Name: RNAscope pour In situ Détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez la détection de l'ARNm E6/E7 du HPV dans les tumeurs de la tête et du cou par RNAscope. Cette technique d'hybridation in situ permet une visualisation sensible des biomarqueurs viraux dans les tissus inclus en paraffine.

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Pris en charge dans le cadre de subvention du NIH (R43/44CA122444) et subvention DOD BRCP (W81XWH-06-1-0682) à YL.

Une. Échantillon, équipements et Préparation des réactifs <ol><li> Couper échantillon de tissu en blocs de 3-4 mm d&#39;épaisseur, fixer à 10% de formol tamponné frais pour 16-32 heures à température ambiante (25 ° C) et de l&#39;intégrer dans de la paraffine. Couper FFPE en sections de 5 ± 1 um d&#39;épaisseur à partir de blocs FFPE, monter les coupes sur des lames et l&#39;air sec. Remarque: Les lames peuvent être stockées à température ambiante sous une dessiccation pendant jusqu&#39;à 3 mois. Les lames de tissus montés doivent être cuits dans un sèche-dessus à 60 ° C pendant 1 h avant l&#39;essai RNAscope. </li><li> Apportez hybridation Four à 40 ° C. Placez un papier d&#39;humidification dans le contrôle de l&#39;humidité du bac. Ajouter 50 ml dH 2 O au Livre d&#39;humidification pour mouiller complètement. Insérez le plateau couvert dans le four à préchauffer pendant au moins 30 min avant utilisation. </li><li> Faire 700 ml 1x Prétraitez 2 Solution (10 nl, tampon pH 6 citrate) par dilution 10x solution de prétraitement dans dH 2 O. Chauffer le 2 Solution 1x Pré-traiter à ébullition et maintain la température entre 100-104 ° C, tout en empêchant au cours d&#39;ébullition. </li><li> Assurez-3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC) en diluant préchauffé 50x tampon de lavage en DH 2 O. </li><li> Préparer 2 x 200 ml de xylene et 2 x 200 ml d&#39;EtOH à 100% pour le déparaffinage sous une hotte de laboratoire. </li><li> Préparer solution à 50% de coloration hématoxyline et réactif de bleuissement (0,01% de l&#39;eau ammoniacale) pour le post-coloration sous une hotte. </li><li> Préparer 200 ml de xylène, 200 ml de 70% et 2 x 200 ml d&#39;EtOH à 100% pour la déshydratation sous une hotte de laboratoire. </li><li> Sondes Préchauffer cibles à 40 ° C pendant 10 min et apportent détection RTU réactif du kit à température ambiante, y compris RTU Amp1, Amp2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown, et AMP6-Brown, à l&#39;exception chromogène DAB Brown-A et Brown-B . </li></ol> 2. RNAscope Assay Déparaffinage et déshydratation Après la cuisson, Déparaffiner les coupes de tissus dans le xylène pour 2 x 5 min en agitant fréquemment, et déshydraterdans EtOH à 100% pour 2 x 3 min en agitant fréquemment. Séchage pendant 5 min et dessiner une barrière hydrophobe autour de la section de tissu avec une barrière hydrophobe Pen. Prétraitements <ol><li> Incuber les coupes de tissu avec une Pré-traiter pendant 10 min à température ambiante pendant la trempe de l&#39;activité de la peroxydase endogène, les rincer à dH 2 O. </li><li> Incuber les coupes de tissu avec Prétraitement deux maintenus à une température d&#39;ébullition pendant 15 minutes pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, rincer deux fois dans dH 2 O. </li><li> Incuber les coupes de tissus avec Prétraitez 3 pendant 30 min à 40 ° C pour la digestion des protéines dans HybEZ four, rincer deux fois dans dH 2 O. </li></ol> Cible hybridation de la sonde sondes cibles HPV-HR 7 piscine comprennent: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58. Ajouter sondes HPV, ubiquitine C (UBC) et bactériennes sondes dapB gène séparément sur trois sections de tissus de manière adjacente. S&#39;hybride à 40 ° C en étuve pendant 2h, puis rincer dans du tampon de lavage 1x pour 2 x 2 min à température ambiante. Amplification du signal <ol><li> Incuber les coupes de tissu avec Amp1 (préamplificateur) pendant 30 min à 40 ° C, Amp2 (fond réducteur) pendant 15 min à 40 ° C, Amp3 (amplificateur) pendant 30 min à 40 ° C, et AMP4 (sonde marqueur) pendant 15 min à 40 ° C dans un four HybEZ. Après chaque étape d&#39;hybridation, rincer dans du tampon de lavage 1x pour 2 x 2 min à température ambiante. </li><li> Incuber les coupes de tissu avec AMP5 pendant 30 min et AMP6 pendant 15 min à RT. Après chaque étape d&#39;incubation, dans un tampon de rinçage pour lavage de 1x 2 x 2 min à température ambiante. </li></ol> Détection du signal Incuber les coupes de tissu avec DAB Mélange 01:01 en mélangeant un volume égal de Brown-A et-B Brown pendant 10 min à température ambiante, laver deux fois dans dH 2 O. La contre-coloration <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; coupes de tissus de coloration avec une solution de 50% d&#39;hématoxyline pendant 2 min à température ambiante, laver avec dH 2 O jusqu&#39;à ce que les lames sont claires tandis que le tissu reste violet. Tremper les lames en 0,01% d&#39;ammoniac dans dH 2 O pour 5x et suivie avec 5 immersions dans dH 2 O. Glisser montage Déshydrater les coupes de tissu dans 70%, 100% et 100% de EtOH pendant 2 min chacun, le xylene pendant 5 min, monter avec un milieu de montage à base de xylène.

