Name: Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour linvestigation des métabolites dans Medicago truncatula nodules racinaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez l'imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l'analyse des métabolites dans les nodules racinaires de Medicago truncatula. Cette méthode permet de détecter les métabolites endogènes et d'étudier les processus biologiques des légumineuses.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jean-Michel Ané dans le département d&#39;agronomie à l&#39;UW-Madison pour fournir des échantillons de Medicago truncatula. Ce travail a été financé en partie par un financement de la National Science Foundation (NSF) subvention CHE-0957784, l&#39;Université du Wisconsin Graduate School et la Fondation Wisconsin Alumni Research (FRAO) et le programme de bourses de recherche Romnes Faculté (LL). EG reconnaît un diplômé de bourses de recherche NSF (DGE-1256259).

Une. Instrumentation <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Utilisez un spectromètre de masse équipé d&#39;une source MALDI pour l&#39;analyse de petites molécules (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Effectuer des acquisitions en mode ion positif ou négatif selon les analytes d&#39;intérêt. Spécifiez une plage de masse de l&#39;intérêt et de recueillir 500 coups laser / spot à 50 um intervalles à la fois les dimensions x et y sur la surface de l&#39;échantillon pour produire des images d&#39;ions. La largeur de la trame et le nombre de tirs laser peuvent être ajustés pour obtenir une résolution spatiale plus élevée et une intensité de signal maximale, respectivement. Utilisation de la matrice DHB pics ou des étalons internes appliquées à la glissière ou directement au tissu de calibrer les spectres de masse. </li><li> Résolution LC-MS haute. (Voir le tableau des Matériaux / Équipement) extraits d&#39;échantillons Exécuter avec LC-MS en utilisant soit en phase inverse (RP) LC avec une colonne C-18, ou phase normale (NP) avec une colonne HILIC selon les analytes d&#39;intérêt. Utilisez phases mobiles etgradients comme appropriés pour le type d&#39;échantillon spécifique. Effectuer des acquisitions en modes d&#39;ions positifs ou négatifs en fonction du type d&#39;échantillon. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Coupez le nodule de racine de la plante, laissant 3-4 mm de racine attachés au nodule. </li><li> Immédiatement après dissection, utiliser une pince pour placer le tissu dans une tasse de cryostat et couvrir avec de la gélatine (100 mg / ml dans de l&#39;eau déminéralisée). Il est essentiel pour le tissu devant être collé au fond de la tasse, sans bulles d&#39;air. </li><li> Flash geler le tissu en plaçant la tasse dans un bain de glace carbonique / éthanol jusqu&#39;à ce que la gélatine durcit et devient opaque. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Retirer les échantillons du congélateur à -80 ° C, couper la coupe du cryostat plastique et éliminer les excès de gélatine. Montez le tissu intégré à la pince de cryostat avec une quantité de taille dime de la température de coupe optimale (OCT) médias, tout en ne laissant pas les PTOM toucher le tissu. Placez dans cryostatboîte jusqu&#39;à la solidification PTOM. </li><li> Autoriser le mandrin et la gélatine de s&#39;équilibrer dans la boîte de cryostat (de série à -20 ou -25 ° C) pendant environ 15 min. </li><li> Utilisez le cryostat (voir le tableau des Matériaux / Équipement) de l&#39;article tissu environ l&#39;épaisseur d&#39;une cellule (8-20 um selon le type de tissu) et dégel monter chaque tranche sur le verre revêtu d&#39;ITO en chauffant le dos (non-ITO côté) d&#39;une lame de verre revêtu d&#39;ITO sur le dos de votre main-enduit. Placez le côté revêtu d&#39;ITO de la glissière réchauffé à proximité de la tranche de tissu congelé et permettre à la tranche de coller sur la lame. Placer les sections rapprochées sur la diapositive fournira un meilleur alignement pendant MSI. </li></ol> 3. Matrice d&#39;application <ol><li> Airbrush application de MALDI Matrice <ol><li> Toutes les procédures de l&#39;aérographe doivent être effectuées dans une hotte. </li><li> Bien nettoyer le récipient de solution à l&#39;aérographe et la buse (voir le tableau des Matériaux / Équipement) avec du méthanol etremplir le récipient de la solution avec une solution de matrice DHB (150 mg / ml dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v). </li><li> Maintenir l&#39;aérographe environ 35 cm à partir de l&#39;échantillon et d&#39;appliquer de 10 à 15 couches de matrice sur la surface de la lame d&#39;une durée de 10 sec 30 sec pulvérisation et le temps de séchage entre chaque couche. </li><li> Bien nettoyer l&#39;aérographe à nouveau avec du méthanol lorsque vous avez terminé pour éviter le colmatage de la solution de matrice. </li></ol></li><li> Demande pulvérisateur automatique de MALDI Matrice <ol><li> Suivez les instructions de démarrage fournis par les fabricants du système de pulvérisation automatique. </li><li> Pour MSI de métabolites dans les nodules des racines à l&#39;aide de 40 mg / ml (dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v) DHB comme matrice, régler la température à ~ 80 ° C, la vitesse de 1250 mm / min, le débit à 50 ul / min, et le nombre de passes à 24. Pour une meilleure protection, il est recommandé de faire pivoter la buse 90 ° et / ou de décalage de la buse de 1,5 mm entre chaque passe. Lancer méthode de pulvérisation. Comme un SIde note, le système de pulvérisation particulière utilisée ici chauffe la buse pour l&#39;évaporation