Mince couche chromatographique (CCM) Séparations et essais biologiques d'extraits végétaux pour identifier des composés antimicrobiens

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des métabolites végétaux qui possèdent une activité antimicrobienne contre les bactéries anaérobies. Cela est réalisé en séparant d'abord un extrait végétal par chromatographie sur couche mince, ou CCM. Ensuite, le chromatogramme est découpé en zones comprenant un ou plusieurs composés.

Les zones sont ensuite placées sur un milieu gélosé inoculé avec des bactéries anaérobies et incubées. Après l'incubation, les zones sont retirées et les plaques sont colorées afin d'identifier les composés qui inhibent la croissance bactérienne. Les données obtenues révèlent la présence ou l'absence de métabolites végétaux antimicrobiens.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nutrition des ruminants, comme quels sont les effets des métabolites secondaires des plantes sur l'utilisation des nutriments par des microorganismes spécifiques. Bien que cette méthode mette en évidence les composés végétaux qui sont inhibiteurs pour les bactéries du rumen, elle peut également être appliquée à la mise en évidence de composés inhibiteurs d'autres bactéries ou de champignons.

Dans ce protocole, des composés phénoliques de trèfle rouge seront utilisés pour démontrer l'identification de composés antimicrobiens par biographie de contact. Commencez par nettoyer les plaques de chromatographie sur couche mince, ou CCM, en travaillant sous une hotte. Préparez suffisamment de solvant de nettoyage pour recouvrir le fond de la chambre de développement CCM, ainsi que le bord inférieur d'une plaque CCM.

Lorsqu'on le place à l'intérieur de la chambre ici, on prépare l'acétate d'éthyle et le méthanol dans un rapport de deux pour un. Ensuite, en portant des gants et en travaillant sous une hotte aspirante, utilisez des ciseaux pour découper des plaques de silice flexibles sur support en aluminium ou en plastique afin qu'elles s'ajustent à la chambre de migration.

Insérez les plaques dans la chambre en les inclinant contre les parois de la chambre. Les plaques ne doivent pas se toucher. Couvrez la chambre et laissez le solvant remonter le long des plaques par action capillaire.

Lorsque le solvant a atteint le haut des plaques, retirez-les de la chambre et disposez-les verticalement dans la hotte jusqu'à ce que le solvant se soit évaporé. Une fois les plaques sèches, vérifiez si des impuretés ont migré près du haut des plaques de CCM. Celles-ci apparaîtront sous forme de bande jaune en lumière visible ou de bande fluorescente en lumière ultraviolette.

Si la majeure partie de la plaque présente encore une teinte jaunâtre, répétez le processus de nettoyage dans la même chambre de CCM en utilisant le même solvant. Après avoir retiré les plaques de CCM de la chambre, jetez le solvant. Laissez le solvant résiduel s'évaporer complètement avant d'utiliser la chambre pour la prochaine étape du protocole.

Ensuite, pour éliminer l'humidité résiduelle pouvant affecter la migration des composés sur la silice, placer les plaques verticalement dans une étuve à 100 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes pour une plaque de 20 par 20 centimètres, et pendant cinq minutes pour des plaques de 7 par 10 centimètres. Une fois les plaques sèches, les laisser refroidir à température ambiante avant de les charger avec les extraits. Pour préparer les chambres en vue de la séparation des extraits, utiliser des ciseaux pour découper un morceau de papier filtre légèrement inférieur à la hauteur de la chambre et d'une largeur d'environ la moitié du périmètre de la chambre.

Cet article servira de mèche pour faire remonter les solvants le long de la paroi de la chambre et saturer la chambre avec les papiers solvants, améliorant ainsi la reproductibilité des séparations. Dans une hotte, mélangez ici les solvants. Les solvants utilisés sont l'acétate d'éthyle et le méthanol, dans un rapport de quatre volumes pour un volume. Versez le mélange de solvants dans la chambre et couvrez-la.

Utilisez un crayon pour marquer légèrement l'origine en un point de la plaque de CCM qui se situera au-dessus de la surface du solvant de développement dans la chambre. Si la couche absorbante de la plaque de CCM est molle et facilement endommageable, effectuez les marques sur les bords comme indiqué ici. Ensuite, dissolvez les extraits dans suffisamment de solvant organique pour obtenir une solution concentrée plutôt qu'une suspension trouble.

Ici, le solvant utilisé est le méthanol. À l’aide de micropipettes capillaires ou d’une seringue microlitrique, déposez les étalons et les échantillons sous forme de bandes étroites en laissant une marge d’un centimètre sur les côtés de la plaque ; laissez sécher les bandes, en ventilant la plaque ou en la plaçant sous une hotte, ce qui permet un séchage plus rapide. Une fois les bandes sèches, rechargez les échantillons au même emplacement ou par-dessus l’emplacement précédent.

Si une concentration plus élevée d'échantillon est nécessaire sur la plaque, répétez l'opération autant de fois que nécessaire dans la chambre de chromatographie sur couche mince. Assurez-vous que la mèche entière soit complètement saturée de solvant. Ensuite, à l’aide de pinces ou de brucelles, placez les plaques à l’intérieur de la chambre de chromatographie sur couche mince.

Les plaques ne doivent pas toucher la mèche. Couvrez la chambre et laissez migrer les composés jusqu'à ce que le front de solvant atteigne le haut de la plaque. Retirez les plaques du réservoir de chromatographie sur couche mince et marquez la hauteur du front de solvant au crayon.

