Name: Reconstitutie van β-catenine afbraak in Xenopus Egg Extract (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer eiwitafbraak analyseren met Xenopus-eiwitextract om beta-catenine-afbraak te bestuderen. Deze methode identificeert modulatoren en biedt een efficiënt platform voor signaaltransductieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Laurie Lee voor het kritisch lezen van het manuscript. TWC wordt ondersteund door een American Heart Association predoctorale Fellowship (12PRE6590007). MRB wordt ondersteund door een National Cancer Institute opleiding subsidie ​​(T32 CA119925). SSH wordt ondersteund door National Institutes of Health (R01DK078640). EL wordt ondersteund door de National Institutes of Health (R01GM081635 en R01GM103926).

1. Voorbereiding van Xenopus Egg Extract OPMERKING: Elke kikker levert ongeveer 1 ml bruikbare ei-extract. Uittreksels van 10 kikkers worden typisch bereid in een keer, en het volume buffer hieronder beschreven is voor het uitvoeren van een 10 kikker Xenopus ei extract prep. De buffer volume dienovereenkomstig kunnen hogere of lagere preparaten ei extract aangepast. Preps gegenereerd op deze wijze verkregen vaste eiwitconcentraties ≥ 50 mg / ml. Het proces van het verzamelen van eieren en de verwerking daarvan tot extract is het meest efficiënt wanneer uitgevoerd door twee personen. (Voor basis kikker veeteelt technieken, zie Sive et al.. 33). <ol><li> Ei Collection <ol><li> Aan premier de kikkers, injecteren elk vrouwtje kikker met 100 E van Zwangere Mare Serum Gonadotropin (PMSG) van een vers bereide 250 U / ml bouillon. Gebruik een 3 ml tuberculine spuit met een 27 G naald subcutaan injecteren, met de schuine kant van dede naald naar boven in de dorsale lymfe zak, die is gelegen op ongeveer 1 cm van de middellijn van de inkeping verkleuringen langs de lengte van de poten van de kikker. </li><li> Store gegrond kikkers in het water (plus 20 mM NaCl, zie Sive et al.. 33) bij 18 ° C gedurende 5-10 dagen. Voor stilstaand water tank systemen, de veedichtheid is ongeveer 4 liter water per vrouwelijke kikker. OPMERKING: De minimale tijd die nodig is voor priming van kracht is 5 dagen, en de effecten van priming slijten na 10 dagen. </li><li> Bereid 0.5x Marc&#39;s Modified Ringers (MMR)-oplossing van een 20x MMR voorraad. 20x MMR bestaat uit 2 M natriumchloride, 40 mM kaliumchloride, 40 mM calciumchloride, 20 mM magnesiumchloride en 100 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), pH 7,4. </li><li> Opgezet emmers voor alle geïnjecteerd kikkers (een kikker per 4 L bak). OPMERKING: Hoewel meer dan een kikker kan worden geplaatst in dezelfde emmer voor eieren ophalen, als een van de kikkersbevat overwegend slechte kwaliteit eieren, zal een aanzienlijke hoeveelheid inspanning die nodig zijn om de slechte kwaliteit eieren gescheiden van die die geschikt zijn voor het maken extract zijn. Derhalve maximaliseren van het aantal kikkers in hetzelfde reservoir om de hoeveelheid buffer voor eieren minimaliseren verzamelen is het risico niet waard. </li><li> Injecteer 750 U menselijk choriongonadotrofine (HCG) in de dorsale lymfe zak van elke kikker met behulp van een 27 G naald, zoals beschreven in 1.1.1. </li><li> Plaats elk van de HCG-injectie in individuele kikkers 4 L emmers met 0,5 x MMR afgekoeld tot 16 ° C. </li><li> Plaats de containers met de kikkers in een 16 ° C incubator om eieren te verzamelen O / N (15-16 uur). OPMERKING: Het handhaven van de juiste temperatuur is van cruciaal belang voor de gehele procedure, van het verzamelen van eieren aan de voorbereiding van ei-extract. </li></ol></li><li> Dejellying Eieren OPMERKING: Eieren zijn bedekt met een laag gelei dat voorafgaand aan het maken van stof moet worden verwijderd. De waarschijnlijkheid van spontane lysis van de eieren toe naarmate de tijd between eileg en extract voorbereiding toeneemt. Daarom is het belangrijk om zo snel mogelijk verder door de volgende stappen. <ol><li> Bereid 4 L van 1x MMR, 50 ml van 0,1 x MMR, en 400 ml van 2% cysteïne, pH 7,7, gemaakt in gedestilleerd water. Handhaaf alle oplossingen bij 16 ° C. </li><li> Om extra eieren te verdrijven, knijp de onderrug en buik van de kikker. </li><li> Verwijder de kikkers en het grootste deel van de MMR, om de eieren te verlaten bij ongeveer 1-200 ml MMR in elke emmer. </li><li> Verwijder vuil met een transfer pipet, en de kwaliteit van de eieren te beoordelen: hoge kwaliteit eieren worden over het algemeen gekenmerkt door een duidelijke scheiding tussen de donkergekleurde dier halfrond en de licht gekleurde plantaardige halfrond en hebben de hoogste van donker naar licht contrast. Gooi met een transfer pipet elke eieren die vezelig, gevlekt, of gelyseerd (wit en gezwollen) verschijnen als ze de algehele kwaliteit van het extract zal afnemen. Bij&gt; 10% van de eieren van slechte kwaliteit, de gehelebatch moeten worden weggegooid. </li><li> Combineer eieren in een 500 ml bekerglas en giet zoveel MMR mogelijk terwijl eieren ondergedompeld. </li><li> Spoel de eieren door voorzichtig om te zwenken met tweemaal het ei volume van MMR. Tweemaal herhalen, en verwijder eventueel vuil of duidelijk slechte kwaliteit eieren. </li><li> Voeg ongeveer 100 ml van 2% cysteïne om de glazen beker, schud zachtjes te mengen, en laat de eieren te regelen voor 5 min bij 16 ° C. Giet het cysteïne. OPMERKING: Dejellying wordt gekenmerkt door de geleidelijke verschijning van gelei jassen zwevend boven de eieren en de meer compacte verpakking van de eieren als ze nu een kleiner volume innemen zonder de gelei vacht. </li><li> Voeg nog een 100 ml van 2% cysteïne, voorzichtig zwenken, wacht 5 min, en dan langzaam giet de cysteïne. Herhaal dit tot de eieren stevig verdichte (meestal door de derde cysteïne behandeling) zijn geworden. Opmerking: Als eieren te lang worden achtergelaten in cysteïne, ze zijn gevoelig voor lysis. Ook dejellied eieren zijn kwetsbaar en gevoelig voor mechanische lysis indien zezijn te krachtig gewerveld of als ze worden blootgesteld aan lucht. Nadat de eieren zijn dejellied, is het belangrijk om snel de centrifugatiestappen. </li><li> Giet cysteïne, en spoel de gelei jas en ander vuil weg door voorzichtig wassen eieren in 1x MMR. Giet buffer voorzichtig langs de kant van de beker. Herhaal dit twee keer of totdat MMR oplossing is niet meer troebel. Tijdens spoelen met 1x MMR blijven de rotte appels te verwijderen met behulp van een pipet overdracht. </li><li> Voer een laatste zacht spoelen met 30 ml 0,1 x MMR, en voorzichtig giet af als een groot deel van de buffer mogelijk. Nogmaals, verwijder uiteraard slecht