Name: Technique de Subnormothermic Ex Vivo Foie de perfusion pour lentreposage, de lévaluation et de réparation des marginaux greffes du foie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez la perfusion sous-normothermique ex vivo du foie pour préserver et évaluer les greffes marginales avant transplantation. Cette technique réduit les lésions de conservation et permet une évaluation fonctionnelle.

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L&#39;étude a été financée par des subventions de recherche de la Roche Organ Transplant Research Foundation (ROTRF) et Astellas. Markus Selzner a été soutenue par une bourse de développement de carrière ASTS. Matthias Knaak a été soutenue par la Bourse Astellas recherche. Nous remercions Uwe Mummenhoff et la famille Birmingham pour leur généreux soutien.

Un aperçu schématique du protocole est présenté dans la figure 1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig1highres.jpg" /> Figure 1: protocole de l&#39;étude. L&#39;étude de conception porcine de l&#39;atteinte hépatique est basé sur un don après le décès cardiocirculatoire (DDC) modèle. Après dissection de tous les vaisseaux du foie, la mort cardiaque est induite suivie par 45 minutes d&#39;échauffement greffon ischémie. Pour simuler un transport de greffe entre les hôpitaux de donateurs et bénéficiaires dans un contexte clinique, la greffe est stocké sur de la glace pendant 4 heures après le froid, à double chasse. Après un stockage à froid, l&#39;organe est perfusé subnormothermic pendant 6 heures afin d&#39;évaluer la stabilité de la perfusion. Dans un modèle de greffe, le temps de perfusion pourrait être plus court afin de recharger le stockage d&#39;énergie et d&#39;évaluer la viabilité de l&#39;organe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer il</a>re pour voir une version plus grande de cette figure. 1. Animaux REMARQUE: porcs mâles Yorkshire, 30-35 kg, ont été utilisés pour cette étude. Tous les animaux reçoivent des soins humains en conformité avec les «« Principes de protection des animaux de laboratoire »» formulées par la Société nationale pour la recherche médicale et le «Guide pour le soin des animaux de laboratoire» »publié par les National Institutes of Health. Le Comité de la Toronto General Research Institute de protection des animaux a approuvé toutes les études. 2. prélèvement d&#39;organes <ol><li> Maison mâles Yorkshire porcs dans des installations de recherche pour 1 semaine avant la perfusion / transplantation afin de réduire le niveau de stress et pour habituer les animaux à des conditions de logement. Moins de 2 jours de logement à l&#39;intérieur de l&#39;installation conduiront à une réaction physique induite par le stress, ce qui peut modifier l&#39;issue de la perfusion 22,23. </li><li> Anesthésier porcspar une voie intramusculaire (im) d&#39;injection d&#39;un mélange de kétamine (25 mg / kg), de l&#39;atropine (0,04 mg / kg), et de midazolam (0,15 mg / kg). </li><li> Avant l&#39;intubation, assurer le cochon respire spontanément 2 L d&#39;O 2 dosé à 5% d&#39;isoflurane. Vaporiser les cordes vocales avec 2% de lidocaïne 2 min avant l&#39;intubation pour éviter les spasmes des cordes vocales. Par exemple, pour un 35 kg cochon utiliser un 6.5 fr. tube trachéal. Bloquer le tube trachéal avec 3-5 ml d&#39;air de la pièce. </li><li> Après l&#39;intubation, utilisez capnométrie pour confirmer correct intubation. Abaissez le gaz isoflurane à 2%. Réglez le ventilateur à 14-16 respirations / min et un volume courant de 10 ml / kg de poids corporel. </li><li> Placez un 20 G par voie intraveineuse (iv) cathéter dans une veine de l&#39;oreille afin de permettre la perfusion de solution de lactate de Ringer (200 ml par heure). Puis frottez le porc et le couvrir avec des draps stériles. </li><li> Faire une incision médiane suivie d&#39;une extension latérale gauche. Utilisez une serviette pour couvrir de grandes et petites entrailles et les déplacer vers le côté gauche. </li><li> Infe séparéerieur de la veine cave (IVC) et de l&#39;aorte distale par rapport à l&#39;autre; branches de l&#39;aorte ligaturer à l&#39;arrière; isoler et artères rénales gratuits de tissu adhérent. </li><li> Diviser le ligament falciforme et du ligament triangulaire aide de la coagulation. </li><li> Relâchez la veine porte par une incision du péritoine entre le pancréas et la veine porte. Nouez les veines de drainage du pancréas à la veine porte. </li><li> Disséquer le tronc cœliaque dessous de la veine porte et de le suivre vers l&#39;arrière à l&#39;aorte. Entourez l&#39;artère mésentérique avec une cravate 2-0; entourer les artères splénique et gastrique gauche, qui branche postérieure au tronc cœliaque. Disséquer le tronc cœliaque au large de la veine porte. </li><li> Ligaturer les vaisseaux lymphatiques au sein de l&#39;épiploon pour empêcher une fuite lymphatique. Diviser l&#39;artère gastrique droite entre les liens. Ligaturer les petites veines. Séparer la voie biliaire du ligament et le diviser distale après la ligature. </li><li> Disséquer l&#39;aorte derrière la membrane entre le cœur et coeliaque trunk; placer une cravate 2-0 autour de l&#39;aorte. </li><li> Relâchez le foie de la veine inférieure sur le côté droit en utilisant la cautérisation électro; utiliser des ciseaux pour la partie supérieure entre cave et le foie. </li><li> Retirer la vésicule biliaire et cautériser les purgeurs de lit de la vésicule biliaire. </li><li> Administrer iv 1000 UI / kg de poids du donneur de l&#39;héparine. Pour un modèle DCD, provoquer un arrêt cardiaque par injection intracardiaque de 40 mEq de KCl 3 minutes après l&#39;administration d&#39;héparine. Arrêt cardiaque définir comme point d&#39;ischémie chaude de départ. </li><li> Pour la perfusion, de recueillir 1,6 L de sang de porc dans des sacs CPDA (citrate, phosphate, dextrose, l&#39;adénosine) immédiatement après la mort cardiaque. Effectuer un lancement douce (2000 xg sans frein). Retirez le plasma et la couche leuco-plaquettaire dans des conditions stériles (biosécurité de classe II armoire) et stocker les érythrocytes en CPDA sacs pour transfusion. </li><li> Cathétériser veine porte et de l&#39;aorte avec des lignes de chasse d&#39;organes. Nouez les liens déjà établis autour du fémur, rénale, splénique, mésentérique, et l&#39;art gastrique gaucheé rie ainsi que l&#39;aorte supérieure. Pour un modèle cœur battant donneur (DBC), effectuer la ponction de l&#39;aorte et la veine porte dans des conditions de battement de coeur. </li><li> Après 45 minutes d&#39;ischémie chaude, rincez le foie avec l&#39;Université du Wisconsin (UW) solution utilisant double perfusion par l&#39;aorte (sac de pression) et la veine porte (par gravité). </li><li> Couper le foie du porc, laissant tous les navires restants de long. </li><li> Lors de la préparation de back-table, serrer la VCI supérieur à l&#39;aide d&#39;une pince Satinsky et rincer le foie une deuxième fois avec environ 0,5 L de solution UW rétrograde par IVC inférieure jusqu&#39;à ce que la sortie de la veine porte est clair. </li><li> Nouez les branches artérielles de l&#39;aorte et du tronc coeliaque. Effectuez une pression artérielle perfusion retour table avec environ 0,5 L de solution UW. </li><li> Rincer la voie biliaire en utilisant la solution UW. </li><li> Cathétériser les parties supérieure et inférieure de la veine cave inférieure en utilisant 1/2 &quot;x 3/8&quot; Luer Lock avec réducteurs; cathétériser la veine porte et l&#39;artère hépatique par 3/8 &quot;; x 1/4 &quot;et 1/4&quot; x 3/8 &quot;avec réducteurs Luer Lock. Utilisez la veine cave supérieure et inférieure comme le drainage veineux. </li><li> Placer le foie dans un sac d&#39;organes, fermer le sac d&#39;organes, et stocker le foie sur la glace jusqu&#39;à ce que la perfusion a commencé. </li></ol> 3 Liver perfusion ex vivo <ol><li> Préparer la solution de perfusion contenant une solution de 2,000 ml Steen, 400 ml lavé les erythrocytes, 550 pyruvate de sodium mg, 100 ml aminés solution acide (10% Travasol), 10 mg de gluconate de calcium, 1,000 IE action rapide de l&#39;insuline, de 1 g de céfazoline, 500 mg de métronidazole, et 10 000 UI d&#39;héparine. Ajouter d&#39;autres molécules pour la vasodilatation, l&#39;immunosuppression, la récupération des espèces réactives de l&#39;oxygène, ou le traitement de cellules de foie sur la base du protocole de l&#39;étude particulière. </li><li> Pour la composante de dialyse, utilisez dialysat standard contenant 3,5 potassium mM, bicarbonate 25, 27 mM de glucose, ainsi que 275 mg / L de pyruvate. </li><li> Mettre en place le circuit de perfusion (schéma voir Figure 2). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig2highres.jpg" /> Figure 2 Circuit mis en place. Venant du réservoir principal comme le point de départ et à la fin, la solution de perfusion est entraînée par une pompe centrifuge à travers un oxygénateur. Immédiatement après l&#39;oxygénation de la solution, le circuit se sépare en une ligne plus petit fonctionnant à une unité de dialyse pour l&#39;homéostasie électrolyte et une plus grande ligne allant à un filtre de leucocytes pour la réduction du nombre de globules blancs (WBC) restantes. La solution qui traverse le dialyseur retourne vers le réservoir principal. Après la filtration des leucocytes, le circuit se sépare à nouveau en deux lignes égales. Une ligne fonctionne à haute pression (environ 60 mmHg) directement dans l&#39;aorte à l&#39;artère hépatique perfuser. L&#39;autre ligne se déverse dans un second réservoir. De ce réservoir de la veine porte est perfusé. La pression de la perfusion portale dépend de l&#39;énergie de l&#39;élévation du niveau de la solution de réservoir (environ 2-6 mm de Hg). Tous les liquides sont drained via l&#39;infrastructure et supra-hépatique veine dans le réservoir principal. Pour la réduction de la gravité et de la perfusion homogène, le foie est placé dans une piscine remplie d&#39;eau à température régulée. Il est séparé de l&#39;eau par une membrane imperméable et il nage dans une suspension de perfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol><li> Recueillir tous les fluides du circuit dans un 3 L réservoir (réservoir principal) et serrer la sortie. </li><li> Connectez la sortie à une pompe centrifuge suivie par un oxygénateur commerciale. </li><li> Derrière l&#39;oxygénateur, diviser le tube en 2 lignes. Connectez une ligne à un dialyseur et égoutter dans le réservoir principal. Connectez le deuxième ligne à un filtre de réduction des leucocytes. </li><li> Scinder la ligne en aval du filtre de réduction des leucocytes dans une ligne artérielle, qui fournit une solution de perfusion de l&#39;artère hépatique, et un portail vligne voir local distribuer la solution de perfusion à un second réservoir, qui se jette dans la veine porte par gravité sortie. Fixer l&#39;entrée du portail. </li><li> Connectez la ligne artérielle à une ligne de la veine cave se déverse dans le réservoir principal de recueillement fluide. </li><li> Pour la collecte de l&#39;ascite ou de fuite de solution de perfusion à partir du foie, préparer une conduite d&#39;aspiration reliée au réservoir principal. </li></ol></li><li> Relâcher la pince de sortie du réservoir principal et remplir le circuit avec la solution de perfusion. Démarrer la pompe centrifuge à 1500 tours / min. La solution de perfusion sera de traverser la ligne artérielle dans la ligne de la veine cave dans le réservoir principal. Assurez-vous que tout l&#39;air est chassé du circuit. </li><li> Ouvrir l&#39;alimentation de gaz à l&#39;oxygénateur. </li><li> Sortez le foie hors de la glace. Rincer la solution UW utilisant une solution saline. </li><li> Placer le foie, avec son côté convexe vers le bas pour faciliter l&#39;accès aux navires, de préférence dans un environnement sans pesanteur, afin d&#39;évitercompression d&#39;organes à la surface de contact. Utilisez un bain d&#39;eau à la chaleur et pouvant être refroidi. Régler la température à partir du bain de circuit et de l&#39;eau à 20 ° C. Couvrir le bain d&#39;eau avec une membrane imperméable et placer le foie sur cette membrane. Réduire la gravité compression conduit en immergeant le foie avec une solution de perfusion. </li><li> Réduire la vitesse de la pompe centrifuge à 1000 tours / min et placer deux pinces à la connexion de artériels et veine lignes de cava. Ensuite, coupez le tuyau entre les pinces. Utilisation d&#39;un connecteur à 3 voies, joindre les deux sorties cava et de les relier à la ligne de la veine cave. </li><li> Dégagez le collier de la ligne artérielle, verser la solution de perfusion dans la canule artérielle de se débarrasser de bulles, et relier la ligne à la canule. Augmenter la pompe centrifuge à 1500 tours / min. Relâchez la deuxième pince de la ligne de la veine cave. </li><li> Relâchez le collier du réservoir veineux portal pour le remplir. Laissez la solution de perfusion verser dans le Cannu portailla et branchez-le. Faites attention de niveaux de liquides stables dans le réservoir du portail. </li><li> Connectez lignes de pression pour les serrures Luer des canules artérielle, portail, et la veine cave. </li><li> Pour reproduire les conditions physiologiques, appliquer des traitements dans le droit navire. Injecter glucose dans la veine porte et non dans la ligne artérielle afin d&#39;établir un gradient imitant un portail gradient de glucose veineux et induisant une augmentation de la synthèse du glycogène 24,25. </li><li> Après avoir relié le circuit à la foie, élever la température à 33 ° C dans les 60 min. </li><li> But pour un départ flux artériel à environ 250 ml / min à 40 mmHg. Cela peut atteindre 700 ml / min au cours de la perfusion une fois que la pression est augmentée jusqu&#39;à 70 mmHg. </li><li> À la température de départ, viser un flux de veine porte de 500-600 ml / min à 3-5 mmHg. Après élévation de la température, surveiller le flux veineux portal, qui augmentera jusqu&#39;à 1100 ml / min à 4-6 mmHg. Evitez de dépasser la pression portale ci-dessus Physiological valeurs (environ 8 mmHg) pour protéger fenestrations sinusoïdales 26. Evitez de dépasser le débit total supérieur à 2000 ml / min afin d&#39;éviter d&#39;endommager l&#39;organe. Régler la sortie de -2 mmHg en abaissant le réservoir principal pour éviter la congestion du foie par l&#39;obstruction de sortie fonctionnelle. </li><li> Ajouter le composant de dialyse dans le circuit afin d&#39;équilibrer la solution de perfusion 27 à des valeurs prédéterminées. Régler le débit de dialysat de 500 ml / h. Prendre une attention particulière à ajuster le débit de dialyse de sorte que la solution de perfusion est ni dilué ni concentrée. Dans la première heure de perfusion au réservoir principal doit être visionnée attentivement! </li><li> D&#39;assurer une oxygénation du tissu homogène pour récupérer et maintenir la fonction des organes à l&#39;aide d&#39;un composant principal d&#39;un mélange gazeux de O 2 (95-98%) et de CO 2 (2-5%). Utilisez gaz variable au cours de la perfusion depuis le foie modifie son métabolisme et sa demande de pH pendant la perfusion. </li><li> Maintenir un pH bas pendant le démarrage deperfusion pour protéger l&#39;organe en utilisant le concept paradoxe de pH 28 et d&#39;éviter de graves lésions tissulaires qui peuvent résulter d&#39;une connexion rapide à pH physiologique sous la réoxygénation, puisque, après stockage dans la solution UW, l&#39;organe a un pH acidose inférieur à 7 Régler la pression partielle de CO 2 en continu vers le bas à 25-30 mmHg sorte que le pH atteigne un niveau physiologique à 1 h. </li><li> Ajouter le bicarbonate de sodium ou de potassium dans le circuit pour obtenir une concentration physiologique de bicarbonate standard dans la solution de perfusion. Injecter le délicatement sous un gaz du sang répétitif et le contrôle de l&#39;électrolyte. </li><li> Surveiller la perfusion par périodique des gaz du sang veineux et artériel et AST analyses. La PO 2 veineuse reste au-dessus de 175 mmHg au cours de la perfusion. Contrôler le débit et la pression vasculaire et noter une perfusion stable par une résistance vasculaire constante. </li><li> Gardez le système de perfusion stable jusqu&#39;à 8 h. A la fin de la période d&#39;ex vivo la perfusion, coolle système de perfusion à 20 ° C et, après avoir débranché le tuyau de circuit à partir du foie, rincer la solution de perfusion sur le foie doublement avec une solution glacée de UW froid. Conservez le foie une fois de plus mis sur la glace dans un sac d&#39;organes stérile. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Dans un modèle de cochon qui imite DCD transplantation du foie, nous avons démontré que la perfusion du foie subnormothermic avec un résultat cellulaires de la solution de perfusion dans les paramètres de perfusion stable, une lésion minimale des hépatocytes et le métabolisme hépatique active. Notre perfusion subnormothermic mis en place s&#39;est avéré récupérer une homéostasie hépatocellulaire et le métabolisme. stockage de glycogène est restauré et les métabolites sont rejetés. Ex vivo la perfusion du foie en tant que technique de conservation propose pour la première fois la possibilité d&#39;évaluer les marqueurs de la fonction du greffon et des blessures au cours de la conservation des organes avant la transplantation et. A côté de l&#39;évaluation macroscopique de l&#39;homogénéité greffe de perfusion, les valeurs de débit constituent un bon indicateur de la viabilité de la greffe et l&#39;étendue de la lésion ischémique, il avait souffert plus tôt 29. La consommation d&#39;oxygène et la production de bile sont des marqueurs de la fonction métabolique. Les niveaux d&#39;enzymes hépatiques comme AST peuvent être utilisées pour queSess le degré et la dynamique des lésions hépatocellulaires 30. Cette évaluation de greffe approfondie peut permettre une discrimination fiable entre les organes transplantables marginaux et non transplantables. Nous avons choisi une température subnormothermic de 33 ° C dans le système de perfusion en raison de la température est suffisante pour permettre ainsi que le métabolisme de l&#39;ATP et la synthèse de glycogène. Dans le même temps, il fournit une demande en oxygène diminué par rapport aux paramètres de perfusion normothermique qui offre une sécurité supplémentaire contre une lésion ischémique. En général, les températures de perfusion est supérieure à 30 ° C ont montré pour réduire au minimum les lésions ischémiques froid et fournir suffisamment de 31 l&#39;activité métabolique. Contrairement à d&#39;autres groupes, nous n&#39;avons pas utilisé le sang entier comme solution de perfusion, mais une solution d&#39;albumine normo-osmotique (Steen) avec des globules rouges lavés et filtrés. En excluant les composants du plasma ainsi que les thrombocytes et les leucocytes, la solution de perfusion est designé pour minimiser les signaux pro-inflammatoires au cours de la perfusion ex vivo. En plus de l&#39;évaluation de la greffe, les conditions de perfusion stable pendant plusieurs heures permettent le traitement de greffage. De nombreuses molécules sont révélés atténuer la lésion de reperfusion dans des conditions expérimentales 32. Cependant, presque aucun régime de traitement a fait son chemin dans la pratique clinique, encore. Une raison semble être le manque de possibilités d&#39;appliquer ces traitements pendant l&#39;entreposage à froid. Un foie métaboliquement active sur un ex vivo système de perfusion est optimal pour l&#39;application de tout type de traitement. A cet égard, non seulement pour améliorer les conditions des traitements de reperfusion comme l&#39;atténuation de l&#39;activité des cellules de Kupffer ou de balayage d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène sont envisageables mais également des traitements comme la thérapie génique pour conditionner le greffon, par exemple, contre l&#39;hépatite C récurrence. D&#39;autres stratégies pourraient comprendre la réduction de la stéatose au cours de la perfusion ex vivopériode 33. En résumé, ex vivo la perfusion du foie est une nouvelle stratégie pour réduire au minimum les lésions ischémiques froid et à évaluer les greffes de foie marginaux avant la transplantation du foie. Le réglage de perfusion ex vivo donne l&#39;occasion unique de réparer et de l&#39;état des greffes avant la transplantation.

