Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

L'objectif général de cette procédure est de marquer de manière fluorescente et de quantifier la quantité d'ARN néosynthétisé produit dans des conditions de traitement, en utilisant une analyse d'imagerie quantitative pour y parvenir. Des cellules cultivées sur des lamelles sont traitées avec la base modifiée par un alcène, le 5-éthynyluridine, appelé par la suite 5 EU, puis incubées dans des conditions d'hypoxie.

Pendant l'incubation, l'EU est incorporé lors de la synthèse de l'ARN sans interrompre le mécanisme cellulaire de transcription. Ensuite, l'EU incorporé est marqué par fluorescence au moyen d'une réaction de cycloaddition azoture-alcine catalysée par le cuivre, également appelée réaction « click ». L'ARN néosynthétisé marqué par fluorescence est alors visualisé par microscopie de fluorescence et les images obtenues sont analysées afin de comparer la quantité d'ARN produite dans les conditions traitées et les conditions de contrôle.

L’analyse statistique des données obtenues montre les changements dans la production d’ARN néoformé en réponse à l’hypoxie, grâce à la quantification de l’incorporation de cinq EU et à leur détection par microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la PCR quantitative, est qu’elle permet une visualisation directe de la production d’ARN au niveau cellulaire, à l’échelle de la cellule unique. Bien que nous utilisions ici cette méthode pour étudier la réponse des cellules à un faible taux d’oxygène, elle peut également être employée pour étudier les réponses aux médicaments chimiothérapeutiques.

Nos réponses aux stress supplémentaires illustrant une procédure seront données par John Leston, un étudiant diplômé de mon laboratoire, aidé par ish Kova, également étudiant diplômé, et Humana Druker, une boursière postdoctorale. Enfin, Gus Ferguson démontrera l'utilisation d'un logiciel de visualisation d'images. Commencez cette expérience en trempant plusieurs lamelles dans de l'éthanol à 70 % pour les stériliser.

Placer les lamelles sur le bord d'une plaque dans la hotte de culture tissulaire et les laisser sécher à l'air sous flux laminaire. Une fois les lamelles sèches, en placer une dans chacun des six boîtiers de 3,5 cm. Ajouter deux millilitres de DMEM complet chaud dans chaque boîtier.

Appuyez fermement avec une pince pour vous assurer que chaque lamelle adhère bien au fond du puits. Ensuite, pour détacher les cellules U2 OS de la boîte de culture tissulaire, rincez une fois avec trois millilitres de PBS. Puis ajoutez quatre millilitres de trypsine chaude à 0,05 %, EDTA à 1 % et incubez à 37 degrés Celsius pendant sept minutes.

Après sept minutes, ajoutez le milieu de ressuscitation (Resus), puis suspendez les cellules dans six millilitres de DMEM complet chaud afin d'inactiver la trypsine-EDTA. Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et semez chacune des boîtes de 3,5 centimètres contenant des lamelles avec deux fois dix puissance cinq cellules. Secouez doucement la boîte pour assurer une répartition uniforme des cellules, puis incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius, 21 % d'oxygène, 5 % de dioxyde de carbone, afin de permettre l'adhésion des cellules.

Le lendemain, retirez cinq des boîtes de l'incubateur. Laissez la boîte restante intacte. Elle servira de témoin positif normoxique.

Placer quatre des boîtes dans la station de travail en hypoxie. Exposer les cellules à des conditions d'hypoxie pendant 75 minutes, 90 minutes, deux heures et 24 heures. À l'autre boîte.

Ajouter de l'actinomycine D au milieu jusqu'à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et replacer la boîte dans l'incubateur à 37 degrés sous des conditions d'oxygène normales pendant quatre heures. Cette boîte sert de témoin négatif normoxique. Pendant que les cellules sont en incubation, préparer et rassembler les réactifs suivants en vue du test « click it ».

Le kit d'essai click it contenant du PBS à un pH de 7,2 à 7,6, du paraformaldéhyde à 3,7 % dans du PBS, du Triton X-100 à 1 % dans du PBS, de l'eau déionisée, du diméthylsulfoxyde, de l'hydroxyde de sodium 10 molaire, de l'acide chlorhydrique 37 % et des bandes indicatrices de pH. Vous devez prévoir d'être prêt à commencer un essai marqué dans des conditions non traitées. Une heure avant la fin du traitement en hypoxie, afin d'étiqueter les cellules, préparez une solution de travail deux fois concentrée d'EU à partir du stock de 100 millimolaire dans le milieu complet préchauffé.

Ensuite, ajoutez un volume égal de deux XEU au milieu dans la boîte contenant les cellules traitées à l'actinomycine D, diluant ainsi l'EU jusqu'à la concentration de travail. Puis, dans la chambre d'hypoxie, ajoutez le stock d'EU aux cellules traitées à l'hypoxie. Incubez pendant une heure dans les conditions de culture cellulaire correspondant au traitement après le traitement par hypoxie ou pendant quatre heures pour les témoins.

Lavez chaque boîte une fois avec du PBS et ajoutez un millilitre de la solution mère de paraformaldéhyde à 3,7 % dans les conditions de traitement, puis incubez pendant 15 minutes dans les conditions de traitement. Après la fixation, retirez les cellules de la chambre à hypoxie et placez-les sous la hotte. Versez le fixatif en prenant soin d'éliminer les déchets de paraformaldéhyde de manière responsable.

