Name: Reconstitution de β-caténine dégradation dans Xenopus Extrait des oeufs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Découvrez l'analyse de la dégradation de la β-caténine dans un système biochimique acellulaire à base d'extrait d'œufs de Xenopus. Cette méthode permet d'identifier les modulateurs moléculaires du renouvellement protéique.

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Nous remercions Laurie Lee pour la lecture critique du manuscrit. TWC est soutenu par une bourse prédoctorale American Heart Association (12PRE6590007). MRB est soutenu par une subvention de formation de l&#39;Institut national du cancer (T32 CA119925). SSH est soutenue par les Instituts nationaux de la santé (R01DK078640). EL est soutenue par les National Institutes of Health (R01GM081635 et R01GM103926).

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<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li>
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<li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Xenopus extrait d&#39;oeuf est un système biochimique robuste pour enquêter sur le chiffre d&#39;affaires β-caténine. La concentration de β-caténine chez Xenopus extrait d&#39;œuf est 25 ~ 2 nM. Dans des conditions optimales, l&#39;extrait d&#39;œuf est capable de dégrader les β-caténine à un débit de 50 à 100 nM / h et est semi-maximale à 24 200 nM. Il ya plusieurs étapes essentielles pour la reconstitution réussie de la dégradation de β-caténine utilisant Xenopus extrai...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis extrait d&#39;oeufs a été largement utilisée pour étudier de nombreux processus biologiques cellulaires, y compris la dynamique du cytosquelette, l&#39;assemblage nucléaire et l&#39;importation, l&#39;apoptose, le métabolisme de l&#39;ubiquitine, la progression du cycle cellulaire, la transduction du signal, et le renouvellement des protéines 1-17. Le système d&#39;extraction d&#39;oeufs de Xenopus se prête à l&#39;analyse biochimique d&#39;une légion de processus cellulaires parce extrait d&#39;oeufs représente essentiellement cytoplasme non dilué qui contient tous les composants cytoplasmiques essentielles nécessaires à l&#39;exécution de ces processus et de permettre l&#39;enquête. De grandes quantités d&#39;extrait d&#39;œufs peuvent être préparés en même temps pour des manipulations biochimiques qui nécessitent de grandes quantités de matière (par exemple, la purification des protéines ou criblage à haut débit) 18-20. Un autre avantage est que la concentration de protéines spécifiques dans des œufs de Xenopus extrait peut être ajustée avec précision par l&#39;addition de protéine et / ou recombinant immunodéplétion de EndoGprotéines tones, par opposition à la transfection d&#39;ADN plasmidique, où l&#39;expression de la protéine d&#39;intérêt est difficile à contrôler. En outre, le manque de protéines recombinantes disponibles peut être surmonté par l&#39;addition de transcrits codant pour la protéine d&#39;intérêt, en profitant de grande capacité de l&#39;extrait d&#39;oeufs de Xénope fraîchement préparée de traduire l&#39;ARNm ajoutées de manière exogène. La régulation de la dégradation des protéines est essentielle pour le contrôle de plusieurs voies cellulaires et traite 21. Xenopus extrait d&#39;oeufs a été largement utilisée pour étudier la dégradation des protéines que le système permet de multiples façons de surveiller le renouvellement des protéines sans facteurs de confusion de la transcription et de la traduction. La voie de signalisation Wnt est une voie de signalisation hautement conservée qui joue un rôle critique dans le développement et la maladie. Le chiffre d&#39;affaires de β-caténine, le principal effecteur de la voie Wnt, est très réglementée, et une augmentation de l&#39;état d&#39;équilibre liveau de β-caténine est essentiel pour l&#39;activation des gènes cibles de Wnt. L&#39;importance de la dégradation de β-caténine est mis en évidence par le fait que des mutations dans la voie Wnt qui inhibent la dégradation de β-caténine trouvent dans ~ 90% des cas sporadiques de cancer colorectal 22. dégradation β-caténine par des composants de la voie Wnt peut être fidèlement récapitulé dans Xenopus extrait d&#39;oeufs pour étudier le mécanisme de son chiffre d&#39;affaires ainsi que pour identifier de nouveaux modulateurs à petites molécules de sa dégradation 2, 19, 20, 23-29. Des procédés pour la préparation d&#39;extrait d&#39;oeufs de Xenopus pour l&#39;étude du cycle cellulaire ont été décrits dans des publications antérieures JoVE 30-32. Le protocole actuel décrit une modification de ces méthodes, et est optimisé pour la dégradation de la [35S]-radiomarqué β-caténine et de la luciférase-marqué β-caténine dansExtrait d&#39;oeufs de Xénope. Le dosage radio-marqué de dégradation permet la visualisation directe du taux de protéines par l&#39;intermédiaire d&#39;une autoradiographie. [35 S] méthionine est incorporé dans la protéine d&#39;intérêt en utilisant une réaction de traduction in vitro qui peut alors être directement ajouté à une réaction de dégradation. En outre, le dosage de la rotation de la protéine radiomarquée ne nécessite pas un anticorps dirigé contre la protéine d&#39;intérêt ou un marqueur d&#39;épitope, ce qui peut influencer la stabilité de la protéine. Parce que même de petits changements dans les niveaux de protéines, dont témoignent des modifications de l&#39;intensité de la bande de protéine radiomarquée, sont facilement visualisés par autoradiographie, la [35 S] radiomarqué essai de dégradation représente une méthode très utile pour la visualisation du chiffre d&#39;affaires de la protéine 2. Fusion de β-caténine de la luciférase de luciole (ci-après dénommé simplement &quot;luciférase&quot;) permet des mesures quantitatives précises et faciles des niveaux de protéines, afinpour déterminer les propriétés cinétiques de la β-caténine roulement 19, 20. Un avantage majeur du dosage de la luciférase est qu&#39;elle fournit un système quantitatif solide qui est facilement mis à l&#39;échelle vers le haut. Le protocole suivant fournit des méthodes simples pour doser la dégradation β-caténine et une méthode robuste, efficace, et efficace pour le criblage à haut débit de nouveaux modulateurs β-caténine.