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Tous les auteurs sont employés par et propres actions dans Advanced Diagnostics cellule, Inc.

Le test HPV RNAscope permis la visualisation directe de l&#39;ARNm E6/E7 in situ dans la tête associées au VPH et le cou carcinome épidermoïde. Le dosage RNAscope est entièrement compatible avec les tissus tumoraux couramment fixe et conserve la morphologie des tissus pour les corrélations histopathologiques (figure 2). Un avantage clé de l&#39;essai de RNAscope par rapport aux méthodes classiques de CISH est qu&#39;il amplifie spécifiquement les signaux d&#39;hybridation (figures 2B et 2E), sans amplifier le bruit de fond (figures 2C et 2F). Dans la pratique, la procédure de dosage RNAscope VPH peut être achevée dans un délai de 8 heures ou idéalement répartie sur deux jours. Le test HPV RNAscope a été utilisée pour déterminer le statut de HPV dans la tête et le cou carcinome spinocellulaire 12-16, démontrant 97% de sensibilité et 93% de spécificité en utilisant qRT-PCR comme méthode de référence 16. Chr classiqueISH omogenic pour HR HPV-ADN est très spécifique mais a une sensibilité de 80% ~ 12. Immunohistochimique (IHC) pour la coloration cellulaire de substitution marqueur p16 montre une excellente sensibilité mais peut générer des résultats faussement positifs, en particulier dans 15,18 cancers ORL nonoropharyngeal 15. La méthode actuelle de «l&#39;étalon or» de qRT-PCR pour le HPV ARNm E6/E7 détection nécessite tissu frais congelé pour des résultats optimaux et est techniquement complexe, ce qui limite son utilisation au laboratoire de recherche uniquement. En outre, il nécessite une extraction de l&#39;ARN qui fait qu&#39;il est impossible de corréler l&#39;expression HR-HPV avec de l&#39;ARNm E6/E7 histopathologie. Il ya plusieurs facteurs critiques pour le succès de l&#39;essai RNAscope. Tout d&#39;abord, pour de meilleurs résultats, les tissus doivent être fixés dans du formol 10% neutre tamponné frais à la température ambiante pendant 16-32 heures selon les directives ASCO / CAP 19. Deuxièmement, le four HybEZ est fortement recommandé car il permettres un contrôle optimal de la température et de l&#39;humidité pour la sonde d&#39;hybridation et de signaux étapes d&#39;amplification. En troisième lieu, il est important d&#39;éliminer tout excès de tampons résiduels avant chaque étape mais toujours garder la section de tissu de séchage au cours de l&#39;une de ces étapes. La procédure de RNAscope manuel décrit ici a été entièrement automatisé sur une lame système auto-coloration commerciale 10. Cela devrait grandement faciliter la normalisation des conditions d&#39;essai et d&#39;économie de travail manuel précieux dans les laboratoires de pathologie clinique. En outre, le logiciel d&#39;analyse d&#39;images dédié a été développé 10 pour identifier automatiquement les cellules et les signaux de coloration sur une lame numérisée, qui devrait contribuer à éliminer la subjectivité et améliorer la reproductibilité dans la notation. En résumé, le dosage RNAscope HPV détecte la présence de transcrits HR-HPV E6/E7 in situ d&#39;ARNm dans les tissus FFPE. Il dispose d&#39;un flux de travail qui est familier à la pathologie laboratoire cliniquetoires en permettant la visualisation directe de ceux-ci dans des coupes de tissus. Il dispose d&#39;une plate-forme idéale pour l&#39;examen (FFPE) des échantillons de tissus, et peut être facilement adopté par les laboratoires de pathologie de diagnostic.