eieren. </li></ol></li><li> Verpakking en Crushing Eieren door centrifugeren OPMERKING: De hieronder beschreven extract wordt gebruikt voor β-catenine afbraak is een variant van de cytostatische factor extract (metafase II gearresteerd). In tegenstelling tot de low-speed en high-speed-extract gebruikt voor celcyclus studies, tussentoerentalregeling extract werkt het beste voor β-catenine degradatie. Iknterphase extract evenzo bevordert robuuste β-catenine degradatie maar is arbeidsintensiever te bereiden. <ol><li> Voeg leupeptine, pepstatine, aprotinine mengsel (LPA, een proteaseremmer) bij 10 ug / ml (verdund uit een 10 mg / ml voorraadoplossing in DMSO) en cytochalasine D bij 20 ug / ml (verdund uit een 10 mg / ml voorraadoplossing in DMSO) in de resterende 20 ml 0,1 x MMR. </li><li> Voeg 0. X MMR bevattende LPA en cytochalasine D de gewassen eieren, zacht zwenken en incubeer gedurende 5 minuten bij 16 ° C. </li><li> Transfer eieren in 16 ° C pre-gekoelde 50 ml centrifuge buizen, zodat de eieren om zich te vestigen en te verwijderen resterende buffer van de top. Om blootstelling aan de lucht te voorkomen, een kleine hoeveelheid buffer in de transferpipet voorafgaand aan intrekking eieren voor overdracht in te trekken. Blijf bijkomende eieren zetten in de centrifugebuizen en verwijderen resterende buffer van de bovenkant van de buis totdat de eieren vullen de centrifugebuis naar boven, waarbij de opbrengst aan maximaliseertextraheren. </li><li> Om de eieren, rotatie centrifugebuizen verpakking bij 400 xg gedurende 60 seconden bij 4 ° C met een vaste hoek rotor. Resten buffer van de bovenkant van de centrifugebuizen. </li><li> Voor de verpletterende spin draaien buizen bij 15.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Verzamelen Cytoplasmatische Layer van Extract Opmerking: de hieronder beschreven methode verschilt van de klassieke methode aanprikken van de zijde van de centrifugebuis om de cytoplasmatische laag verzamelen. Dit protocol is aangepast voor vereenvoudiging en voor gebruik met bepaalde centrifuge buizen die herbruikbaar zijn. Geen merkbare verschillen in kinetiek van β-catenine afbraak zijn gevonden met beide methoden. Op dit punt extract moeten koud tijdens het hele proces gehouden en alle stappen moeten bij 4 ° C worden uitgevoerd <ol><li> Duidelijk een gat in de lipide laag met behulp van P1000 pipet tip. </li><li> Verzamel de cytoplasmatische laag (tussen de donkere gepigmenteerde laag en de light lipidelaag) met een nieuwe P1000 pipet tip in schone pre-gekoelde centrifuge buizen (Figuur 1). Voor hoogwaardige extract dat robuust degradeert β-catenine, het minimaliseren van de hoeveelheid gepigmenteerde en lipide laag die wordt onttrokken aan de cytoplasmatische laag. </li><li> Spin geëxtraheerd cytoplasmatische laag bij 15.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en opnieuw verzamelen van de cytoplasmatische laag. Herhaal de spin en extractie 1X. OPMERKING: Het extract moet &quot;stro gekleurd.&quot; Wanneer een belangrijke verontreiniging met de gepigmenteerde en lipide lagen op dit punt, kan men de spin een keer herhalen, hoewel buitensporige spins het vermogen van het extract om β-catenine degraderen afnemen. </li><li> LPA en cytochalasine D Naar het extract bij eindconcentraties van 10 ug / ml elk. Opmerking: De beschreven werkwijze levert een tamelijk consistente totale eiwitconcentratie van bij benadering 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 afzonderlijke preps) in Xenopus bv.g extracten. </li><li> (Optioneel) Voor vertaling assays, voeg afgetopte mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), en energie regeneratie mix (2.2.1) en incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur (voor meer informatie zie Salische et al.. 2 en Sive et al.. 33). Gebruik vertaald uittreksel onmiddellijk voor β-catenine degradatie assays of snap-vries in vloeibare stikstof voor later gebruik. OPMERKING: Vers bereide extract heeft een hoge capaciteit om exogeen toegevoegde mRNA vertalen, maar helaas, is dit vermogen verloren zodra het extract wordt bevroren. Capped mRNA kunnen gemakkelijk worden bereid met behulp van commercieel verkrijgbare kits. </li><li> Snap-vries-extract in vloeibare stikstof. OPMERKING: Extracten worden opgeslagen in kleine (200 pl) porties voor eenmalig gebruik omdat ze snel verliezen hun vermogen om β-catenine afgebroken als ze ingevroren. Voor langdurige opslag kan extract worden opgeslagen in vloeibare stikstof. Voor opslag op korte termijn, kan extract worden opgeslagen bij -80 ° C, hoewel de capaciteit of extract β-catenine afbreken kan drastisch worden gereduceerd met verlengde opslag bij -80 ° C (langer dan 2 maanden). </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiden Extract voor β-catenine Degradatie Assay <ol><li> Uitputting van Xenopus Extract OPMERKING: Een groot voordeel van Xenopus extract is het vermogen gemakkelijk componenten van een route afbreken en nauwkeurig een bepaalde hoeveelheid van een eiwit terug voegen teneinde de dosisafhankelijke effecten te bepalen. <ol><li> Gebruik vers bereide Xenopus ei extract of snel ontdooien bevroren extract en leg ze op ijs. Voer alle manipulaties in de kou. </li><li> Naar extract 1/10 volume van gepelleteerde antilichaam of affiniteit kralen (bv. 20 ml gepelletiseerd kralen 200 ml extract). Om verwatering van het extract te minimaliseren, zoveel vloeistof terug te trekken uit de kralen als mogelijk vóór toevoeging van het extract met behulp van gel plaatsen Tips met lange, taps toelopende tips. </li><li> Draai extract-kralen mengsel bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Spin-extract kralen mengsel bij 12.600 xg in microfuge bij 4 ° C gedurende 30 sec. Of als magnetische kralen worden gebruikt, gelden magnetische veld kralen verzamelen. </li><li> Transfer uitgeput extract om een ​​frisse microfugebuis op ijs. Wees voorzichtig en laat geen kralen niet over te dragen met het extract. </li><li> Bevestigen de efficiëntie van uitputting door immunoblotting zowel verarmd extract en kralen. </li><li> Bereid extract voor β-catenine degradatie assay zoals beschreven in 2.2. </li></ol></li><li> Het optimaliseren van Xenopus Extract voor β-catenine Degradatie NB: β-catenine afbraak in Xenopus ei extract is een energie-afhankelijk proces dat snel put de endogene ATP winkels. Bijgevolg wordt een energie regeneratie systeem nodig om robuuste β-catenine degradatie te behouden. <ol><li> Bereid een 20x energie regeneratie (ER) mix bestaande uit 150 mM creatine fosfaat, 20 mM ATP, 600 ug / ml creatinefosfokinase,en 20 mM MgCl2. ER worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -80 ° C. Vermijd herhaalde vries / dooi cycli met behulp van kleine porties ingevroren. </li><li> Snel ontdooien Xenopus ei extract door wrijven de bevroren buis tussen de handen. Plaats de buis op ijs net voordat alle extract is gesmolten. </li><li> Voeg 10 ul van energie regeneratie mix (20x ER) in een hoeveelheid (200 pl) van Xenopus ei extract. Meng goed door snel te vegen de buis en pols vortexen. Pulse-spin en direct te plaatsen op ijs. </li><li> (Optioneel) De omzet van β-catenine kan enigszins versterkt Xenopus ei extract door toevoeging van ubiquitine (1,25 mg / ml final). Cycloheximide (0.1 mg / ml final) kunnen ook worden toegevoegd aan translatie van endogene transcripten minimaliseren. </li><li> Aliquot de juiste hoeveelheden voor degradatie assay in pre-gekoelde microfugebuisjes op ijs. Voor radioactief gemerkt β-catenine degradatie assays, intrekken 2-5 ml extract voor elk tijdstip. