Name: Immunohistochimie et calcium méthodes dimagerie dans Wholemount Rat Retina (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez l'immunohistochimie et l'imagerie calcique dans la rétine entière de rat pour étudier les cellules ganglionnaires rétiniennes. Cette méthode permet de mesquer les dynamiques calciques et les canaux calciques voltage-dépendants.

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Nous remercions le Dr S. Stella et Helen Vuong à contributions pour le protocole d&#39;imagerie de calcium. Nous remercions le Dr K. Feuilles pour filmer les scènes d&#39;entrevue. Nous remercions le Dr Arlene Hirano pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce projet de recherche et développement a été menée par les auteurs à la David Geffen School of Medicine à UCLA et est rendu possible par un accord de contrat qui a été attribué et géré par le Commandement de la recherche médicale et du matériel de l&#39;armée américaine (USAMRMC) et la technologie de télémédecine et avancée Centre de recherche (TATRC), à Fort Detrick, dans le Maryland, sous le numéro de contrat: W81XWH-10-2-0077. Le soutien à ces études sont également venus de NIH EY04067 et un examen du mérite VA (NB). PNE est une carrière chercheur VA.

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices pour le bien-être des animaux de laboratoire émises par la politique US Public Health Service sur Human Care et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et l&#39;Université de Californie-Los Angeles (UCLA) Comité de recherche animale. Mâle et femelle adultes rats Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre l&#39;âge de 3-5 semaines ont été utilisés. 1. animaux et Préparation des tissus pour Wholemount Retina et le Protocole immunohistochimie <ol><li> Préparer les matériaux et outils suivants: Une loupe binoculaire, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope. </li><li> Euthanasier le rat dans une chambre fermée par anesthésie profondément les animaux avec 1-3% d&#39;isoflurane suivie par décapitation avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l&#39;iris et les placer dans une boîte de Petri contenant la solution extracellulaire. Hibernate A, Ames moidium ou solutions physiologiques sont recommandés. </li><li> [Étape facultative si le remblayage des CGR avec Fluo-4 est souhaitée]. Effectuer l&#39;étiquetage Fluo-4 comme décrit dans les étapes 2.3-2.4. </li><li> Utilisation du microscope à dissection (d&#39;intensité lumineuse: 1,6 x 10 8 / mm 2 photons ⋅sec), retirer la cornée en coupant la face du globe oculaire. Retirez l&#39;objectif et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince. Pour retirer le corps vitré, stabiliser le globe oculaire en maintenant la sclérotique fermement avec une pince. Retire la base du vitré vers le centre de la rétine de l&#39;autre pince. La préparation à ce stade est appelé l&#39;œilleton, qui est utilisé pour cryosections. Plus de détails sur cryosections peuvent être trouvés dans les références 14,15. </li><li> Retirer la rétine de l&#39;œilleton. Ensuite, faire quatre coupes pour permettre la rétine à plat. Monter doucement la rétine sur une lame de microscope avec le photorécepteur couche vers le haut. Ajouter une goutte de solution de la rétine et mettre CEpapier filtre llulose sur la rétine. Une fois la rétine attache au papier filtre, placer la rétine remise en solution. Si nécessaire, aplatir la rétine avec un pinceau ou une pince. </li><li> Placez les rétines wholemounted dans 4% PFA pendant 10-15 min pour la fixation. </li><li> Laver les rétines wholemounted trois fois pendant 30 minutes dans 0,1 M de tampon phosphate (PB), pH 7,4. Bloquer les rétines avec 5% de sérum normal de chèvre ou de sérum d&#39;âne à 0,1 PB contenant 0,3% de Triton X-100 et 0,1% de NaN 3 à 4 ° C pendant une nuit. Nous recommandons un volume final de 500 pl pour toutes les étapes d&#39;économiser de blocage des solutions et des anticorps. </li><li> Le lendemain, incuber les échantillons entiers de la rétine avec les principaux anticorps 5-7 jours à 4 ° C. Des dilutions optimales doivent être déterminées par l&#39;utilisateur. </li><li> Laver les rétines 3 x 30 min dans 0,1 M de PB et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans l&#39;anticorps secondaire conjugué à un fluorophore correspondant qui est dirigé contre l&#39;espèce de l&#39;anticorps primaire (concentration de 1: 1000). </li><li> Après trois derniers lavages de 30 minutes chacun avec PB, monter les rétines dans un milieu de montage. Sceller les lamelles avec du vernis à ongles pour un stockage prolongé. Conserver les échantillons à 4 ° C et protéger de la lumière. </li></ol> 2. marquage des cellules ganglionnaires et des axones à Rat