<table><tbody><tr><td>Gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG)</td><td>ProSpec</td><td>hor-272-A</td><td>Reconstitué avec de l’eau distillée avant utilisation.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Gonadotrophine chorionique humaine</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Research Products International</td><td>S23020-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Acros Organics</td><td>AC42352-5000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cystéine</td><td>Acros Organics</td><td>AC17360-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine B</td><td>Sigma</td><td>C8273-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 3 ml : Luer Lock</td><td>tip Becton Aiguille Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>microplaque en polystyrène blanc solide de 96 puits, à fond rond</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo système de dosage de la luciférase</td><td>Promega</td><td>E2520</td><td>Stocker à long terme à -80 &deg ; C, peut se conserver jusqu’à 1 mois à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Système de lysat de réticulocytes couplé au TNT Sp6</td><td>Promega</td><td>L4600</td><td></td></tr><tr><td>Système d’expression de protéines de germe de blé à haut rendement TNT Sp6</td><td>Promega</td><td>L3260</td><td>Rendement généralement supérieur à celui du lysat de réticulocytes</td></tr><tr><td>Mélange de marquage protéique EasyTag Express [S35]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772007MC</td><td></td></tr><tr><td>Créatine phosphate</td><td>Sigma</td><td>27920-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>Créatine phosphokinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Système de dosage de la luciférase Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2920</td><td>Mêmes conditions de stockage que Steady-Glo</td></tr><tr><td>50 ml Tubes à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>0556214D</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe Sorvall SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>115 V 50/60 Hz Minicentrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-128</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-lucioles luciférase anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab16466</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GSK3</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus</td><td>centrifugeuse Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg ; C Incubateur</td><td>Percival Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; xenopus</em&gt; extrait des oeufs

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus extrait d&#39;oeufs de laevis est un système robuste et bien caractérisés pour étudier la biochimie de divers processus cellulaires. Xenopus extrait d&#39;œuf a été utilisé pour étudier le renouvellement des protéines dans de nombreux contextes cellulaires, y compris le cycle cellulaire et la transduction du signal des voies 1-3. Le présent mémoire, on décrit un procédé pour isoler l&#39;extrait d&#39;oeuf de Xénope qui a été optimisé pour favoriser la dégradation de la protéine de la voie Wnt critique, β-caténine. Deux méthodes différentes sont décrites pour évaluer β-caténine la dégradation des protéines dans Xenopus extrait d&#39;oeufs. Une méthode est visuellement informatif ([35 S] radiomarqué protéines), tandis que l&#39;autre est plus facilement mis à l&#39;échelle pour les essais à haut débit (luciole protéines de fusion luciférase marqués). Les techniques décrites peuvent être utilisés, mais ne sont pas limités à, d&#39;évaluer β-caténine renouvellement des protéines et identifier les composants moléculaires qui contribuent à son chiffre d&#39;affaires. En outre, la capalité de purifier de grands volumes de homogène extrait d&#39;oeufs de Xénope combinée à la lecture facile et quantitative des protéines de la luciférase à marquage de ce système permet d&#39;être facilement adaptée pour le criblage à haut débit pour des modulateurs de la dégradation de β-caténine.

Un schéma de dégradation de β-caténine chez Xenopus extrait d&#39;œuf est représenté sur la figure 2A. 35S marqué β-caténine a été incubé dans Xenopus extrait de l&#39;oeuf, des fractions aliquotes (1 ml d&#39;extrait équivalent) ont été prélevés à des moments appropriés, et des échantillons ont été soumis à SDS-PAGE suivie d&#39;une autoradiographie. la dégradation de β-caténine par des composants de la voie Wnt est médiée par le système ubiquitine-protéasome 2, ...