Comptes papillomavirus humain à haut risque (HR-VPH) pour environ 5% de tous les cancers dans le monde 1. L&#39;incidence de cancer de l&#39;oropharynx associés au HPV a augmenté au cours des dernières décennies, surtout chez les hommes. oropharyngée carcinome épidermoïde de HPV-positif (OPSCC) constituera probablement une majorité de tous les cancers de la tête et du cou aux États-Unis au cours des 20 prochaines années 2. Carcinomes épidermoïdes de l&#39;oropharynx causées par le VPH sont associés à la survie favorable, et le statut de VPH de la tumeur est un facteur pronostique fort et indépendant pour la survie 3. Preuve de l&#39;activation transcriptionnelle des oncogènes viraux E6 et E7 est considéré comme l&#39;étalon-or pour la présence du VPH cliniquement pertinente 4. Cependant, la détection de l&#39;ARNm E6/E7 du tissu tumoral frais par la technique RT-PCR n&#39;est pas pratique, dans la pratique clinique de routine et est limitée à des laboratoires de recherche. Récemment, nous VHAe a développé une technologie ARN ISH roman intitulé RNAscope, qui permet une détection multiplex dans des cellules individuelles avec une seule molécule d&#39;ARN sensibilité des spécimens formol de paraffine fixe embarqués de tissus (FFPE) 5-10. Nous avons fourni trois sources de données pour la détection de molécule unique 5. Tout d&#39;abord, la conception et le signal système d&#39;amplification de la sonde RNAscope permis la détection de copie unique HER2 cibles d&#39;ADN génomique dans les cellules HeLa et SK-BR-3 lignées cellulaires. En second lieu, lorsqu&#39;on les compare avec des signaux d&#39;ADN génomique HER2, la distribution des intensités de fluorescence de HER2 ARNm points de signaux dans les cellules HeLa était compatible avec une molécule par point. Troisièmement, le nombre de points d&#39;ARNm de HER2 de signal par cellule adaptée étroitement le nombre de copies d&#39;ARNm de HER2 estimée par un essai de quantification à base de solution, supportant en outre une détection de molécule unique. En outre, une contre-coloration des noyaux avec DAPI en microscopie à fluorescence ou à l&#39;hématoxyline en microscopie à champ lumineux permet de visualiser les différents noyaux, which à son tour permet la détection et la quantification de cibles d&#39;ARN sur une base à cellule unique 10. La capacité d&#39;analyser l&#39;expression des gènes in situ dans des échantillons cliniques de routine RNAscope fait une plate-forme prometteuse pour la pathologie diagnostique, en particulier les analyses basées sur des sections de tissus FFPE 10,11. Nous avons mis au point un test de VPH à base RNAscope pour détecter l&#39;ARNm E6/E7 de sept génotypes VPH à risque élevé (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58) à l&#39;aide d&#39;un pool de sondes spécifiques de génotype. Nos récentes études OPSCC ont montré que le test HPV est RNAscope très sensible et spécifique pour déterminer le statut de VPH sur les tissus FFPE 12-17, et informe également le pronostic dans OPSCC 12,16. Le principe de la technologie RNAscope a été décrit précédemment 5. Ici, nous décrivons le protocole complet d&#39;analyse de RNAscope et démontrer son utilisation dans la détection des HPV dans les sections de tissus tumoraux FFPE.