Ensuite, lavez les cellules une fois avec du PBS. Réalisez les étapes suivantes à température ambiante, en gardant toutes les solutions sur glace à deux à six degrés Celsius. Pour permeabiliser les cellules, retirez la solution de lavage et ajoutez un millilitre de Triton X-100 à 1 % dans du PBS à chaque puits ; incubez 15 minutes à température ambiante.

Retirez le tampon de perméation et lavez chaque puits une fois avec du PBS. Éliminez la solution de lavage des cellules et ajoutez 500 microlitres de cocktail réactionnel fraîchement préparé du kit d'imagerie ARN à chaque échantillon. Protégez les cellules de la lumière et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l'incubation, éliminer la réaction du kit d'imagerie ARN, le mélange réactionnel et effectuer un lavage. Une fois avec un millilitre de réaction du kit d'imagerie ARN, rincer avec le tampon ; toute étiquetage par anticorps supplémentaire doit être réalisé à ce stade. Pour colorer l'ADN, laver les échantillons avec du PBS, puis diluer l'herst 3,3,3,4,2 à un pour 1000.

Dans du PBS, ajouter un millilitre de la solution HERC diluée à chacun. Protéger du lumière et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, retirer la solution HERC et laver les cellules deux fois avec du PBS pour monter les lamelles.

Placez 10 microlitres de milieu de montage au centre d'une lame de microscope standard. Faites glisser la lame et placez la lamelle, côté cellules vers le bas, sur la goutte de milieu de montage. Évitez de former des bulles, car cela obscurcirait l'acquisition ultérieure des images.

Appliquez un vernis à ongles incolore sur le pourtour du couvre-objet afin de le fixer à la lame de microscope. Laissez sécher le vernis pendant cinq minutes à température ambiante. Les échantillons protégés de la lumière peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius.

Après le montage, acquérez les images à l’aide d’un microscope à champ large capable de détection de fluorescence. Réalisez l’imagerie à l’aide d’un objectif à immersion huile 40 V 1,30 NA et capturez les images avec une caméra CCD refroidie. Un minimum de 30 cellules après l’acquisition des images.

Utilisez un logiciel de traitement d'image pour corriger les images. Cette procédure corrige la distorsion optique en appliquant une formule mathématique logicielle aux images capturées. Le résultat est une image plus nette qui garantit que l'analyse ultérieure se limite uniquement aux cellules imagées.

Ensuite, importez les images dans le client Omer O. Des miniatures de toutes les images obtenues seront affichées afin de normaliser les paramètres de rendu pour toutes les images de la même expérience. Appliquez les paramètres de rendu provenant des cellules contrôles normoxiques à toutes les autres conditions à l’aide de l’outil de région d’intérêt (ROI) dans le logiciel d’analyse.

Sélectionnez les noyaux sur chaque image dans le logiciel. Choisissez l'option d'analyse d'intensité et obtenez les intensités moyennes pour chaque ROI sur 30 à 50 cellules. Enregistrez les données, puis calculez la moyenne et l'écart type pour chaque condition.

Enfin, à l’aide d’un logiciel de représentation graphique des données, construisez des nuages de points représentant les valeurs moyennes individuelles d’intensité afin de refléter la variabilité entre les cellules pour chaque condition. La représentation graphique des données d’intensité de cette manière est utile car elle permet une comparaison rapide des résultats des traitements et met clairement en évidence une hétérogénéité significative au sein de la population cellulaire soumise à un traitement, hétérogénéité autrement masquée par des méthodes classiques de représentation des données. En alternative, construisez des graphiques en barres pour représenter l’intensité moyenne moyenne plus l’écart-type de l’ARN néosynthétisé, afin de déterminer quantitativement la synthèse totale d’ARN. Des cellules U2 OS traitées en conditions d’hypoxie et cultivées en présence d’uridine marquée ou d’EU ont ensuite été préparées et analysées.

Comme le montre cette vidéo, les intensités de fluorescence de toutes les cellules de chaque population traitée ont été moyennées puis représentées graphiquement. Sur ce diagramme en barres, un test t de Student a été utilisé pour calculer la probabilité statistique que chaque groupe traité diffère significativement du témoin. Fait intéressant, ces données montrent une augmentation statistiquement significative de la synthèse globale d'ARN au fil du temps.

Lorsque les cellules U2 OS sont traitées en conditions d'hypoxie pendant plus d'une heure et demie, comme prévu, le traitement par l'actinomycine D élimine complètement l'intensité de fluorescence. Ces données suggèrent qu'après de plus longues périodes d'exposition à l'hypoxie, la cellule concentre ses efforts sur la production d'ARN, même dans cet environnement hypoxique hostile. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment marquer et quantifier l'ARN néosynthétisé au niveau de la cellule unique en conditions d'hypoxie et de normoxie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures selon ce protocole.

D'autres méthodes, telles qu'une double coloration avec des anticorps dirigés contre l'ARN polymérase et HIF-1, peuvent être réalisées afin de déterminer si les niveaux d'ARN polymérase sont modifiés et si HIF est activé. N'oubliez pas que le travail avec le formaldéhyde peut être extrêmement dangereux lors de l'exécution de cette procédure. Veillez toujours à porter des gants et à travailler sous une hotte aspirante.