Wholemount rétines avec un colorant indicateur de calcium <ol><li> Préparer 1000 ml de Ringer de mammifère contenant (en mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 de CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, NaHCO 3 25, glucose 10 et barboter avec 95% O 2/5% CO &#173; 2. </li><li> Effectuer la dissection comme décrit dans les étapes 1.2-1.4. </li><li> Pour charger les cellules rétiniennes ganglionnaires (CGR) et leurs axones avec un colorant indicateur de calcium, injecter 0,5 pi de Fluo-4 sel de pentapotassium (40 mM d&#39;achat d&#39;actions en H 2 O) dans le nerf souche optique d&#39;environ 1 mm en arrière du globe oculaire à l&#39;aide d&#39;une seringue . Pour mesurer dynamique augmente dans la cellule de ganglion [Ca 2 + </sup&gt;] i un indicateur avec une forte affinité, tels que Fluo-4 avec sa valeur de Kd de 345 nM, est optimal. Fluo-4 offre l&#39;avantage supplémentaire d&#39;avoir une efficacité quantique très élevée résultant en une augmentation d&#39;émission de&gt; 100 fois lorsqu&#39;il est lié au calcium. </li><li> Placez l&#39;œilleton dans barboter avec 95% de O 2/5% de CO mammifères Ringer &#173; 2 pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Protocole d&#39;imagerie 3 de calcium pour les cellules ganglionnaires de la rétine et des axones. <ol><li> Retirer l&#39;œil, le cristallin et vitreux comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Isoler la rétine de l&#39;œilleton et la diviser en quadrants. Mont côté des cellules ganglionnaires d&#39;un quadrant sur une lame de verre et d&#39;utiliser une grille harpe de tranche pour le stabiliser. Gardez les autres morceaux adaptés à l&#39;obscurité dans barboter avec 95% de O 2/5% de CO mammifères Ringer &#173; 2 sur de la glace pour une utilisation ultérieure. </li><li> Superfuse la chambre d&#39;enregistrement avec la solution de Ringer et mammifèresmaintenir la solution en continu avec barbotage de 95% O 2/5% CO 2. </li><li> L&#39;image du tissu sous le microscope. Faire des expériences à température ambiante (~ 23 ° C) ou à atteindre des températures physiologiques en chauffant la phase, le chauffage du bain d&#39;eau sous le spécimen ou l&#39;application d&#39;air chaud à la surface de l&#39;échantillon. Remarque: Il est important de noter que de nombreuses fonctions cellulaires sont réglementés par la température, qui joue un rôle clé dans le maintien de l&#39;homéostasie intracellulaire 16. Cependant, l&#39;introduction de mesures de réchauffement peut augmenter le taux de photoblanchiment, l&#39;évaporation de la dérive de la moyenne et de concentration causée par la dilatation thermique 17. L&#39;utilisation de la température ambiante diminue intracellulaire cloisonnement de Fluo-4, 18. </li><li> Effectuer un contrôle de deux impulsions à haute K + appariés en l&#39;absence de médicaments. Dépolariser CGR et RGC axones en augmentant la [K +] o de 3 à 60 mm pour 33 sec pendant chaque impulsion pour activerVGCCs avec un système de surfusion entraînée par gravité huit canaux. Réduire Na + par 57 mM de maintenir isosmolarity dans la solution élevée de K +. </li><li> Évaluer la contribution des différents VGCCs au signal de calcium avec l&#39;utilisation des inhibiteurs généraux ou spécifiques canaux Ca. Par exemple, la réduction du signal de calcium après l&#39;administration d&#39;un bloqueur du canal calcique non-spécifique, de cobalt, à condition d&#39;une mesure semi-quantitative de la contribution des VGCCs au K + élevé du signal de calcium -evoked. </li><li> Acquérir des valeurs d&#39;intensité de fluorescence en plaçant une région d&#39;intérêt (ROI) dans les CGR d&#39;intérêt (Figure 2). </li><li> Normaliser la variation de l&#39;intensité de fluorescence produite par le second pic élevé de K + à la variation produite par le premier pic élevé de K +. Puis, pour tester des inhibiteurs spécifiques des canaux calciques, les médicaments uniquement appliquer pendant la seconde impulsion haute K + et une paire de normaliser cette pointe contrela première valeur de crête. Pour mesurer l&#39;effet du médicament sur ​​le pic élevé de K +, de diviser l&#39;amplitude du second pic K + par celle de la première. L&#39;analyse doit être effectuée sur ces valeurs par rapport à leurs témoins correspondants dérivés de K + haute pics appariés mesurée en l&#39;absence de médicament. </li><li> Acquérir des images à intervalles de 5 secondes. Pour éviter photo-blanchiment, garder l&#39;excitation laser aussi bas que possible. Fournir une excitation par la ligne 488 nm du laser à argon, tandis que le tube photomultiplicateur collecte l&#39;émission de fluorescence au moyen d&#39;un filtre LP 505 nm. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucune divulgation.