Laisser sécher la plaque. Dans une hotte, révéler les plaques de CCM restantes dans la même chambre de CCM, qui est généralement utilisable pendant toute une journée si elle reste fermée. Si la quantité de solvant dans la chambre diminue de manière notable, préparer un nouveau mélange de solvant après que les plaques soient sèches.

Visualisez les bandes sous lumière visible ou UV. Une chambre de visualisation équipée d'une lampe UV portable est pratique, particulièrement si la lampe permet de détecter les composés aux longueurs d'onde courtes de 254 nanomètres et aux longueurs d'onde longues de 365 nanomètres. Utilisez un crayon pour délimiter les bandes et, à l'aide d'un système de documentation photographique de gel muni de lumières supérieures, UV et/ou visibles, obtenez des images des plaques.

Enfin, pour aider à caractériser les bandes, calculez le facteur de rétention ou les valeurs RF en mesurant d'abord la distance parcourue par le composé, puis la distance parcourue par le solvant, et en divisant la première par la seconde. Une fois les positions des bandes marquées, les plaques peuvent être conservées pour une utilisation ultérieure. Utilisez-les dans le test biologique.

Enveloppez les plaques dans du plastique et recouvrez-les de papier d'aluminium. Conservez les plaques à moins 20 degrés Celsius. La durée maximale de conservation dépend de la stabilité du composé, car la silice n'est pas neutre.

Certains composés peuvent se dégrader lorsqu'ils sont sur la plaque de CCM. En prévision du test de biographie par contact, préparez et inoculez un milieu pour bactéries hyperproductrices d'ammoniac, ou milieu HAB, en conditions anaérobies. La souche utilisée dans ce cas est Clostridium sticklandii, souche sr.

Faire pousser la culture en phase exponentielle ou stationnaire à 39 degrés Celsius. Utiliser des techniques stériles anaérobies lorsqu'on travaille avec des micro-organismes anaérobies. Préparer une solution à 0,75 % poids par volume.

Agar dans le même milieu utilisé pour cultiver les bactéries après que la température de l'agar ait diminué à moins de 60 degrés Celsius. Inoculer l'agar fondu avec 1 % volume par volume de la culture, mélanger délicatement, puis placer immédiatement dans une chambre anaérobie et verser dans des boîtes de Petri en plastique de 15 par 100 millimètres à l’aide de ciseaux. Découper la plaque de chromatographie sur couche mince (CCM) en zones contenant la ou les bandes d’intérêt.

À l’aide d’un feutre, marquer les côtés arrière des plaques. Placer une bande de CCM inutilisée sur la plaque d’agar comme témoin. Ensuite, poser les bandes face contre la plaque d’agar.

Incuber les boîtes de Petri, côté gélose vers le bas, dans l'incubateur de la chambre anaérobie pendant 24 heures à 39 degrés Celsius à l'aide de pinces. Retirer les bandes de CCM des boîtes de gélose pendant qu'elles se trouvent dans la chambre anaérobie.

Ajouter de l'acide tétraoléique rouge goutte à goutte sur les surfaces des boîtes de gélose. Laisser la couleur se développer pendant au moins 20 minutes. Lorsque la boîte témoin devient complètement rouge, retirer les boîtes de la chambre anaérobie.

Clostridium stick Landi est une bactérie anaérobie, elle commence donc à perdre sa viabilité immédiatement après son retrait de l'enceinte anaérobie, mais la couleur reste stable pendant plus de 24 heures. À l'aide d'un appareil photo numérique, prendre des photographies des boîtes en lumière visible sur un fond offrant un contraste suffisant. Une couleur rouge vif sera observée lorsque les cellules vivantes seront colorées.

Les cellules mortes ne se colorent pas. Des séparations représentatives par silice, par chromatographie sur couche mince, d'extraits de trèfle rouge contenant des composés phénoliques sont présentées ici. La séparation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane dans un rapport de neuf à un sur 8,5 centimètres a permis d'obtenir cinq bandes, dont une complètement résolue depuis l'origine.

Les standards utilisés étaient Formin Bio Canon A et Genine. Quatre bandes de cette plaque ont été appliquées à des cultures de Clostridium stick Landi, une bactérie rumine hyperproductrice d'ammoniac, pendant 24 heures, puis colorées avec du rouge tétraoléique comme décrit ici. L'incubation avec la bande un (Bio Canon A) et une partie de la bande deux (quatre Monon nein) sur gélose ensemencée en bactéries a donné une zone bien définie d'inhibition.

Cependant, l'incubation du reste de la bande deux, ainsi que des bandes trois et quatre, n'a pas inhibé la croissance bactérienne. Ces résultats ont démontré que le bio Canon A était inhibiteur de la croissance de see stickland eye, mais que le form aone Nein ne l'était pas. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la technique est souple.

D'autres micro-organismes d'essai peuvent être utilisés à condition de choisir des milieux appropriés et d'inclure des contrôles afin de s'assurer que la chimie de séparation et la méthode de détection sont compatibles avec cette procédure. D'autres techniques, telles que la chromatographie liquide à haute performance et la spectrométrie de masse, peuvent être utilisées pour aider à caractériser les composés antimicrobiens identifiés dans un bioessai.