La transplantation hépatique est la seule option de traitement pour les patients atteints d&#39;une maladie du foie en phase terminale ou d&#39;un carcinome hépatocellulaire avancé. Pour les 25 dernières années, le nombre de candidats sur liste d&#39;attente a progressivement augmenté et dépassé le nombre de greffons disponibles. Le nombre de donateurs battant cardiaques a diminué au cours de la dernière décennie. Dans le même temps, le nombre de greffes marginales, telles que le don après décès cardiocirculatoire (DDC), ainsi que les anciens et les foies gras ont augmenté de 1,2. Greffons marginaux sont souvent diminué de transplantation hépatique en raison du risque plus élevé de greffe fonction principale défaut ou de retard. Dans greffes DCD, le développement des sténoses biliaires de type ischémique (ITB) est particulièrement préoccupant. Avec la technique classique de conservation par le froid statique, ITBS se produisent dans environ 10-40% des greffes DCD. Dans la majorité des patients, ITBS conduit de re-transplantation ou la mort du patient. Surtout durée de l&#39;ischémie chaude et froide sont prolongées risquefacteurs de ITBS 7.3. L&#39;âge du donneur, les prédispositions génétiques (comme delta CCR5 32), et le choix de la solution de conservation ont également été discutés comme facteurs de risque supplémentaire 7-10. Microthrombose partielle des vaisseaux péribiliaires a été suggérée comme mécanisme potentiel pour ITBS après transplantation hépatique avec DCD greffe 11. Avant l&#39;introduction clinique de la transplantation hépatique, ex vivo perfusions de foie ont été utilisées pour étudier le métabolisme hépatique et la physiologie 12,13. Après la transplantation du foie a trouvé son chemin dans le milieu clinique dans les années 1960, d&#39;innombrables tentatives ont été faites pour utiliser ex vivo perfusion du foie comme une méthode de conservation en imitant les conditions de nutrition et d&#39;oxygénation physiologiques. Son utilité pour la conservation des greffons marginaux a été étudiée dans la dernière décennie, mais il n&#39;a pas atteint les soins cliniques standard. Nous avons récemment décrit une réduction des lésions des voies biliaires dans DCD transplantation hépatique par ex vivo perfusé préservation 14. Différentes approches relatives à la solution de perfusion ont été faites. La sélection varie de solutions cellulaires comme le sang total de l&#39;animal donneur ou de globules rouges en combinaison avec du plasma humain, à des approches acellulaire comme la machine de l&#39;Université de Wisconsin solution, solution IGL, ou solution Steen 14-19. La température varie de 4 à 37 ° C 20. La nomenclature en hypothermie, subnormothermic, et normothermie est très variable et incohérente. Tous les différentes techniques, les solutions et les réglages de température visent à 1) conditions de perfusion stables, 2) oxygénation suffisante, et 3) le rétablissement de la fonction des organes. Une capacité de conservation améliorée ainsi que la capacité d&#39;évaluation et de traitement organe pendant la perfusion normothermique et subnormothermic visages complexité et les coûts par rapport à la perfusion hypothermique 20,21 technique supérieur. Nous avons développé un système ex vivo de la perfusion du foie subnormothermic au cours des 4 dernières années. Le système peut être utilisé pour 1) «recharger» le contenu énergétique hépatique, 2) d&#39;évaluer la qualité de la greffe, et 3) la réparation des foies marginaux avant la transplantation. Le protocole suivant contient toutes les informations pour une perfusion hépatique stable.