<table><tbody><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Four, plateau et grille</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310011, 310012 310014</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 FFPE Kit de réactifs - Brown</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope HPV-HR7 Sonde HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 et 58, E6/E7 MRNA</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier</td><td>Pen Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill’s Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammoniac</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-300-49SHP</td><td></td></tr><tr>Four de<td>séchage</td><td></td><td></td><td>Capable de maintenir une température de 60&plus ; 1 &deg ; C</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td></td><td></td><td>Capable de maintenir la température à 40&plusmn ; 1 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

rnascope pour<em&gt; in situ</em&gt; détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Le «gold standard» pour la détection du VPH oncogène est la démonstration de la transcription actif VPH à risque élevé dans le tissu tumoral. Cependant, la détection de l&#39;ARNm E6/E7 par transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) nécessite l&#39;extraction d&#39;ARN qui détruit contexte tissulaire de la tumeur critique pour la corrélation morphologique et a été difficile à adopter dans la pratique clinique de routine. Notre ARN récemment développé une technologie d&#39;hybridation in situ, RNAscope dans, permet la visualisation directe de l&#39;ARN dans fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) tissu avec une sensibilité de la molécule unique et de la résolution d&#39;une seule cellule, ce qui permet très sensible et spécifique dans l&#39;analyse in situ d&#39;un biomarqueur de l&#39;ARN dans les échantillons cliniques de routine. Le test HPV RNAscope a été conçu pour détecter l&#39;ARNm E6/E7 de sept génotypes de HPV à haut risque (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58) en utilisant un ensemble de sondes spécifiques de génotype. Il a démontré une excellente sensibilitéet la spécificité contre la méthode actuelle de «gold standard» de détection de l&#39;ARNm E6/E7 par qRT-PCR. statut de HPV déterminé par RNAscope est fortement pronostique des résultats cliniques chez les patients atteints d&#39;un cancer de l&#39;oropharynx.

RNAscope HPV test flux de travail Le dosage RNAscope a un flux de travail très simplifié qui est similaire à l&#39;IHC (figure 1). Il se compose de quatre grandes étapes: prétraitement, hybridation, amplifications de signal et de détection. Elle emploie une stratégie de conception de la sonde unique qui assure une haute fidélité amplification du signal 5. Dans le dosage RNAscope HPV, les sept ensembles de sondes HR-HPV sont mis en commun, tous reconnus par le même système d&#39;amplification de signal lié à la peroxydase de raifort (HRP). Des signaux d&#39;hybridation spécifiques sont détectées sous forme de précipités bruns formés par réaction catalysée par la HRP chromogène DAB en utilisant comme substrat, qui peut être aisément visualisée par microscopie à fond clair standard. Coloration Représentant pour la détection du VPH La figure 2 montre des exemples d&#39;images de sections FFPE colorées de la tête et du cou carcinome épidermoïde. Dans le cas de HPV-positif (figureure 2A), les sondes HR-HPV détecté des signaux de fortes ponctuées spécifiquement dans les cellules tumorales. La sonde UBC détectée nombreux signaux cytoplasmiques ponctuées dans les deux cellules tumorales et des cellules stromales (Figure 2B). La sonde de dapB gène bactérien a démontré un fond propre (figure 2C). Dans le cas de HPV-négatif, à la fois la sonde HR-HPV et la sonde dapB détecté aucun signal (figures 2D et 2F), tandis que les signaux forts ont été détectés par la sonde UBC (figure 2E). Dans ce dosage, UBC sert de contrôle positif pour évaluer la qualité de l&#39;ARN des tissus et dapB comme contrôle négatif pour les signaux de fond. La notation pour la détermination du statut de HPV consiste à examiner tous les trois diapositives pour chaque cas. Le niveau de coloration sur le coulisseau de commande négative (dapB) de glissement est utilisé comme seuil: HPV positivité est défini par la présence d&#39;cytoplasmique ponctuées et / ou une coloration nucléaire qui était au-dessus du signal sur le coulisseau dabpB. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de test RNAscope. Illustration de RNAscope essai workflow. Le dosage RNAscope contient 4 étapes principales, prétraitements, sonde cible hybridation, l&#39;amplification du signal et la détection du signal. La totalité de l&#39;expérience peut être complétée en 8 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Figure 2. images Exemple de diapositives RNAscope colorées sections FFPE colorées avec des sondes pour HR-HPV, UBC (contrôle positif) et dapB (contrôle négatif).à partir de deux cas de HNSCC. AC. cas de HPV-positif. A, HR-HPV expression de l&#39;ARNm E6/E7 dans les cellules tumorales. Encart, un grossissement de 40X à montrer des signaux de ponctuées. B et C) des coupes de tissus adjacents montrant une coloration positive de UBC (B) et négatif pour dapB (C), respectivement. DF) HPV-négatif cas. D) aucune coloration pour le VPH ARNm E6/E7 , similaire au contrôle négatif dapB (F). E) UBC coloration positive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

La présence de VPH à risque élevé dans le tissu tumoral tête et du cou est associé à des résultats favorables. L&#39;ARN a récemment mis au point une technique d&#39;hybridation in situ appelé RNAscope permet la visualisation directe de l&#39;ARNm E6/E7 de HPV dans des coupes de tissu FFPE.

