Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l'intégrase

L’objectif global de l’expérience suivante est de cribler des composés d’intérêt afin de déterminer leur cytotoxicité cellulaire et leur capacité à inhiber le VIH de type sauvage ou résistant aux médicaments en un seul essai d’infectiosité. Ceci est réalisé en exposant d’abord les cellules aux composés pour l’absorption, puis en incubant les cellules traitées avec de la luciférase exprimant un VIH de type sauvage ou résistant aux médicaments. L’activité de la luciférase du virus peut alors être mesurée.

En fin de compte, le signal de lecture de la luciférase peut être utilisé pour quantifier l’inhibition de la réplication du vecteur viral VIH V un par les composés. Cette technique a des implications thérapeutiques car elle peut être utilisée pour cribler de nouveaux composés qui présentent une meilleure efficacité contre le VIH résistant aux médicaments. La veille de la transfection, la plaque de 2 93 cellules sur des boîtes de 100 millimètres à une densité de 1 500 000 cellules.

Le lendemain, transfectez les cellules avec 16 microgrammes de VIH de type sauvage ou mutant et quatre microgrammes de VSV à l’aide de l’application de la méthode du phosphate de calcium. Six heures plus tard, lavez les 2 93 cellules deux fois avec du PBS, puis incubez-les avec un milieu frais pendant 48 heures. Deux jours plus tard, récoltez le virus contenant des surnageants S dans des boîtes de 100 millimètres de diamètre et clarifiez les surnageants par centrifugation à basse vitesse pendant 10 minutes à 1 620 G à température ambiante.

Ensuite, filtrez les surnageants à travers un filtre à seringue de 45 micromolaires et traitez les suspensions virales avec des turbo-ADN. Après 30 minutes à température ambiante, diluez le virus avec un milieu frais et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer le criblage des composés dans un test d’infectiosité la veille de l’expérience, ensemencez 4 000 cellules d’intérêt dans chaque puits d’un 96.

Insérez 100 microlitres de milieu et incuberez-les à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. 24 heures plus tard, diluez en série le composé de la solution mère dans un milieu frais. Les concentrations finales choisies dépendront d’une plage de concentrations déterminée empiriquement, comme indiqué dans le tableau.

Ensuite, ajoutez la dilution en série des composés dans les puits en trois exemplaires. À un dixième du volume de la concentration finale, incuber la dilution appropriée des composés avec les cellules pendant au moins trois heures. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de virus dilué dans chacun des puits.

Acceptez les puits de contrôle négatifs. Ensuite, incubez les plaques pendant encore 48 heures. Après l’incubation, utilisez une pipette en verre équipée d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour aspirer le média des puits en commençant par le haut du média et en descendant lentement vers le coin inférieur du puits.

Ajouter immédiatement 100 microlitres de PBS complété par 0,5 millimolaire de chlorure de magnésium dans chaque puits, puis pour mesurer l’activité de la luciférase, ajouter 10 microlitres du tampon de substrat du test du gène rapporteur de luminescence à chaque flacon de réactif lyophilisé fourni. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du réactif reconstitué dans chaque puits et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre au signal de se développer. Enfin, lisez la plaque à 96 puits à l’aide d’un luminomètre à microplaques.

Les valeurs de luciférase d’une procédure de criblage de composés réussie sont présentées dans le tableau. Notez que les composés potentiellement puissants présentent une activité croissante de la luciférase, le contrôle présentant le signal le plus élevé dans cette greffe représentative de Kaleido. La concentration du composé en fonction du pourcentage d’inhibition de l’activité de Lucifer a été tracée afin de déterminer si le composé est efficace pour inhiber la réplication du VIH de type sauvage ou résistant aux médicaments.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de répartir avec précision une quantité uniforme de cellules et de virus dans tous les puits des plaques, et de s’assurer de mettre la bonne concentration de composés dans chaque puits.