Dans cet article, nous avons décrit deux techniques différentes: 1) L&#39;immunohistochimie pour afficher Fluo-4 localisation des cellules ganglionnaires de la rétine dans des échantillons entiers, et 2) l&#39;imagerie de calcium pour analyser la dynamique de calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones. L&#39;immunohistochimie en utilisant des échantillons entiers a été utilisé pour révéler la localisation des protéines dans la rétine 20-23 rongeur. Ce...

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) expriment L, N, P / Q et T de type CCAGV tel que déterminé par le blocage pharmacologique de ces composants de la cellule entière canal Ca courant 1,2. CCAGV sont des protéines transmembranaires multimères qui sont impliqués dans la libération du transmetteur, la transcription des gènes, régulation cellulaire et la plasticité synaptique 3,4,5. VGCCs fonctionnels sont constitués d&#39;au moins trois catégories distinctes de sous-unités: grandes, une α transmembranaires formant des pores sous-unités qui établissent des propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal, principalement extracellulaire auxiliaire α 2 δ de sous-unités et sous-unités β intracellulaires. Les deux derniers complexes sous forme de hétéromères avec différentes sous-unités α 1 et modifier la cinétique de déclenchement et le trafic des canaux à la membrane plasmique 6. Au cours des dernières décennies, de nombreuses techniques ont été utilisées pour étudier la protéine expression, comme l&#39;immunohistochimie, dosage immuno-enzymatique, une analyse Western et la cytométrie en flux. Ces techniques nécessitent l&#39;utilisation d&#39;anticorps spécifiques pour la détection d&#39;une protéine d&#39;intérêt donnée et fournissent des outils puissants pour la localisation et la distribution des protéines spécifiques dans différents tissus. Les techniques utilisées pour détecter et quantifier des taux d&#39;une protéine particulière d&#39;expression d&#39;ARNm telles que l&#39;analyse par transfert de Northern, RT-PCR en temps réel quantitative RT-PCR, l&#39;hybridation in situ, des puces à ADNc et essai de protection de ribonucléase offrent une approche alternative lorsque les anticorps ne sont pas facilement disponibles ou si les niveaux d&#39;une protéine particulière d&#39;expression est faible 7. Toutefois, une limitation de l&#39;utilisation de ces techniques moléculaires est l&#39;identification spécifique d&#39;une séquence de gène. Pour localiser les protéines de la rétine, l&#39;immunohistochimie peut être effectuée sur les rétines wholemount. En raison de l&#39;accessibilité des CGR, le wholemountpréparation fournit une excellente plateforme pour étudier la localisation des protéines spécifiques à la soma RGC et leurs axones. En plus de leur localisation, des propriétés fonctionnelles des CGR dans VGCCs peuvent être démontrées par l&#39;utilisation de techniques d&#39;imagerie de calcium. Nous décrivons un protocole d&#39;imagerie du calcium pour marquer sélectivement CGR avec un colorant indicateur du calcium à mesurer la dynamique du calcium intracellulaire. La contribution des différents VGCCs au signal de calcium dans différents compartiments cellulaires peut être isolé à l&#39;aide de bloqueurs des canaux Ca-spécifique de sous-typage. Peut-être l&#39;un des aspects les plus bénéfiques de la technique d&#39;imagerie de calcium décrite ici est la possibilité d&#39;enregistrer en même temps et indépendamment l&#39;un de plusieurs CGR et de leurs axones. Bien que de nombreuses techniques physiologiques, telles que l&#39;enregistrement de l&#39;ensemble de serrage de plaque de cellule, de fournir des enregistrements de haute résolution temporelle des courants membranaires, l&#39;origine somatique ou axonale des thescourants électroniques enregistrées ne peuvent pas être victimes de discrimination et les enregistrements ne peuvent être faites à partir d&#39;un seul neurone à la fois. matrices électrodes multiples (AME) sont capables d&#39;enregistrer en même