RNAscope pour<em&gt; In situ</em&gt; Détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer une détection sensible et spécifique des ARNm des gènes E6 et E7 du VPH à haut risque dans les cellules tumorales des cancers de la tête et du cou, en utilisant une technique nouvelle d'hybridation in situ ARN appelée RNA scope. Cette détection est réalisée en premier lieu en prétraitant les échantillons tissulaires sur les lames par la chaleur et une protéase, afin de rendre les cellules perméables et permettre l'accès des sondes. Dans une deuxième étape, les lames sont incubées avec un mélange de sondes dirigées contre sept types de VPH à haut risque, qui s'hybrident aux ARNm E6 et E7.Ensuite, amplifier les signaux d'hybridation en hybridant successivement avec l'amplificateur préamplificateur et la sonde marqueuse conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP). Le signal est alors détecté à l'aide d'un chromogène et visualisé par microscopie optique standard, ce qui permet d'obtenir des résultats montrant des signaux d'ARNm HPVE6 E7 sous forme de précipités bruns ponctuels dans les tumeurs positives au VPH, mais pas dans les tumeurs négatives au VPH. Le test RRA scope utilise une stratégie de conception de sondes nouvelle et exclusive pour l'hybridation chez les insectes.Il permet la visualisation de molécules uniques et la quantification des cibles. Cette technologie ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les biomarqueurs et du développement d'acides diagnostiques pour identifier et valider tout biomarqueur ARN découvert par des études de macro race ou de séquençage de nouvelle génération. La plupart des scientifiques ayant une expérience préalable en IHC ou en chacune des méthodes peuvent rapidement maîtriser cette technique.Je vais maintenant vous présenter une démonstration de l'ensemble du protocole en mettant en évidence les étapes clés afin de vous aider à maîtriser la technique. Les échantillons de tissus destinés à être analysés par cette technique d'hybridation in situ d'ARN sont fixés au formol. Des sections incluses en paraffine, d'une épaisseur de cinq micromètres plus ou moins un, sont déposées sur des lames une heure avant le test.Faites cuire les lames dans un four sec à 60 degrés Celsius pendant que les lames cuisent. Préparez le four d'hybridation. Portez la température à 40 degrés Celsius et placez une feuille humidifiante dans le bac de contrôle d'humidité.Ajoutez 50 millilitres d'eau distillée sur le papier humidifiant afin de l'humidifier complètement. Insérez le plateau couvert dans le four pour le préchauffer pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Préparez 700 millilitres de solution de prétraitement 1 x en diluant la solution de prétraitement 10 x dans de l'eau distillée.Chauffer la solution de prétraitement 1 x à ébullition et maintenir la température entre 100 et 104 degrés Celsius, tout en évitant l'ébullition excessive. Préparer trois litres de tampon de lavage 1 x en diluant le tampon de lavage 50 x préalablement réchauffé dans de l'eau distillée sous une hotte aspirante.Préparez les xylènes, l'éthanol à 70 % et l'éthanol à 100 % pour la déparaffinisation finale et la déshydratation. Préparez une solution de coloration à l'hématine à 50 % et de l'eau ammoniacale à 0,01 % ou un réactif de bleuissement pour la post-coloration. Préchauffez les sondes cibles à 40 degrés Celsius pendant 10 minutes.Portez tous les réactifs du kit de détection prêt à l'emploi à température ambiante, sauf le chromogène DAB brun A et brun B. Pour commencer ce test, désencrez les coupes tissulaires cuites au xylène deux fois pendant cinq minutes à chaque fois, avec agitation fréquente. Désydratez dans de l'éthanol à 100 % deux fois pendant trois minutes chacune, avec agitation fréquente.Laisser sécher à l'air pendant cinq minutes, puis tracer une barrière hydrophobe autour de la section tissulaire à l'aide du stylo à barrière hydrophobe. Commencer le prétraitement des sections tissulaires en les incubant avec la solution de prétraitement un pendant 10 minutes à température ambiante. Ceci permettra de bloquer l'activité peroxydasique endogène.Rincer à l'eau distillée. Ensuite, récupérer l'ARN en incubant les sections tissulaires pendant 15 minutes avec la solution de prétraitement deux maintenue à une température d'ébullition après 15 minutes, puis rincer deux fois à l'eau distillée pour la