<table><tbody><tr><td>circuit</td><td>Maquet (Hirrlingen, GER)</td>réservoir principal <td>sur mesure</td><td>(3 L, 3/8" sortant) 
Réservoir à portique (1,5 L, 1/4", sortant) 
pompe centrifuge 
Oxygénateur 
filtre à lycocytes </td></tr><tr><td>Tubes (1/4 » x 1/16 »)</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7506</td><td></td></tr><tr><td>Tubes (3/8 » x 3/32 »)</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td>MED7536</td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs de tubes</td><td>Raumedic (Helmbrechts, GER)</td><td></td><td>différentes tailles</td></tr><tr><td>Filtre de dialyse, Optiflux F160NR</td><td>Fresenius Medical Care (Waltham, MA)</td><td>F160NR</td><td></td></tr><tr><td>STEEN solution</td><td>XVIVO (G&ouml ; teborg, SWE)</td><td>19004</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Concentré d’acide de dialyse A</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>D12188M</td><td>45 ml</td></tr><tr><td>Acide aminé, Travasol 10 %</td> <td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB6760</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P2256</td><td>1,1 g</td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)</td><td>10750</td><td>40 000 iU</td></tr><tr><td>de calcium gluconate</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON)</td><td>C31110</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Insuline à action rapide</td><td>divers fournisseurs</td><td></td><td>1 000 iU</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>divers fournisseurs</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>Métronidazole</td><td>Baxter (Mississauga, ON)</td><td>JB3401</td><td>500 mg</td></tr></tbody></table>