temps des pointes de nombreuses cellules, mais ne peuvent ni détecter ni discrimination de l&#39;activation, par exemple, les différents sous-types de canaux calciques. Meas préférentiellement enregistrer à partir de cellules qui sont situées à proximité immédiate de l&#39;électrode 8 et enregistrement donné à partir de cellules qui produisent des grandes pointes 9. Méthodes d&#39;imagerie optique fournissent une stratégie alternative pour permettre aux enregistrements simultanés et indépendants des populations entières de cellules qui peuvent être intégrés avec les informations obtenues à partir de micro-électrodes d&#39;une cellule unique et le patch enregistrement de serrage et l&#39;enregistrement de la MEA. Bien que les techniques d&#39;imagerie de calcium décrits ici ont été utilisées pour étudier la dynamique de calcium de CGR, patch clamp et AME peuvent aussi être utilisés en parallèle pour élucider les courants ioniques et les propriétés de dopage de CGR. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Comme les cellules amacrines déplacées représentent environ 60% de la population neuronale dans la couche des cellules ganglionnaires dans la rétine de souris 10, notre objectif était d&#39;utiliser une technique de chargement qui marque sélectivement CGR avec un colorant indicateur de calcium synthétique dans un préparation wholemount. Bien synthétiques colorants indicateurs de calcium fournissent une excellente plate-forme pour l&#39;étude de la dynamique de calcium intracellulaire, son utilisation généralisée a été entravée par l&#39;impossibilité de charger efficacement les populations spécifiques de neurones dans un réseau donné. Beaucoup de techniques telles que le chargement en vrac 11 et l&#39;électroporation 8,12 ont été réalisées pour charger des populations entières de cellules, cependant, ces techniques ne sont pas discriminatoires entre les différents types de cellules spécifiques. Génétiquement codés indicateurs de calcium offrent la possibilité de marquer sélectivement les populations spécifiques de cellules, cependant, de tels procédés exigent la production d&#39;animaux transgéniques 13. Notre technique décrit une méthod étiqueter sélectivement CGR dans la préparation wholemount par fibre injection nerf de la souche d&#39;un colorant indicateur de calcium. Pris ensemble, les techniques structurelles et physiologiques décrites dans cet article fournissent une plate-forme pour étudier la localisation et la contribution des VGCCs au signal de calcium dans les CGR et leurs axones.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux droits</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Pince droite</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>à iris courbés</td> Outils <td>de dissection</td><td>WPI</td><td>504487</td></tr><tr><td>Papier filtre en cellulose</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp ; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp ; rct=j& q=& esrc=s& source=web& cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx %3FcatID %3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& USG=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">Milieu de montage pour fluorescence</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassique</td><td>, Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr>, <tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anesthésie</td></tr>, <tr><td>lame de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Zeiss LSM 5 Pascal</td>, <td>objectif Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0,8) lentille</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L) Anticorps</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A-11034</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>A anticorps polyclonal de lapin&nbsp ; a été généré contre l’extrémité N-terminale du RBPMS&nbsp ; polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, par un fournisseur commercial (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans wholemount rat retina