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Gelabeld β-catenine degradatie assay Xenopus ei extract Opmerking: alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs, tenzij anders aangegeven. <ol><li> Voorbereiden van radioactief gemerkt β-catenine <ol><li> Bereid vers in vitro gesynthetiseerd [35S] methionine-radioactief gemerkt eiwit met behulp van commercieel verkrijgbare kits. OPMERKING: genereren 35S-gemerkte (halfwaardetijd 87 dagen) eiwitten worden gemakkelijk en efficiënt geproduceerd uit commercieel beschikbare in vitro gekoppelde transcriptie-translatie kits. Het is belangrijk dat het vertaalde eiwit voldoende zodanig dat veranderingen in eiwitturnover gemakkelijk gevisualiseerd worden gelabeld. </li><li> Om succesvol radiolabeling bevestigen uitvoeren SDS-PAGE/autoradiography met 0,5 ul van het vertaalde eiwit. Kwantificeer de intensiteit van het radioactief gemerkte β-catenine band met ImageJ, ImageQuant, of een andere kwantitatieve software progrben. OPMERKING: De radioactief gemerkte β-catenine eiwit band moet duidelijk zichtbaar op film binnen een paar uur (4-6 uur). </li><li> Snap-vries het radioactief gemerkte eiwit in vloeibare stikstof voor opslag tot gebruik. Opmerking: Langdurige opslag (&gt; 2 maanden) en meerdere vries / dooi (meer dan 2) kunnen ernstige gevolgen de capaciteit van de radioactief gemerkte β-catenine krachtig is afgebroken in Xenopus ei extract. Typisch, de stabiliteit van radioactief gemerkte eiwitten significant afneemt na 1 maand opslag bij -80 ° C; dus relatief vers bereide radiogelabeld β-catenine geeft de beste resultaten bij deze degradatie assays. </li></ol></li><li> Het uitvoeren van β-catenine Degradatie Assay <ol><li> Voeg 1-3 pl (afhankelijk van de sterkte van de radioactief gemerkte band signaal) in vitro vertaalde β-catenine (en andere eiwitten, kleine moleculen, enz. die worden getest) in 20 ui Xenopus reactiemengsel op ijs. Meng goed door quickly flicking de buis en een korte puls van vortexen; Dit is een belangrijke stap als Xenopus ei extract is erg stroperig, en onvolledige menging zal de consistentie van de resultaten beïnvloeden. Pulse spin en leg ze op ijs. </li><li> Start de β-catenine afbraak reactie van het verschuiven van de buizen tot kamertemperatuur. </li><li> Op het aangewezen tijdstip, verwijderen 1-5 ml van het monster en direct beginnen met mixen met SDS sample buffer (5x volume) om de reactie te stoppen. Om ervoor te zorgen dat de afbraak reactie wordt volledig beëindigd, flick buis meerdere malen en vortex krachtig. </li><li> Voeren SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalent (~ 50 mg eiwit) van het extract voor elk tijdstip / baan. Degradatie van β-catenine in Xenopus ei extract moet blijken uit de tijdsafhankelijke afname van de intensiteit van het radioactief gemerkte β-catenine band Figuur 2. Resultaten te kwantificeren volgens ImageJ, ImageQuant, of andere gewenste imaging software indien nodig. </li><li> (Optionale) Soak SDS-polyacrylamide gel in fixeeroplossing (10% azijnzuur en 30% methanol in gedestilleerd water) vóór drogen achtergrondradioactiviteit verlagen en de kwaliteit van het beeld. </li></ol></li></ol> 4. Β-catenine-luciferase Afbraak Assay in Xenopus Egg Extract Voer alle stappen op ijs, tenzij anders aangegeven. <ol><li> Voorbereiden van β-catenine-luciferase <ol><li> Synthetiseren niet-radioactief gemerkt,-luciferase gelabeld β-catenine met de transcriptie-translatie gekoppeld systeem met complete aminozuur mix. </li><li> Controleer productie van het luciferase gelabeld β-catenine door meting luciferaseactiviteit 0,5-1 ul van de reactie. Beoordelen achtergrond luminescentie door het meten van luminescentie uit een onvertaald reactie mix. OPMERKING: Meerdere commerciële kits zijn beschikbaar voor het meten van luciferase-activiteit. Langlevende luminescentie, maar werkt bijzonder goed voor de afbraak ASSAy. </li></ol></li><li> Het uitvoeren van β-catenine-luciferase Degradatie Assay <ol><li> Ontdooien en bereiden Xenopus ei extract als in 2.2. </li><li> Toe te voegen in-vitro vertaald β-catenine-luciferase fusie (vanaf 4.1) in de voorbereide Xenopus reactie mix (van 2,2) op ijs en meng goed als in 3.2.1. Opmerking: Activiteit van de β-catenine luciferase die wordt toegevoegd aan het extract typisch tussen 20 - 50.000 relatieve fluorescentie-eenheden (RLU) / ml extract (gebaseerd op metingen verkregen uit 4.1.2). Startsignaal moet ongeveer 100.000 RLU (2-5 ml van de in vitro vertaalde β-catenine-luciferase fusie). </li><li> Shift het extract RT de afbraak reactie te starten. </li><li> Verwijder een monster van het reactiemengsel op de aangegeven tijd en snap-bevriezing in vloeibare stikstof. OPMERKING: drievoudige monsters worden meestal verwijderd voor analyse voor elk tijdstip. Bevroren extract kan bij -80 ° C worden bewaard until zijn ze klaar om te worden geanalyseerd. </li><li> Ontdooi monsters ijs, doorvoermonsters standaard witte 96-wells platen op ijs en werkwijze voor luciferaseactiviteit. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li>
<li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-catenin+stability%3A+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Shennan, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+extracts%3A+a+model+system+to+study+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases.</a> Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).</li>