rapide du solvant. Comme le solvant s&#39;évapore, la concentration de la matrice augmente rapidement. La matrice appliquée à l&#39;échantillon avec l&#39;aérographe et le pulvérisateur automatique ont des concentrations comparables. </li><li> Suivez les instructions de mises à l&#39;arrêt fournies par les fabricants du système de pulvérisation automatique. </li></ol></li><li> Application de sublimation matrice MALDI <ol><li> Peser 300 mg DHB dans le fond de la chambre de sublimation (voir le tableau des Matériaux / Équipement). </li><li> Collez la lame de verre au doigt froid (partie supérieure de la chambre de sublimation) avec les sections de tissus vers le bas avec du ruban adhésif double-face conductrice. Couvrir l&#39;ensemble du dos de la lame avec le ruban adhésif double face, même pour la conductivité, la production même dépôt de matrice. </li><li> Serrer les moitiés supérieure et inférieure de la chambre de sublimation avec le serre-joint. Connectez le vide et annonced glace et l&#39;eau froide dans le réservoir supérieur. </li><li> Placer la chambre de sublimation dans une enveloppe chauffante qui est à la température ambiante. </li><li> Mettre en marche la pompe à vide. Attendez 15 minutes et tourner sur le chauffe-ballon. Le chauffe-ballon doit atteindre 120 ° C au cours de 10 min. </li><li> Après 10 minutes, éteindre le feu, fermer le robinet à vide (si l&#39;intérieur de la chambre reste sous vide) et arrêter la pompe à vide. </li><li> Laisser la chambre pour venir à la température ambiante, ouvrir la vanne en relâchant la pression à vide et retirer l&#39;échantillon. La taille de la chambre de sublimation permettra de déterminer la quantité de matrice sublimé à la lame de verre. Les grandes sublimation chambres (la taille d&#39;un bécher de 400 ml) utilisent environ 300 mg de DHB tandis que les chambres plus petites (de la taille d&#39;un bécher de 150 ml) utilisent environ 100 mg de DHB et il faudra couper la lame de verre de sorte qu&#39;il s&#39;inscrit dans la chambre. </li></ol></li></ol> 4. Acquisition de l&#39;image <ol> &lt;li&gt; Marquer un modèle + à chaque coin de l&#39;échantillon avec un stylo WiteOut de fluide de correction pour être utilisé comme &quot;enseigner points&quot;. Placez la lame de verre dans la plaque de l&#39;adaptateur de diapositives MALDI et prendre une image optique de l&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;un scanner. </li><li> Mettre en place un fichier d&#39;acquisition d&#39;image en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l&#39;appareil avec une taille de pas de trame de 50 um et un diamètre de laser égale ou plus petite que la taille de pas de trame. Sur cet instrument particulier, le réglage du laser donne un diamètre minimum de laser d&#39;environ 10 um et petit réglage de laser a un diamètre de 40 à 50 um. </li><li> Chargez l&#39;image optique dans le logiciel et aligner la plaque avec l&#39;image optique. </li><li> Étalonner l&#39;instrument avant de commencer l&#39;acquisition en utilisant des ions communs de la matrice de munitions, des normes internes, ou un mélange d&#39;étalonnage. </li><li> Spécifiez les zones de tissu à analyser avec MSI, y compris une place de matrice pure sur la diapositive pour être utilisé comme un «blanc». </li><li> Commencez acquisition. </li></ol> 5. Génération de l&#39;image <ol><li> Ouvrez le fichier d&#39;image dans le logiciel disponible dans le commerce fournies par le vendeur et extraire les images d&#39;ions. Autres logiciels open-source est disponible pour MSI traitement de données 19. </li></ol> 6. Identification des métabolite <ol><li> Sélectionner un spécifique m / z d&#39;intérêt à partir du spectre de masse en utilisant le logiciel spécifique du fournisseur (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Un analyte peut être distingué d&#39;un ion de matrice quand un pic de l&#39;analyte est choisi dans le spectre de masse et des images d&#39;ions sont générés spécifiquement localisée dans la section de tissu. </li><li> Générer la liste des analytes d&#39;intérêt et effectuer des expériences MS / MS. Voir le tableau 1 et tableau 2 résultats représentatifs pour les listes d&#39;analytes de l&#39;échantillon. </li><li> Effectuer une analyse ciblée LC-MS sur un spectromètre de masse à haute résolution (ou haute résolution MALDI-MS si disponible) pour obtenir précismesures de la masse des analytes d&#39;intérêt et aussi effectuer LC-MS/MS des analytes cibles pour obtenir des motifs de fragmentation caractéristiques. </li><li> Effectuer base de données de recherche afin de déterminer les identifications putatifs pour les analytes ciblés. Exemples de bases de données sur les métabolites comprennent: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, et BDMH. </li><li> Pour confirmer les identifications putatifs de précision recherche de base de données de masse, correspondre à la MS / MS des analytes ciblés de spectres MS / MS de normes, de la littérature, et / ou logiciels de prédiction de la fragmentation. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Comme discuté ci-dessus, la préparation de l&#39;échantillon est l&#39;étape la plus critique dans le flux de travail MSI. Intégrer le tissu inégalement fera sectionnement d&#39;être difficile ou impossible dans certains cas. La taille de la section et le temps d&#39;équilibrage adéquat sont essentiels au maintien de l&#39;intégrité des tissus et d&#39;éviter de pliage et de larmes. Sélection de la matrice et de la technique d&#39;application va jouer un rôle dans la détermination des types de substances à analyser à dé...

