couramment utilisé comme indicateur de pH cytoplasmique, ce colorant peut marquer spécifiquement les vésicules le long de la voie endosomale-lysosomale après avoir été absorbées par la pinocytose3,4. À l’aide de ces sondes de détection du pH, il est possible de mesurer simultanément le pH dans les compartiments endocytaires et cytoplasmiques. La longueur d’onde d’excitation optimale du HPTS varie en fonction du pH tandis que pour le SNARF-1, c’est la longueur d’onde d’émission optimale qui varie. Après le chargement avec SNARF-1 et HPTS, les cellules sont cultivées dans différentes solutions au pH calibré pour construire une courbe standard de pH pour chaque sonde. L’imagerie cellulaire par microscopie confocale permet d’éliminer les artefacts et le bruit de fond. En raison des propriétés spectrales de l’HPTS, cette sonde est mieux adaptée à la mesure du compartiment endosomal légèrement acide ou à la démonstration de l’alcalinisation des organites endosomaux/lysosomaux. Cette méthode simplifie l’analyse des données, améliore la précision des mesures de pH et peut être utilisée pour répondre à des questions fondamentales liées à la modulation du pH lors des réponses cellulaires à des défis externes.

Pour la mesure simultanée du pH intracellulaire dans les deux compartiments de la cellule et endosomal / lysosomal, les sondes fluorescentes pH détection ratiométrique SNARF-1 et HPTS ont été utilisés. SNARF-1 est limitée au compartiment cytosolique tandis HPTS permet la mesure ratiométrique de pH du compartiment endosomal / lysosomal. Cellule de chargement avec HPTS pour 16 heures permet sa localisation sélective dans les endosomes / lysosomes 4. Un exemple typique de fluorescence enregistrée à partir de cel...

Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer le pH intracellulaire, mais très peu d’entre elles permettent de mesurer simultanément le pH cytoplasmique et organtelaire. Ici, nous décrivons en détail une méthodologie rapide et précise pour mesurer simultanément le pH cytoplasmique et vésiculaire par imagerie ratiométrique de cellules vivantes.

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer simultanément le pH vésiculaire et cytosolique dans des cellules vivantes par microscopie confocale. Cela est réalisé en incubant d'abord les cellules avec les sondes de détection du pH, HPTS et SNF F1, qui marquent respectivement les compartiments endosomaux et lysosomaux et le cytosol. Ensuite, les cellules sont placées dans une chambre contrôlée sur le plan environnemental sous un microscope confocal, et le logiciel est configuré pour mesurer la fluorescence des sondes dans la chambre.Les cellules sont incubées avec différentes solutions étalonnées en pH. Une courbe standard de pH est établie à l'aide d'une régression non linéaire. Des équations exponentielles sont déterminées pour les deux sondes et sont ensuite utilisées pour convertir les intensités de fluorescence des échantillons en valeurs de pH.Cette méthode permet la détermination du pH vésiculaire et cytosolique à partir d'échantillons après divers traitements et peut faciliter l'étude de la régulation du pH intracellulaire au cours de processus biologiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de mesure du pH intracellula

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Biology

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La vidéo montre la mesure simultanée des niveaux de calcium intracellulaire et des modifications du potentiel membranaire dans les cellules endothéliales des segments de l’artère cérébrale de souris. Le tube endothélial isolé est chargé d’un indicateur de calcium fluorescent et traité avec un médicament qui induit la libération intracellulaire de calcium, entraînant une modification du potentiel membranaire. La fluorescence de l'indicateur permet de mesurer les niveaux de calcium, et une...

Mesure simultanée du calcium intracellulaire et du potentiel membranaire dans l’endothélium cérébral d’une souris

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

Le pH phagosomal influence la maturation des phagosomes, la production d’oxydants, la destruction des phagosomes ainsi que la présentation de l’antigène. Nous décrivons ici une méthode ratiométrique pour mesurer les changements de pH dans le temps et les paramètres finaux dans les phagosomes individuels des phagocytes vivants à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence

Ce manuscrit décrit une méthode simple pour mesurer le pH du phagosome et de la zone, ainsi que le pH cytoplasmique des neutrophiles humains et de souris en utilisant l'indicateur ratiométrique seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Ceci est réalisé en utilisant la microscopie à fluorescence confocale cellules vivantes et l'analyse d'image.

Imagerie du neutrophile Phagosome et Cytoplasme L&#39;utilisation d&#39;un pH Ratiométrique Indicateur

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ Ψm) pour séquestrer le calcium (Ca2 +), ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique 2+ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries Ca2 + d'absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Ce protocole décrit une nouvelle méthode permettant la visualisation quantitative de la formation d’un complexe de protéines SNARE, basée sur le transfert d’énergie Förster et durée de vie de fluorescence imaging microscopy.

Visualisation de SNARE intracellulaire traite par Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Présenté ici est le protocole de la technique Conpokal, qui combine la microscopie confoccale et de force atomique en une seule plate-forme d’instrument. Conpokal fournit la même cellule, la même région, l’imagerie confocale presque simultanée et la caractérisation mécanique des échantillons biologiques vivants.

À proximité de Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.

Microscopie confocale pour mesurer trois modes de dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines surrénales

Le protocole décrit une plate-forme microfluidique avancée pour mesurer quantitativement la dynamique de sécrétion de cytokines de cellules mononucléées du sang périphérique humain individuelles. La plateforme mesure jusqu’à trois cytokines en parallèle (IL-6, TNFα et IL-1β) pour chaque cellule individuelle stimulée par le lipopolysaccharide à titre d’exemple.

Approche microfluidique pour résoudre la sécrétion simultanée et séquentielle de cytokines de cellules polyfonctionnelles individuelles 

Apprenez à mesurer simultanément le pH vésiculaire et cytosolique dans les cellules vivantes par microscopie confocale. Cette méthode utilise les sondes HPTS et SNF F1 pour étudier la dynamique du pH intracellulaire.

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

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