<li>Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cell+cycle+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Masui, Y., Markert, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+control+of+nuclear+behavior+during+meiotic+maturation+of+frog+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+zoology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.</a> The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>Newport, J. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+cell+cycle+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the cell cycle during early Xenopus development.</a> Cell. 37, 731-742 (1984).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47, 577-587 (1986).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubistatins+inhibit+proteasome-dependent+degradation+by+binding+the+ubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain.</a> Science. 306, 117-120 (2004).</li>
<li>Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+ubiquitin-conjugating+enzyme+involved+in+mitotic+cyclin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation.</a> Curr Biol. 6, 455-466 (1996).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+Wnt+signaling+through+activation+of+casein+kinase+1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha.</a> Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).</li>
<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li>
<li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+state+of+protein+turnover%3A+It%27s+about+time%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li>
<li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+regulation+of+%5Bbeta%5D-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li>
<li>Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li>
<li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li>
<li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li>
<li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3%27s+phosphorylation+of+%CE%B2-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li>
<li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li>
<li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+Laevis+%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+GSK3%CE%B2+to+the+APC-%CE%B2-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li>
<li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Xenopus ei-extract is een robuust biochemisch systeem voor het onderzoeken van β-catenine omzet. De concentratie van β-catenine in Xenopus ei extract ~ 25 nM 2. Onder optimale omstandigheden, het ei extract kan afbreken β-catenine met een snelheid van 50-100 nM / uur en half-maximaal bij 200 nM 24. Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle reconstructie van β-catenine afbraak berekend Xenopus ei extract. Deze omvatten 1) het genereren van hoge kwaliteit <em...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis ei extract is uitgebreid gebruikt om vele celbiologische processen, waaronder het cytoskelet dynamiek, nucleair geheel en import, apoptose, ubiquitine metabolisme, voortgang van de celcyclus, signaaltransductie en proteïne omzet 1-17 bestuderen. De Xenopus ei extract systeem vatbaar is voor de biochemische analyse van een legioen van cellulaire processen, omdat ei extract vertegenwoordigt in wezen onverdund cytoplasma dat alle essentiële cytoplasmatische componenten die nodig zijn om deze processen uit te voeren en in staat onderzoek bevat. Grote hoeveelheden ei extract kan worden bereid in een keer voor biochemische manipulaties die grote hoeveelheden materiaal (bijvoorbeeld eiwitzuivering of high-throughput screening) 18-20 vereisen. Een ander voordeel is dat de concentratie van specifieke eiwitten in Xenopus ei extract nauwkeurig kan worden ingesteld door toevoeging van recombinant eiwit en / of immunodepletie van endogenous eiwitten in tegenstelling tot transfectie van plasmide-DNA waarbij expressie van het eiwit van interesse is moeilijk te controleren. Bovendien kan het gebrek aan recombinante eiwitten worden overwonnen door de toevoeging van transcripten coderend voor het eiwit van belang te maken van hoge capaciteit de vers bereide Xenopus ei extract aan toegevoegd exogeen mRNA te vertalen. De regulering van eiwitafbraak is van cruciaal belang voor de bestrijding van vele cellulaire mechanismen en processen 21. Xenopus ei extract is uitgebreid gebruikt om afbraak van eiwitten te bestuderen als het systeem maakt het mogelijk voor meerdere manieren om eiwitturover controleren zonder verstorende invloeden van transcriptie en vertaling. De Wnt signaleringsroute is een sterk geconserveerd signaalweg dat cruciale rol bij ontwikkeling en ziekte speelt. De omzet van β-catenine, de belangrijkste effector van de Wnt-route, is sterk gereguleerd, en een verhoogde steady-state lEvel van β-catenine is essentieel voor de activatie van de Wnt doelgenen. Het belang van β-catenine afbraak wordt benadrukt door het feit dat mutaties in de Wnt route die β-catenine afbraak remmen in ~ 90% van sporadische colorectale kanker 22. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt-route kan getrouw worden samengevat in Xenopus ei extract om het mechanisme van de omzet bestuderen en om nieuwe kleine molecuul modulatoren afbraakproducten 2, 19, 20, 23-29 identificeren. Werkwijzen voor de bereiding van Xenopus ei extract voor het bestuderen van de celcyclus zijn beschreven in eerdere publicaties Jupiter 30-32. Het huidige protocol beschrijft een aanpassing van deze werkwijzen en geoptimaliseerd voor de afbraak van [35 S]-radioactief gemerkt β-catenine en luciferase gelabeld β-catenine inXenopus ei extract. De radiogelabelde degradatie assay maakt directe visualisatie van eiwitniveaus via autoradiografie. [35 S] methionine wordt opgenomen in het eiwit van interesse met een in vitro translatiereactie die dan direct worden toegevoegd aan een afbraakreactie. Bovendien is het radioactief gemerkte eiwit omzet assay geen antilichaam tegen het eiwit van belang of een epitoop-tag die eiwitstabiliteit beïnvloeden vereisen. Omdat zelfs kleine veranderingen in eiwitniveaus, zoals blijkt uit veranderingen in de intensiteit van het radioactief gemerkte eiwit band, worden gemakkelijk gevisualiseerd door autoradiografie, de [35S]-radioactief degradatie assay is een zeer bruikbare werkwijze voor visualisatie eiwit omzet 2. Fusie van β-catenine om vuurvlieg luciferase (hierna eenvoudig &quot;luciferase&quot;) maakt nauwkeurige en gemakkelijke kwantitatieve metingen van eiwitniveaus, teneindede kinetische eigenschappen van β-catenine omzet 19, 20 bepalen. Een groot voordeel van de luciferase assay is dat het een krachtig kwantitatief systeem dat gemakkelijk opgeschaald. Het volgende protocol voorziet in eenvoudige werkwijzen voor het testen β-catenine afbraak en een robuuste, efficiënte en effectieve methode voor high-throughput screening van nieuwe β-catenine modulatoren.