Le domaine en pleine croissance de la métabolomique a de nombreuses applications biologiques importants, notamment la découverte de biomarqueurs, déchiffrer les voies métaboliques des plantes et d&#39;autres systèmes biologiques, et de la toxicologie profilage 4,6-10. Un défi technique majeur lors de l&#39;étude des systèmes biologiques est d&#39;étudier les voies métabolomique sans les perturber 11. MALDI-MSI permet une analyse directe de tissus intacts qui permet la détection sensible des analytes dans les organes simples 12,13 et même des cellules individuelles 14,15. La préparation des échantillons est une étape cruciale dans la production d&#39;images de spectrométrie de masse fiables et reproductibles. La qualité des images dépend grandement de facteurs tels que le tissu support d&#39;enrobage, l&#39;épaisseur de coupe, une matrice MALDI, et la technique d&#39;application de la matrice. Pour des applications d&#39;imagerie, de l&#39;épaisseur de section idéal est la largeur d&#39;une cellule (8-20 um en fonction du type d&#39;échantillon). MALDI nécessite le dépôt d&#39;une organique, cristalline composé de matrice, typiquement un acide faible, sur l&#39;échantillon pour faciliter l&#39;ablation analyte et de l&#39;ionisation. Différentes matrices 16 fournissent différentes intensités de signal, des ions interférents et l&#39;efficacité d&#39;ionisation des différentes classes de composés. La technique d&#39;application de la matrice joue également un rôle dans la qualité des images spectrales de masse et de différentes techniques appropriées pour les différentes classes d&#39;analytes. Trois méthodes d&#39;application de la matrice sont présentés dans ce protocole: aérographe, pulvérisateur automatique, et la sublimation. Airbrush l&#39;application de la matrice a été largement utilisé dans l&#39;imagerie MALDI. L&#39;avantage de l&#39;application de la matrice aérographe est qu&#39;il est relativement facile et rapide. Cependant, la qualité de l&#39;application de la matrice de l&#39;aérographe dépend fortement de la compétence de l&#39;utilisateur et a tendance à être moins reproductible et provoquer la diffusion d&#39;analytes, en particulier des petites molécules 17. Systèmes de pulvérisation automatiques ont mécaniciens similaires à l&#39;aérographe demande de matrice, mais le VHAe été mis au point pour éliminer la variabilité observée avec l&#39;application manuelle de l&#39;aérographe, faisant de la pulvérisation plus reproductible. Cette méthode peut parfois être plus de temps que l&#39;application traditionnelle de la matrice de l&#39;aérographe. Les deux aérographe manuel et systèmes de pulvérisation automatiques sont les méthodes d&#39;application de la matrice à base de solvants. La sublimation est une technique d&#39;application de matrice sèche qui devient de plus en plus populaire pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse des métabolites et des petites molécules, car il réduit la diffusion de l&#39;analyte, mais il lui manque la nécessaire solvant pour extraire et observer composés de masse plus élevées 18. Identification confiante de métabolites nécessite généralement des mesures de masse précises pour obtenir des identifications putatifs suivie par de masse en tandem (MS / MS) des expériences de validation, avec spectres MS / MS est comparé aux normes, la littérature, ou spectres théoriques. Dans ce protocole haute résolution (puissance de 60 000 à m / z 400 résoudre masse), la chromatographie liquide (LC)-MS est couplé à MALDI-MSI à obtenir à la fois l&#39;information spatiale et identifications confiants de métabolites endogènes, en utilisant Medicago truncatula racines et nodosités des racines comme le système biologique. Expériences MS / MS peuvent être effectuées directement sur le tissu avec MALDI-MSI ou d&#39;extraits de tissus avec LC-MS et utilisés pour la validation des identifications de métabolites. Ce protocole fournit une méthode simple pour cartographier métabolites endogènes dans M. truncatula, qui peut être adapté et appliqué à MSI de petites molécules dans différents types de tissus et les systèmes biologiques.