technique de subnormothermic<em&gt; ex vivo</em&gt; foie de perfusion pour l&#39;entreposage, de l&#39;évaluation et de réparation des marginaux greffes du foie

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Le succès de la transplantation hépatique a entraîné une pénurie d&#39;organes dramatique. Dans la plupart des régions de transplantation 20-30% des patients sur la liste d&#39;attente pour une transplantation du foie meurent sans avoir reçu une greffe d&#39;organe ou sont retirées de la cote de progression de la maladie. Une stratégie visant à accroître le nombre de donneurs est l&#39;utilisation de greffons marginaux, tels que les foies gras, les greffes de donneurs plus âgés, ou don après la mort cardiocirculatoire (DDC). La technique de conservation actuel de stockage statique à froid est seulement mal toléré par les foies marginaux résultant en des dommages aux organes importants. En outre, le stockage à froid statique d&#39;organes ne permet pas une évaluation de greffe ou de réparation avant la transplantation. Ces lacunes de la préservation froid statique ont déclenché un intérêt pour la conservation d&#39;organes perfusés chaud pour réduire les blessures d&#39;ischémie froide, évaluer les greffes de foie en cours de conservation, et d&#39;explorer la possibilité de réparer les foies marginaux avant la transplantation. Les pres optimaleset que les conditions d&#39;écoulement, la température de la perfusion, de la composition de la solution de perfusion et de la nécessité d&#39;un transporteur d&#39;oxygène a été controversé dans le passé. En dépit des résultats prometteurs dans plusieurs études animales, la complexité et les coûts ont empêché une application clinique plus large à ce jour. Récemment, avec la technologie améliorée et une meilleure compréhension de la physiologie du foie pendant la perfusion ex vivo le résultat de chaud perfusion du foie s&#39;est amélioré et toujours de bons résultats peuvent être atteints. Ce document fournira des informations sur la récupération du foie, des techniques de stockage, et isolé la perfusion du foie chez les porcs. Nous allons illustrer a) les exigences pour assurer l&#39;approvisionnement en oxygène suffisante pour l&#39;orgue, b) les considérations techniques sur la machine de perfusion et la solution de perfusion, et c) les aspects biochimiques des organes isolés.