<table><tbody><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>ProSpec</td><td>hor-272-A</td><td>Gereconstitueerd met gedistilleerd water vóór gebruik.&nbsp;</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Research Products International</td><td>S23020-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Acros Organics</td><td>AC42352-5000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Acros Organics</td><td>AC17360-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C8273-10MG</td><td></td></tr><tr><td>3 ml spuit: Luer Lock tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>27 G naald</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96 wel solid wit polystyreen microplaat, ronde bodem</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo luciferase assay systeem</td><td>Promega</td><td>E2520</td><td>Langdurig opslaan bij -80 &deg;C, kan tot 1 maand worden bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>TNT Sp6 gekoppelde reticulocyte lysate systeem</td><td>Promega</td><td>L4600</td><td></td></tr><tr><td>TNT Sp6 hoog-opbrengst tarwekiem eiwit expressie systeem</td><td>Promega</td><td>L3260</td><td>Over het algemeen hogere opbrengst dan reticulocyte lysate&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyTag Express eiwit labelmix [S35]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772007MC</td><td></td></tr><tr><td>Creatinefosfaat</td><td>Sigma</td><td>27920-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinefosfokinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo luciferase assay systeem</td><td>Promega</td><td>E2920</td><td>Dezelfde opslagcondities als Steady-Glo</td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>0556214D</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SS-34 vaste hoek rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-128</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-firefly luciferase antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab16466</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GSK3 antilichaam</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg;C Incubator</td><td>Percival Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitutie van β-catenine afbraak in<em&gt; xenopus</em&gt; egg extract