digestion des protéines. Traiter les sections tissulaires avec la solution de prétraitement trois et incuber au four d'hybridation à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.Une fois l'incubation de 30 minutes terminée, rincez les sections de tissu deux fois à l'eau distillée. L'étape suivante consiste en l'hybridation de la sonde cible à l'aide d'un pool de sondes détectant l'ARNm E six E sept de sept génotypes du VPH à haut risque : VPH 16, 18, 31, 33, 35, 52 et 58. Ajoutez les sondes VPH, la sonde d'ubiquitine C et la sonde du gène bactérien DAP B respectivement sur trois sections de tissu adjacentes.Hybrider à 40 degrés Celsius dans l’étuve pendant deux heures à la fin de l’incubation de deux heures. Rincer les sections tissulaires deux fois dans le tampon de lavage, deux minutes à chaque fois, à température ambiante, pour l’amplification du signal. Commencer par incuber les sections tissulaires avec l’amplificateur préalable AMP un pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius dans l’étuve d’hybridation.Rincer deux fois dans la solution de lavage pendant deux minutes chaque fois à température ambiante. Les étapes suivantes pour l'amplification du signal consistent à incuber les coupes tissulaires avec les réactifs suivants à 40 degrés Celsius pendant la durée indiquée, en effectuant deux rinçages dans la solution de lavage à température ambiante après chaque incubation. Après chaque incubation, ajouter AMP two background reducer pendant 15 minutes.AMP trois amplificateur pendant 30 minutes et sonde marquée AMP quatre pendant 15 minutes. Ensuite, incuber les sections tissulaires avec AMP cinq pendant 30 minutes à température ambiante ; après deux lavages dans le tampon de rinçage, incuber avec AMP six pendant 15 minutes à température ambiante, suivis de deux autres lavages dans le tampon de rinçage. Pour la détection du signal, préparer un mélange DAB un-à-un en mélangeant des volumes égaux de brun A et de brun B. Ajouter la solution sur les lames et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.Rincer deux fois à l'eau distillée. Contre-colorer les coupes tissulaires avec une solution d'hématoxyline à 50 % pendant deux minutes à température ambiante, puis rincer à l'eau distillée jusqu'à ce que les lames soient transparentes tout en maintenant les tissus. Plonger brièvement les lames dans une solution aqueuse d'ammoniaque à 0,01 % cinq fois, suivies de cinq plongées dans de l'eau distillée. Déshydrater les coupes tissulaires en les incubant deux minutes chacune dans de l'éthanol à 70 %, de l'éthanol à 100 % et de l'éthanol à 100 %, puis dans le xylène pendant cinq minutes.Enfin, montez les lames avec un milieu de montage à base de xylène. Voici des exemples d'images provenant de coupes colorées, formolées et incluses en paraffine de carcinome épidermoïde de la tête et du cou Sonoma. Dans le cas positif au VPH, les sondes VPH à haut risque ont détecté de forts signaux ponctuels spécifiquement dans les cellules tumorales. Cela est clairement visible dans l'encart à un grossissement de 40 x.La sonde témoin positive UBC a détectée de nombreux signaux cytoplasmiques ponctués dans les cellules tumorales et les cellules stromales. Alors que la sonde témoin négative DAP B a montré un fond propre dans le cas négatif au VPH, ni la sonde VPH à haut risque ni la sonde DAP B n'ont détecté de signaux, tandis que la sonde UBC a révélé des signaux intenses. L'analyse pour la détermination du statut VPH consiste à examiner les trois lames pour chaque cas.Le niveau de coloration sur la lame de contrôle négatif DAP B est utilisé comme seuil ; la positivité au VPH est définie par la présence d'une coloration ponctuée, cytoplasmique et/ou nucléaire supérieure au signal observé sur la lame DAP B. Le test RNA scope peut être réalisé en moins de huit heures, à condition d'être effectué correctement au cours de sa réalisation. Il est essentiel d'ajouter une quantité suffisante de solution pour recouvrir entièrement la zone tissulaire à chaque étape.Il est également important d'éliminer tout tampon résiduel en secouant doucement les lames entre chaque étape, tout en maintenant les lames blanches. La technologie rescope peut être appliquée pour la détection de pratiquement n'importe quels biomarqueurs ARN dans n'importe quelle cellule ou tissu d'une espèce quelconque.

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