Ci-dessous, nous présentons les résultats de 5 expériences de perfusion avec DCD-greffes après 45 réchauffement min et 4 h ischémie froide avant le début de la perfusion ex vivo subnormothermic. L&#39;objectif principal pour un ex vivo perfusion du foie est d&#39;assurer un apport suffisant en oxygène à l&#39;orgue. L&#39;ischémie provoque une vasoconstriction, ce qui augmente la résistance à la perfusion. La réalisation de flux vasculaires constants avec des pressions stables est un bon indicateur de l&#39;oxygénation adéquate. Pendant une période d&#39;induction de 1 à 2 heures, la solution de perfusion et de l&#39;organe sont chauffés jusqu&#39;à 33 ° C, ce qui décède la résistance vasculaire du foie. Une fois la température cible de 33 ° C est atteinte, les valeurs de flux de niveau à un intervalle constant, presque physiologique pour le reste de la durée de perfusion de 6 heures (figures 3A-3D). Dans le même temps, l&#39;organe est métaboliquement active. Figure 4A montre la pO veineux &lt;sub&gt; 2, un marqueur de la consommation d&#39;oxygène. Dans le 2 initiale h les veineux pO 2 baisse à un plateau constant. A cet état, métaboliquement active, le foie commence à produire de la bile (figure 4B). Le dialyseur fournit une homéostasie électrolytique équilibrée (figures 4C-4D). Une hyperkaliémie initiale est rapidement nivelé. Mesure de l&#39;AST ligne sert de contrôle des dommages hépatocellulaires. Figure 5 est affiché à une augmentation linéaire peu profonde AST au-dessus de la totalité de la période de perfusion. Coloration H &amp; E après 6 heures de perfusion révèle une nécrose des hépatocytes &lt;5% avec un lobulaire intact et la structure sinusoïdale (figure 6). Coloration PAS au même point dans le temps montre réapprovisionné stockage du glycogène cellulaire par rapport au stockage épuisés DCD-greffes conservés froid (figure 7). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig3highres.jpg" /> Figure 3: des flux de perfusion et de la pression (n = 5, les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type). (A, B) artère hépatique (HA) de débit et de pression: Pendant la phase de réchauffement dans le 1-2 premières heures, le débit augmente à des pressions stables et est constante par la suite. Au vu de la pression de la veine porte décroissant (C), l&#39;augmentation de l&#39;écoulement HA vers la fin de la perfusion peut être une réaction d&#39;autorégulation du foie. (C, D) La veineuse portale (PV) des augmentations de débit correspondant au débit HA pendant les 2 premières heures de réchauffement. Les pressions restent relativement stables. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig4highres.jpg" /> Figure 4: Surveillance des paramètres (n = 5, les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type). (A) Le pO veineuse 2 en tant que marqueur de la demande en oxygène diminue et l&#39;activité métabolique au sein de la phase initiale de chauffage en raison de cellula activér métabolisme; il reste stable après (B) la production de la bile en tant que marqueur de l&#39;activité métabolique commence à des températures autour de 30 ° C et, donc, entre la première et la deuxième heure de perfusion (C, D) Le dialyseur électrolyte assure l&#39;homéostasie..; une hyperkaliémie initiale est rapidement équilibrée. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig5highres.jpg" /> Figure 5 AST (n = 5, les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type) AST est un marqueur sensible de lésion hépatocellulaire. l&#39;augmentation peu profonde suggère aucune blessure importante au cours de la perfusion ex vivo. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig6highres.jpg" /> Figure 6 coloration H &amp; E (20X). (A) échantillon Sham du foie avant ischémie chaude, un lobule du foie représentant de architectur intacte (B). échantillon de foie après 45 min d&#39;ischémie chaude, 4 heures d&#39;ischémie froide, et 6 h de perfusion subnormothermic, l&#39;architecture lobulaire est intact sans nécrose et qu&#39;un gonflement cellulaire minimal, les espaces sinusoïdaux sont légèrement dilatés par rapport à la échantillon imposture.

Greffons marginaux, tels que les foies gras, les greffes de donneurs plus âgés, ou des foies prélevés après la mort cardiocirculatoire (DDC) tolèrent, stockage statique classique froide mal. Nous avons développé un nouveau modèle de subnormothermic ex vivo perfusion du foie pour la conservation, l&#39;évaluation et la réparation des greffes de foie marginaux avant la transplantation.

Technique de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Foie de perfusion pour l&#39;entreposage, de l&#39;évaluation et de réparation des marginaux greffes du foie