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Dans cet article, nous décrivons les outils, les réactifs et les mesures concrètes qui sont nécessaires pour: 1) la préparation réussie de rétines wholemount pour l&#39;immunohistochimie et, 2) l&#39;imagerie calcique pour l&#39;étude de la tension fermée canal de calcium (CCAGV) signalisation médiée de calcium dans la rétine cellules ganglionnaires. Procédé de formation d&#39;image de calcium, nous décrivons des questions relatives au chargement contourne non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires.

Immunomarquage avec des anticorps spécifiques fournit une plate-forme pour étudier la localisation des protéines d&#39;intérêt particulier dans la rétine et la technique d&#39;imagerie de calcium permet l&#39;étude de la contribution des VGCCs à la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones. En utilisant un anticorps dirigé contre les RBPMS de protéines des cellules ganglionnaires (protéine de liaison de l&#39;ARN avec le raccordement multiple) qui ...

protocoles d&#39;immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d&#39;une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d&#39;imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

L'objectif général de cette procédure est de marquer sélectivement les cellules ganglionnaires rétiniennes dans une préparation en montage entier par une injection d'un colorant indicateur de calcium dans le moignon du nerf optique. Cette opération s'effectue en injectant d'abord un colorant indicateur de calcium à très haute affinité, tel que le fluo-4, dans le moignon du nerf optique. Ensuite, la rétine est isolée de la cupule oculaire et divisée en quadrants afin d'être montée sur une lame de verre. Dans une chambre d'enregistrement configurée pour imiter des conditions physiologiques, on étudie la contribution des canaux calciques activés par le voltage au signal calcique.Dans les cellules ganglionnaires rétiniennes, les mesures peuvent être effectuées dans des cellules dépolarisées à l'aide de bloqueurs de canaux. En fin de compte, les résultats peuvent fournir des mesures semi-quantitatives de la contribution des canaux calciques sensibles au voltage à un signal tel qu'un signal calcique induit par un fort taux de potassium. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'électroporation et le chargement en masse, est la possibilité d'étiqueter sélectivement les cellules ganglionnaires rétiniennes et leurs axones dans une préparation en montage complet, à partir d'yeux rad prélevés et disséqués, conservés dans un milieu de conservation ou une solution similaire.À présent, si vous prévoyez de réaliser des expériences d'imagerie calcique, rétrogradez les cellules ganglionnaires de la rétine avec le fluo-4. Injectez 0,5 microlitre de fluo-4 pentapotassique à 40 millimolaire, reconstitué dans l'eau, dans le moignon du nerf optique environ un millimètre en arrière du globe oculaire. Transférez le globe oculaire dans du Ringer de mammifère.Barboter avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone, ou laisser une heure à température ambiante. Conserver la préparation à l'abri de la lumière. Dissecter les yeux sous un microscope avec une intensité lumineuse contrôlée.À l’aide d’un rasoir, faites délicatement une petite incision à l’avant du globe oculaire et retirez la cornée. Ensuite, retirez le cristallin de la surface rétinienne interne à l’aide de pinces. Maintenez fermement la sclérotique.Lors de la suppression du vitré avec l'autre pince, détacher délicatement la base du vitré vers le centre de la rétine. Le prélèvement obtenu, appelé cupule I, peut être traité pour une préparation histochimique en montage complet, une préparation pour l'imagerie calcique, ou préparé pour des coupes transversales de la rétine afin d'obtenir une préparation histochimique en montage complet. Commencer par effectuer quatre incisions dans la rétine afin qu'elle s'étale à plat.Placez la rétine sur la lame de couverture en verre avec la couche des cellules ganglionnaires orientée vers le bas. Deuxièmement, ajoutez une goutte de solution sur la rétine et recouvrez-la de papier filtre en cellulose si nécessaire, puis aplatissez la rétine à l’aide d’un pinceau ou de pinces. Troisièmement, lorsque la rétine est complètement plate et détachée du papier filtre, replacez-la dans la solution.Pour commencer le traitement, transférez d'abord le prélèvement dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, lavez les rétines trois fois dans un tampon phosphate 0,1 molaire à pH 7,4, chaque lavage durant 30 minutes, pour un total de 90 minutes. Puis, incubez les rétines dans 500 microlitres de solution de blocage toute la nuit à quatre degrés Celsius.Cette solution contient 5 % de sérum de chèvre normal ou de sérum d'âne dans un tampon phosphate avec 0,3 % de Tritton et 0,1 % d'azoture de sodium. Incubez les rétines dans la solution d'anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant les cinq à sept prochains jours. La composition de cette solution doit être déterminée empiriquement. Rincez la solution d'anticorps primaire de la même manière que le fixateur a été rincé.Incubez ensuite les rétines dans l'anticorps secondaire à une concentration de un à 1000 pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Éliminez l'anticorps secondaire par trois nouveaux lavages au tampon phosphate. Montez ensuite les rétines pour visualisation et scellez-les avec du vernis à ongles.Ces lames doivent être conservées à l'obscurité à quatre degrés Celsius. Commencez par préparer une monture complète pour l'imagerie calcique à partir de la cupule I dans du ringer. Premièrement, découpez le tissu rétinien en quadrants.Placez un quadrant à plat dans la chambre d’enregistrement, avec la couche ganglionnaire orientée vers le haut, et donc la couche des photorécepteurs orientée vers le bas. Séchez soigneusement la zone environnante avec un essuie-tout Kim et placez délicatement la harpe enduite de graisse sur le tissu. Chargez ensuite la préparation rétinienne sur le dispositif et terminez la mise en place du système de superfusion gravitationnel à huit canaux.Si la rétine montée bouge après le placement du harp, retirez et nettoyez soigneusement le harp. Séchez la zone entourant la rétine et remontez le harp super. Remplissez la chambre d’enregistrement avec une solution de Ringer mammifère et maintenez la solution en bulles continues avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.Tout d'abord, en tant que témoin sans médicament, appliquez deux impulsions appariées de haute concentration en potassium, passant de trois millimolaires à 60 millimolaires pendant 33 secondes. Si le montage fonctionne, la dépolarisation doit activer les canaux calciques activés par le voltage dans la cellule ganglionnaire rétinienne (RGC). Poursuivez ensuite les expériences.Le nifédipine, un bloqueur des canaux calciques voltage-dépendants de type L, est couramment utilisé pour évaluer la contribution des canaux calciques voltage-dépendants de type L au signal calcique induit par dépolarisation au cobalt. Un bloqueur non spécifique des canaux calciques peut être utilisé pour bloquer de manière non sélective les canaux calciques voltage-dépendants. Analysez la préparation toutes les cinq secondes afin de visualiser et d'acquérir des images des cellules ganglionnaires rétiniennes fluorescentes.Utilisez une puissance laser aussi faible que possible. L'excitation doit être réglée à 488 nanomètres et l'émission doit être collectée avec un filtre passe-bas de 505 nanomètres. À l'aide des protocoles décrits, un marquage immunohistochimique a été réalisé contre la protéine R-B-P-M-S des cellules ganglionnaires, une protéine liant l'ARN présentant plusieurs épissages alternatifs.Four.La coloration était effectivement limitée aux cellules ganglionnaires, conformément à la fiche technique de l'anticorps. Ensuite, la contribution des canaux calciques activés par le voltage au signal calcique dans les CBR a été étudiée à l'aide des valeurs d'intensité fluorescente obtenues à partir du CBR. Au niveau de la ligne de base, les CBR et leurs axones peuvent être observés marqués avec le flux quatre.Afin d'obtenir des valeurs d'intensité fluorescente, des régions d'intérêt (ROIs) ont été placées sur les cellules ganglionnaires, les corps cellulaires et/ou les axones. Après l'application de potassium élevé sur la préparation en montage entier, le signal fluorescent des CSG a augmenté. Ceci a été suivi par une réduction ultérieure des valeurs d'intensité de fluorescence en présence de cobalt lors de la deuxième impulsion de potassium élevé.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de charger sélectivement les cellules ganglionnaires de la rétine avec un colorant synthétique indicateur de calcium dans une préparation en montage entier.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans...