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis ei extract is een goed gekarakteriseerd, robuust systeem voor het bestuderen van de biochemie van diverse cellulaire processen. Xenopus ei extract gebruikt om eiwitturover studeren in vele cellulaire contexten, zoals de celcyclus en signaaltransductie 1-3. Hierin wordt een werkwijze beschreven voor het isoleren Xenopus ei extract die is geoptimaliseerd om de afbraak van de kritische Wnt component, β-catenine bevorderen. Twee verschillende methoden beschreven β-catenine eiwitafbraak beoordelen Xenopus ei extract. Een methode is visueel informatief ([35 S]-radioactief gemerkte eiwitten), terwijl de andere gemakkelijker geschaald voor high-throughput assays (vuurvlieg luciferase-gemerkte fusie-eiwitten). De beschreven technieken kunnen worden gebruikt, maar zijn niet beperkt tot, beoordelen β-catenine eiwit omzet en identificeren van moleculaire componenten die bijdragen aan de omzet. Bovendien, de Abilheid om grote hoeveelheden homogene Xenopus ei extract gecombineerd met kwantitatieve en gemakkelijke uitlezing van luciferase-gemerkte eiwitten te zuiveren kan dit systeem eenvoudig worden aangepast voor high-throughput screening op modulators van β-catenine afbraak.