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Le but de cette procédure est de préserver et d’évaluer une greffe de foie dans des conditions quasi physiologiques. Pour ce faire, on récupère d’abord la greffe de foie d’un porc donneur. Dans un deuxième temps, le foie est canulé, puis le greffon est connecté au circuit de perfusion ex vivo.Dans la dernière étape, les propriétés de perfusion et les caractéristiques du greffon hépatique sont surveillées pendant le temps de perfusion souhaité. En fin de compte, les taux d’aspartate aminotransférase ou d’un ST et les analyses histologiques des biopsies parenchymateuses sont utilisés pour montrer la préservation de la lésion et la viabilité de la greffe hépatique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes de conservation existantes, comme le stockage statique, est que la conservation dans des conditions physiologiques entraîne moins de dommages de conservation et permet l’évaluation fonctionnelle et le traitement du greffon avant la transplantation d’organe proprement dite.Immédiatement après avoir induit la mort cardiaque par l’administration de chlorure de potassium, prélever 1,6 litre de sang d’un porc Yorkshire mâle de 30 à 35 kilogrammes dans des sacs CPDA fermer l’abdomen, laisser le foie intra abdominal pendant 45 minutes pour induire une lésion ischémique chaude immédiatement avant la fin de l’ischémie chaude. Time canuler l’aorte et la veine porte avec des lignes de rincage d’organe à ce moment également. Utilisez une double perfusion par pression de l’aorte et des sacs portiques entraînés par gravité pour rincer le foie avec la solution de l’Université du Wisconsin.Ensuite, coupez le foie du porc, en laissant tous les vaisseaux restants et placez-le dans un sac d’organes. Canulez les parties supra et infra hépatiques de la veine inférieure avec des réducteurs d’un demi-pouce sur trois huitièmes de pouce avec un verrou de leurre. Canulez la veine porte et l’artère hépatique avec trois huitièmes de pouce sur quart de pouce et un quart de pouce sur trois huitièmes de pouce.Réduit également avec un verrouillage de leurre à ce moment-là. Fermez ensuite le sachet et conservez le foie sur de la glace jusqu’à la perfusion. Pour mettre en place le circuit de perfusion ex vivo, connectez l’écoulement d’un réservoir principal à une pompe centrifuge et à un oxygénateur commercial derrière l’oxygénateur.Divisez le tube en deux lignes. Connectez une conduite à un dialyseur qui s’écoule dans le réservoir principal. Connectez l’autre ligne à un filtre de réduction des leucocytes.Divisez la ligne après la réduction leucocytaire Filtre en une ligne artérielle pour fournir la perfusion huit à l’artère hépatique et en une ligne veineuse porte pour délivrer la perfusation huit à un deuxième réservoir qui s’écoule dans la veine porte par écoulement par gravité. Clampez l’entrée du portail, puis connectez la ligne artérielle à une boucle de caverneuse veineuse s’écoulant dans le réservoir principal. Pour la récupération du liquide, réglez la température de départ du circuit et du bain-marie à 20 degrés Celsius.Ensuite, couvrez le bain d’une membrane imperméable pour recueillir l’ascite ou les fuites du huit perfusé. Connectez une conduite d’aspiration entraînée par une pompe à rouleaux au réservoir principal. Relâchez ensuite la pince de sortie du réservoir principal et remplissez le circuit avec la solution de perfusion.Démarrez la pompe centrifuge à 1 500 coups par minute, en vous assurant que tout l’air est chassé hors du circuit. Ouvrez ensuite l’alimentation en gaz de l’oxygénateur. La connexion du foie au circuit est la partie la plus délicate de la procédure.Prenez soin d’éviter de plier le tube et d’éliminer les bulles pour éviter d’entraver l’écoulement du foie. Le niveau du réservoir à porte doit également être suivi attentivement. Il ne doit jamais fonctionner à vide.Retirez le foie de la glace et rincez la solution de l’Université du Wisconsin avec une solution saline. Placez ensuite le foie sur la membrane au-dessus du bain-marie. Réduisez la vitesse de la pompe centrifuge à 1000 coups par minute et placez deux pinces sur le côté artériel de la boucle de la veine caverneuse.Ensuite, coupez le tube entre les pinces et connectez les deux sorties de la veine caveuse à la conduite de la veine caverneuse. Relâchez la pince de la ligne artérielle. Versez du perfuse huit dans la canule artérielle pour éliminer les bulles et connectez la ligne à la canule.Augmentez la pompe centrifuge à 1 500 coups par minute et relâchez la deuxième pince de la ligne de la grotte de Venner et relâchez la pince du réservoir veineux porte pour le remplir. Laissez la solution de perfusion se verser dans la canule porte, puis connectez-la. En prenant soin de maintenir les niveaux de liquide dans le réservoir à porte stables.Après avoir connecté le foie au circuit, augmentez la température du bain-marie à 33 degrés Celsius au cours des 60 prochaines minutes. Visez un débit artériel de départ d’environ 250 millilitres par minute à 40 millimètres de mercure. Celle-ci peut atteindre 700 millilitres par minute pendant la perfusion.Une fois que la pression est augmentée jusqu’à 70 millimètres de mercure, visez un écoulement veineux de 500 à 600 millilitres par minute à trois à cinq millimètres de mercure. Après avoir augmenté la température, le débit veineux de l’orifice augmentera jusqu’à 1 100 millilitres par minute. Abaissez le réservoir principal pour régler le débit sortant à moins deux milligrammes de mercure afin d’éviter la congestion hépatique par obstruction fonctionnelle de l’écoulement, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est prise dans le tube de cavalage.Réglez le débit de dialyse huit à 500 millilitres par heure. En prenant soin d’ajuster le débit sortant de dialyse pour que le PERFUSE eight ne soit ni dilué, ni concentré. Maintenez un pH bas pendant le début de la perfusion pour protéger l’organe.Ajuster la pression partielle du dioxyde de carbone en continu jusqu’à 25 à 30 millimètres de mercure afin que le pH atteigne un niveau physiologique en une heure. Pour imiter les conditions physiologiques, injectez continuellement du glucose et de l’insuline dans la veine porte. Injectez soigneusement du bicarbonate de sodium ou de potassium dans le circuit sous un contrôle répétitif du sang, des gaz et des électrolytes, et surveillez la perfusion par des analyses périodiques des gaz du sang veineux et artériel et un ST.Surveillez le débit vasculaire et la pression. Une perfusion stable maintiendra une résistance vasculaire constante à la fin de la période de perfusion ex vivo. Appelez le système de perfusion en panne, puis après avoir déconnecté le tube du foie, rincez le PERFUSE huit doublement hors du foie avec une solution glacée de l’Université du Wisconsin.Enfin, conservez le foie sur de la glace dans un sac d’organe stérile avant la transplantation. L’obtention de débits vasculaires constants avec des pressions stables est un bon indicateur d’une oxygénation adéquate. Une fois que la température cible de 33 degrés Celsius est atteinte, les valeurs de débit se situent à une échelle constante, presque physiologique, pour le reste de la période de perfusion, en même temps que l’organe devient métaboliquement actif.Ce graphique montre la pression partielle veineuse d’oxygène, un marqueur de la consommation d’oxygène. Au cours des deux premières heures, la pression partielle veineuse d’oxygène diminue jusqu’à un plateau alors constant. À cet état métaboliquement actif, le foie commence à produire de la bile et le dialyseur fournit une homéostasie électrolytique équilibrée.La mesure en ligne A ST sert de moniteur des lésions cellulaires hépatiques. Par exemple, dans cette expérience, seule une faible augmentation de A ST sur toute la période de perfusion est observée. Les colorations H et E après six heures de perfusion révèlent une nécrose hépatocytaire inférieure à 5 % avec une structure lobulaire et sinusoïdale intacte.La coloration BAS d’un foie perfusé ex vivo au même point de temps démontre un stockage de glycogène cellulaire réapprovisionné par rapport au stockage épuisé observé dans les greffons de mort cardiaque de donneur conservés à froid. À la suite de cette procédure, un modèle de reperfusion d’organe tel qu’une transplantation hépatique peut être réalisé pour étudier l’effet de la perfusion hépatique ex vivo sur les lésions de reperfusion et la fonction des organes.