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Nous décrivons un protocole à suivre Ca 2+ dynamique dans les terminaisons axonales des cônes photorécepteurs utilisant une préparation de tranches ex-vivo de la rétine de souris. Ce protocole permet à des études approfondies de cône Ca 2+ signalisation dans un important système modèle mammifère, la souris.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Nous montrons trois techniques de préparation de tissus différents pour la visualisation d’immunohistochemical des péricytes microvasculaire rétine de rat, c'est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.

Rétiniennes Cryo-sections, ensemble-montages et préparations hypotonique vaisseaux isolés pour la visualisation d’Immunohistochemical des péricytes microvasculaire

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Le présent protocole décrit la fabrication d’une grande fenêtre crânienne (6 x 3 mm2) à l’aide d’une pellicule alimentaire, de silicone transparent et de verre de couverture. Cette fenêtre crânienne permet des expériences in vivo d’imagerie calcique à grand champ et à deux photons chez la même souris.

In vivo Imagerie calcique à grand champ et à deux photons d’une souris utilisant une grande fenêtre crânienne

Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Les prothèses rétiniennes ont la capacité de générer des perceptions visuelles. Pour faire progresser le développement de nouvelles prothèses, des méthodes ex vivo sont nécessaires pour tester les dispositifs avant l’implantation. Cet article fournit un protocole complet pour étudier l’activité du calcium dans la couche de cellules ganglionnaires de la rétine lorsqu’elle est soumise à une stimulation électrique.

Imagerie calcique dans les rétines à montage plat stimulées électriquement

Les indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) permettent une analyse robuste de la signalisation des neurones sensoriels à l’échelle de la population. Ici, nous avons développé une nouvelle approche qui permet de visualiser in vivo l’activité des neurones des ganglions trijumeaux chez le rat.

In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

Ce protocole décrit la procédure d’isolement de la rétine de souris et d’immunomarquage pour marquer toutes les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Le processus est suivi d’une imagerie et d’un comptage automatique des CGR à l’aide d’un logiciel basé sur l’IA, offrant une méthode simple, rapide et précise pour quantifier les CGR dans l’ensemble de la rétine de la souris.

Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

Apprenez l'immunohistochimie et l'imagerie calcique dans la rétine entière de rat pour étudier les cellules ganglionnaires rétiniennes. Cette méthode permet de mesquer les dynamiques calciques et les canaux calciques voltage-dépendants.

Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina

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