Een schema van β-catenine afbraak in Xenopus ei extract wordt getoond in Figuur 2A. 35S-gemerkte β-catenine werd geïncubeerd in Xenopus ei extract werden porties (1 ml extract equivalent) verwijderd geëigende momenten en monsters werden onderworpen aan SDS-PAGE gevolgd door autoradiografie. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt route wordt gemedieerd door de ubiquitine-proteasoom-systeem 2 en afbraak van [35 S]-radioactief gemerkt β-catenine in...

Een werkwijze wordt beschreven voor het analyseren eiwitafbraak met radioactief gemerkt en luciferase-fusie-eiwitten in Xenopus ei extract en de aanpassing voor high-throughput screening kleinmoleculige modulatoren van eiwitafbraak.

Reconstitutie van β-catenine afbraak in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het celvrije biochemische extractsysteem van xenopus-eicellen te gebruiken voor de analyse van de omzetting van beta-catenine. Dit wordt bereikt door in eerste instantie vermoedelijke effectoren toe te voegen aan of te verwijderen uit geactiveerd xip-eiextract om modulatoren van de beta-catenine-omzetting te identificeren; als tweede stap wordt exogeen in vitro getranscribeerd en vertaald beta-catenine, ofwel radiogemarkeerd met S 35 of gefuseerd met luciferase, toegevoegd aan het XUS-eiextract, waarin het onder natuurlijke omstandigheden actief wordt afgebroken. Vervolgens worden tijdspunten verzameld om veranderingen in de beta-catenine-proteineniveaus in de loop van de tijd te beoordelen.Er worden resultaten verkregen die aantonen of een specifieke modulatie van xenopus-eiextract de snelheden van bèta-catenine-synthese en -degradatie verhoogt of verlaagt, op basis van autoradiografie en/of luminescentiedetectie. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals pulse-chase of cycloheximide-chase-experimenten in gekweekte cellen, is dat xenopus-eiextract een celvrij biochemisch systeem biedt waarin

reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ruwe en gefractioneerde Xenopus ei-extracten kan worden gebruikt om ingrediënten voor reconstructie van cellulaire processen voor morfologische en biochemische analyses. Ei lysis en differentiële centrifugatie worden gebruikt om het ruwe extract die op hun beurt gebruikt worden om in gefractioneerde extracten en licht membraan voorbereidingen voor te bereiden voor te bereiden.

Voorbereiding en Fractionering van Xenopus laevis Egg Extracten

Kernmembraan assemblage is een essentiële stap in de celdeling-cyclus, dit proces kan worden gerepliceerd in de proefbuis door het combineren van Xenopus sperma chromatine, cytosol, en licht membraan fracties. Compleet kernen worden gevormd, met inbegrip van nucleaire membranen met poriën complexen, en deze gereconstitueerde kernen zijn in staat van normale nucleaire processen.

In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten

Deze video toont een protocol methode voor het genereren van...

De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Xenopus ei extract is een nuttig modelsysteem om de DNA schade checkpoint onderzoeken. Dit protocol is voor de bereiding van Xenopus ei extracten en DNA schade checkpoint inducerende reagentia. Deze technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van DNA beschadigende benaderingen in de studie van de DNA schade checkpoint signaling.

Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extracten

Productie van<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extracten aan microtubuli-geassocieerde RNA&#39;s identificeren

Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

De moleculaire mechanismen van de decondensatie van sterk gecompacteerde mitotische chromatine zijn slecht gedefinieerd. We presenteren een celvrije test op basis van mitotische chromatineclusters geïsoleerd uit HeLa-cellen en Xenopus laevis eierextract die het decondensatieproces in vitro getrouw reconstrueert.

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

Mechanismen van cellulaire en intracellulaire schaalverdeling blijven ongrijpbaar. Het gebruik van Xenopus embryo-extracten is steeds gebruikelijker geworden om mechanismen van orgaangrootte-regulatie te verduidelijken. Deze methode beschrijft de bereiding van embryo-extract en een nieuwe nucleaire schaalverdelingstest waardoor mechanismen van nucleaire grootte-regulatie kunnen worden geïdentificeerd.

Een celvrij Assay met behulp van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extracten om te studeren mechanismen van Nuclear Size Verordening

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .

Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie

Leer eiwitafbraak analyseren met Xenopus-eiwitextract om beta-catenine-afbraak te bestuderen. Deze methode identificeert modulatoren en biedt een efficiënt platform voor signaaltransductieonderzoek.

Reconstitutie van β-catenine afbraak in

Meer video's verkennen