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L’étude de la physiologie des organes animaux peut être réalisée en réalisant un système de perfusion expérimental ex vivo. L’ajout d’un rein porcin, en tant qu’organe homéostatique, à notre modèle de perfusion hépatique ex vivo précédemment développé peut être une étape principale pour obtenir un meilleur environnement physiologique.

Étapes de l’expérience foie-rein porcin autologue perfusé ex vivo

Nous présentons ici un protocole décrivant ex situ oxygénée machine à perfusion de greffes de foie donateurs. Cet article contient une étape par étape protocole de se procurer et de préparer la greffe du foie pour la machine perfusion, préparer le liquide de perfusion, amorcer la machine à perfusion et d'effectuer oxygénée normothermique machine à perfusion de la greffe de foie.

Ex Situ Normothermique machine perfusion de foies de donneurs

Nous décrivons une méthode ex vivo machine à perfusion de greffes de foie humain à la température subnormothermic (21 ° C).

Foie conservation et de récupération fonctionnelle humaine par des moyens de Subnormothermic machine à perfusion

La pénurie grave d'un organe a entraîné une utilisation accrue des greffes de reins marginaux pour la transplantation. Cela a suscité un intérêt dans les méthodes de stockage alternatives, depuis greffons marginaux tolèrent en particulier le stockage à froid mal. La technique de normothermique ex vivo perfusion rénale (NEVKP) représente une méthode de conservation roman pour rénaux greffes avant la transplantation.

Normothermique<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kidney Perfusion pour la préservation du rein Greffes avant la transplantation

Il y a pénurie d’importants donateurs du foie, et les critères pour les donateurs du foie ont été élargies. La perfusion normothermique ex vivo du foie (NEVLP) a été développée pour évaluer et modifier les fonctions organiques. Cette étude illustre un modèle de rat de NEVLP et teste la capacité de pégylé-catalase, d’atténuer les lésions hépatiques de préservation.

Un petit modèle Animal de Perfusion hépatique normothermique Ex Vivo

La perfusion machine ex vivo normamère (NEVP) n’a guère été explorée pour la préservation des allogreffes du pancréas. Nous présentons une technique innovante de conservation des allogreffes de pancréas avant transplantation.

Perfusion pancréatique ex vivo normamère pour la conservation des allogreffes de pancréas avant transplantation

Le modèle porcin de perfusion hépatique normothermique (NMP), décrit ici, peut être utilisé avec succès pour étudier la NMP en tant que stratégie de préservation, outil d’évaluation de la viabilité et plate-forme pour la réparation d’organes. Il a une grande valeur translationnelle, mais il est techniquement difficile et demande beaucoup de main-d’œuvre.

Perfusion hépatique isolée normomère porcine

Un système de perfusion hépatique ex vivo normothermique (NEVLP) a été créé pour les foies de souris. Ce système nécessite de l’expérience en microchirurgie mais permet des résultats de perfusion reproductibles. La capacité d’utiliser des foies de souris facilite l’étude des voies moléculaires pour identifier de nouveaux additifs perfusats et permet l’exécution d’expériences axées sur la réparation d’organes.

Perfusion hépatique Ex vivo Ex Vivo Normothermic chez la souris

Ce protocole décrit la méthodologie d’établissement d’un modèle porcin utilisant une perfusion automatique (MP) à température variable pour la préservation du foie du donneur, suivie d’une transplantation hépatique orthotopique (OLTx). Il vise à promouvoir le taux de réussite d’OLTx en utilisant le don de donneurs après mort circulatoire (DCD) hépatique et à établir un modèle stable.

Conservation du don de porcs après mort circulatoire (DDC) par perfusion et transplantation hépatique orthotopique

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle de stockage frigorifique et de transplantation à long terme du foie chez l’écureuil terrestre de Daurian (DGS), ce qui s’est avéré techniquement difficile dans les modèles de rongeurs standard.

Stockage frigorifique et transplantation du foie chez les écureuils terrestres de Daurian adaptatifs au froid

Découvrez la perfusion sous-normothermique ex vivo du foie pour préserver et évaluer les greffes marginales avant transplantation. Cette technique réduit les lésions de conservation et permet une évaluation fonctionnelle.

Technique de Subnormothermic Ex Vivo Foie de perfusion pour lentreposage, de lévaluation et de réparation des marginaux greffes du foie (Vidéo) | JoVE Journal

Technique de Subnormothermic

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