Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina

L’objectif global de cette procédure est de marquer sélectivement les cellules ganglionnaires rétiniennes dans l’ensemble de la préparation du support via une injection d’un colorant indicateur de calcium dans le moignon du nerf optique. Ceci est accompli en injectant d’abord un colorant indicateur de calcium de très haute affinité, tel que le flux quatre dans le moignon du nerf optique. Ensuite, la rétine est isolée de l’œilleton et divisée en quadrants pour être montée sur une lame de verre Dans une chambre d’enregistrement configurée pour imiter les conditions physiologiques, les contributions des canaux calciques voltage-dépendants au signal calcique.

Dans les cellules ganglionnaires rétiniennes, les cellules peuvent être mesurées dans les cellules dépolarisées à l’aide de bloqueurs de canaux. En fin de compte, les résultats peuvent fournir des mesures semi-quantitatives de la contribution des canaux calciques éduqués en tension à un signal tel qu’un signal calcique évoqué à haute teneur en potassium. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’électroporation et le chargement en vrac, est la possibilité de marquer sélectivement les cellules ganglionnaires rétiniennes et leurs axones dans un ensemble de préparation de montage, de disséquer des yeux radiaux et d’hiberner un milieu de visée ou une solution similaire.

Maintenant, si vous avez l’intention d’effectuer des expériences d’imagerie calcique, remplissez les cellules ganglionnaires rétiniennes avec le flux quatre. Injectez 0,5 microlitre de quatre sels pentapotassiques à flux millimolaire, reconstitué dans l’eau dans le nerf optique, moignon d’environ un millimètre en arrière du globe oculaire. Transférez le globe oculaire dans des bagues de mammifères.

Rempli de bulles avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone ou une heure à température ambiante. Conservez la préparation dans l’obscurité. Disséquez les yeux au microscope avec une intensité lumineuse contrôlée.

À l’aide d’une lame de rasoir, faites doucement une petite incision à l’avant du globe oculaire et retirez la cornée. Retirez ensuite la lentille de la surface interne de la rétine à l’aide d’une pince. Tenez fermement la sclérotique.

Lorsque vous retirez le vitré avec l’autre pince, décollez doucement la base vitrée vers le centre de la rétine. La préparation résultante appelée tasse I peut être traitée pour la préparation immunohistochimique de montage entier, la préparation d’imagerie calcique ou préparée pour les coupes rétiniennes transversales afin de faire une préparation de montage immunohistochimique entier. Tout d’abord, faites quatre incisions à la rétine pour qu’elle repose à plat.

Placez la rétine sur la lame de couverture en verre avec la couche de cellules ganglionnaires vers le bas. Deuxièmement, ajoutez une goutte de solution sur la rétine et couvrez-la de papier filtre en cellulose si nécessaire, aplatissez la rétine avec une brosse ou une pince. Troisièmement, lorsque la rétine est complètement plate et qu’elle se détache du papier filtre, remettez-la dans la solution.

Pour traiter d’abord la préparation, transférez-la dans de l’aldéhyde paraforme à 4 % pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, lavez les rétines trois fois dans un tampon de phosphate de 0,1 molaire à pH 7,4 pendant 30 minutes par lavage pour un total de 90 minutes. Ensuite, incubez les rétines dans 500 microlitres de solution bloquante pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Cette solution est composée de 5 % de sérum de chèvre ou d’âne normal dans un tampon de phosphate avec 0,3 % de tritton et 0,1 % d’azoture de sodium au cours des cinq à sept prochains jours, incuber les rétines dans la solution d’anticorps primaires à quatre degrés Celsius. La composition de cette solution doit être établie de manière empirique. Lavez la solution d’anticorps primaire comme le fixateur a été lavé.

Ensuite, incubez les rétines dans des anticorps secondaires à une concentration de un à 1000 pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Retirez l’anticorps secondaire avec trois autres lavages et un tampon de phosphate. Montez ensuite les rétines pour la visualisation et scellez-les avec du vernis à ongles.

Ces lames doivent être stockées dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Commencez par faire une préparation de montage entier d’imagerie calcique à partir de la tasse I dans les sonneries. Tout d’abord, coupez le tissu rétinien en quadrants.

Placez un quadrant à plat sur la chambre d’enregistrement avec la couche ganglionnaire vers le haut, et donc la couche photoréceptrice vers le bas. Séchez soigneusement la zone environnante avec une lingette Kim et placez délicatement la harpe graissée sur le mouchoir. Chargez maintenant la préparation rétinienne sur la plate-forme et terminez la configuration du système de superfusion à huit canaux entraînés par gravité.

Si la rétine montée bouge après la mise en place de la harpe, retirez et nettoyez soigneusement la harpe. Séchez la zone entourant la rétine et remontez la harpe super. Fusionnez la chambre d’enregistrement avec une solution de sonnerie de mammifère et maintenez la solution bouillonnante en permanence avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone.

Tout d’abord, en tant que contrôle sans médicaments, effectuez deux impulsions appariées de potassium élevé de trois millimolaires à 60 millimolaires pendant 33 secondes. Dépolarisant, le RGC doit activer les canaux calciques voltage-dépendants si la préparation fonctionne. Poursuivez maintenant les expériences.

Le bloqueur des canaux calciques voltage-dépendants de type nifédipine et L est couramment utilisé pour évaluer la contribution des canaux calciques voltage-dépendants de type L à la dépolarisation évoquée du signal calcique cobalt. Un bloqueur de canaux calciques non spécifique peut être utilisé pour bloquer de manière non sélective les canaux calciques voltage-dépendants. Scannez la préparation toutes les cinq secondes pour visualiser et acquérir des images du rgc fluorescent.

Utilisez une puissance laser aussi faible que possible. L’excitation doit être réglée à 488 nanomètres et l’émission doit être collectée avec un filtre LP de 505 nanomètres. À l’aide des protocoles décrits, un immunomarquage a été effectué contre la protéine de cellule ganglionnaire R-B-P-M-S, qui est une protéine de liaison à l’ARN avec un flux d’épissage multiple. Quatre.

La coloration était en effet limitée aux cellules ganglionnaires sur la base de la spécification de l’anticorps. Ensuite, la contribution des canaux calciques voltage-dépendants au signal calcique dans les R GC a été étudiée à l’aide des valeurs d’intensité fluorescente acquises à partir du rgc. Aux niveaux de base, les axones RGC et RGC peuvent être étiquetés avec le flux quatre.

Afin d’acquérir des valeurs d’intensité fluorescente, des ROI ont été placés sur la cellule ganglionnaire, le somata et / ou les axones. Après avoir appliqué une teneur élevée en potassium sur l’ensemble de la préparation de la monture, le signal fluorescent du RG C a augmenté. Cela a été suivi d’une réduction ultérieure des valeurs d’intensité de fluorescence en présence de cobalt lors de la deuxième impulsion de potassium élevée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de charger sélectivement des cellules ganglionnaires rétiniennes avec une matrice indicatrice de calcium synthétique dans une préparation de montage entier.