Un procédé est décrit pour l&#39;analyse de la dégradation des protéines en utilisant des protéines radiomarquées et la luciférase-fusion dans Xenopus extrait d&#39;oeufs et de son adaptation pour le criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de la dégradation des protéines.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrait des oeufs

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser le système biochimique cellulaire d'extrait d'œuf de Xenopus pour analyser le renouvellement de la bêta-caténine. Cela est réalisé en ajoutant d'abord des effecteurs présumés ou en les épuisant à partir d'un extrait d'œuf Xip activé afin d'identifier les modulateurs du renouvellement de la bêta-caténine. Dans un deuxième temps, de la bêta-caténine exogène, transcrite et traduite in vitro, soit marquée au soufre 35, soit fusionnée à la luciférase, est ajoutée à l'extrait d'œuf XUS, où elle est activement dégradée dans des conditions natives. Ensuite, des prélèvements sont effectués à différents moments afin d'évaluer les variations des niveaux de la protéine bêta-caténine au cours du temps.Les résultats obtenus montrent si une modulation particulière d'extrait d'œuf de Xenopus augmente ou diminue les taux de bêta-caténine et de sa dégradation, selon une autoradiographie ou une détection par luminescence. L'avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, telles que les expériences de type « pulse-chase » ou « cycline chase » dans des cellules en culture, est que l'extrait d'œuf de Xenopus fournit un sy

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Brut et fractionné des extraits d'œufs de Xénope peuvent être utilisés pour fournir les ingrédients pour reconstituer les processus cellulaires pour l'analyse morphologique et biochimique. Lyse des œufs et centrifugation différentielle sont utilisés pour préparer l'extrait brut qui à son tour utilisée pour préparer des extraits fractionnés et des préparations de membranes de lumière.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Assemblage membrane nucléaire est une étape essentielle dans le cycle de division cellulaire, ce processus peut être reproduit dans le tube à essai en combinant la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus, le cytosol et des fractions membranaires de lumière. Remplissez noyaux sont formés, y compris les membranes nucléaires avec des complexes de pores, et ces noyaux reconstitués sont capables du processus normal de nucléaire.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Ce protocole vidéo montre une méthode pour générer des...

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Xenopus oeuf extrait est un système modèle utile pour étudier le point de contrôle de dommages à l'ADN. Ce protocole est destiné à la préparation d'extraits d'œufs de xénope et de l'ADN réactifs induisant des dommages aux points de contrôle. Ces techniques sont adaptables à une variété d'approches endommageant l'ADN dans l'étude de la signalisation checkpoint dommages de l'ADN.

Etude de l&#39;ADN à l&#39;aide de Checkpoint dommages<em&gt; Xenopus</emExtraits d&#39;oeufs&gt;

Production d&#39;<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Œuf Extraits pour identifier les ARN associée aux microtubules

Le contrôle de la synthèse des protéines se produit principalement à l’étape d’initiation de la traduction, dont les déficiences sont liées à divers troubles. Pour mieux comprendre leur étiologie, nous avons décrit ici un protocole utilisant des ovocytes de Xenopus laevis évaluant la traduction du transcrit mos en présence d’un mutant du facteur d’initiation de traduction eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Les mécanismes moléculaires de la décondensation de la chromatine mitotique hautement compactée sont mal définis. Nous présentons un test acellulaire basé sur des amas de chromatine mitotique isolés de cellules HeLa et d’extrait d’œuf de Xenopus laevis qui reconstitue fidèlement le processus de décondensation in vitro.

A Cell Assay libre d&#39;étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

Les mécanismes de mise à l’échelle cellulaire et intracellulaire restent insaisissables. L’utilisation d’extraits d’embryons de xénope est devenue de plus en plus courante pour élucider les mécanismes de régulation de la taille des organites. Cette méthode décrit la préparation d’extraits d’embryons et un nouveau test de détartrage nucléaire permettant d’identifier les mécanismes de régulation de la taille nucléaire.

Un dosage cellulaire sans l&#39;aide<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extraits d&#39;étudier les mécanismes de règlement des tailles nucléaire

Les protéines contiennent souvent plusieurs domaines qui peuvent exercer différentes fonctions cellulaires. knock-out gène (KO) ne considèrent pas cette diversité fonctionnelle. Nous rapportons ici un échange de cassette à médiation recombinaison (CREM) approche structure-fonction dans les cellules à base de souches embryonnaires KO qui permet la dissection moléculaire de différents domaines fonctionnels ou variants d'une protéine.

Structure-fonction des études chez la souris à l&#39;aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d&#39;échange

Nous présentons une méthode pour la production d’in vitro auto-entretenue oscillations mitotique au niveau unicellulaire en encapsulant les extraits d’oeufs de Xenopus laevis dans eau-dans-huile microémulsions.

Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus

Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Découvrez l'analyse de la dégradation de la β-caténine dans un système biochimique acellulaire à base d'extrait d'œufs de Xenopus. Cette méthode permet d'identifier les modulateurs moléculaires du renouvellement protéique.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans

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