<table><tbody><tr><td>Gélatine</td><td>Difco</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td><td>chaleur pour dissoudre</td></tr><tr><td>Cryostat- HM 550</td><td>Thermo Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain (ITO)&nbsp ;</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (largeur x longueur x épaisseur)</td></tr><tr><td>Matrice de l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB)&nbsp ;</td><td>ICN Biomedicals</td><td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx ? ItemID=1787195">PI90033</a></td><td></td></tr><tr><td>Aérographe</td><td>Paasche Airbrush Company</td><td>TG-100D</td><td>couplé à un récipient en acier de 75 ml</td></tr><tr><td>Système de pulvérisation matricielle automatique - TM-Sprayer</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td>HTX. TMSP. H021-U</td><td>Des instructions spécifiques de démarrage et d’arrêt seront données lors de l’installation de l’instrument</td></tr><tr><td>Appareil de sublimation&nbsp ;</td><td>Chemglass Life Science</td><td><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide- Alcatel 2008 A</td><td>Ideal Vacuum Products</td><td>P10976</td><td>Pression ultime = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td>276601</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td>269841</td><td>Un exemple de « logiciel spécifique au vendeur"</td></tr><tr><td>MALDI LTQ Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td><td>Instrument MALDI haute résolution pour des mesures de masse précises</td></tr><tr><td>Q Exactive</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Instrument LC-MS haute résolution pour des mesures de masse précises</td></tr></tbody></table>

imagerie maldi-spectrométrie de masse pour l&#39;investigation des métabolites dans<em&gt; medicago truncatula</em&gt; nodules racinaires

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

La plupart des techniques utilisées pour l&#39;étude de petites molécules, telles que les produits pharmaceutiques ou les métabolites endogènes, utiliser les extraits de tissus qui nécessitent l&#39;homogénéisation du tissu d&#39;intérêt qui pourraient provoquer des changements dans les voies métaboliques étudiées 1. Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil d&#39;analyse puissant qui peut fournir des informations spatiales d&#39;analytes dans des tranches intactes d&#39;échantillons de tissus biologiques 1-5. Cette technique a été largement utilisée pour étudier divers types de composés, y compris les protéines, les peptides, les lipides et les petites molécules telles que les métabolites endogènes. Avec laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI)-MSI, les distributions spatiales de plusieurs métabolites peuvent être détectés simultanément. Ici, une méthode développée spécifiquement pour la conduite non ciblées métabolomique expériences MSI sur les racines des légumineuses et des nodules racinaires est présenté qui pourrait révéler un aperçu des processus biologiques qui ont lieu. Laméthode présentée ici montre un flux de production typique MSI, à partir de la préparation des échantillons pour l&#39;acquisition d&#39;images, et met l&#39;accent sur l&#39;étape d&#39;application de la matrice, ce qui montre plusieurs techniques d&#39;application de matrice qui sont utiles pour la détection de petites molécules. Une fois les images MS sont générés, l&#39;analyse et l&#39;identification des métabolites d&#39;intérêt sont discutés et démontrés. Le workflow standard présenté ici peut être facilement modifié pour différents types de tissus, des espèces moléculaires et de l&#39;instrumentation.

Une vue d&#39;ensemble de MSI expérimental est représenté sur la figure 1. Au tout début de l&#39;expérience, la préparation des échantillons est une étape critique. Les nodules sont supprimés de la racine de la plante et intégrés dans de la gélatine. Le tissu doit être plaqué contre la coupe du cryostat, sans bulles, alors qu&#39;il est gelé, ce qui permettra d&#39;assurer un alignement plus facile et correcte du tissu pendant qu&#39;il est sectionné. Lorsque le tissu est coupé, il est important de cou...

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil puissant qui peut être utilisé pour découvrir et identifier les différentes espèces chimiques dans les tissus intacts, en préservant les composés dans leur environnement naturel, qui peuvent fournir de nouvelles perspectives dans les processus biologiques. Ici un procédé MSI développé pour l&#39;analyse de petites molécules est décrite.

Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l&#39;investigation des métabolites dans<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nodules racinaires

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une imagerie spectrométrique de masse fiable et multiplexée de petites molécules dans un tissu racinaire végétal. Cela est accompli en premier lieu en préparant les échantillons de tissu à la taille appropriée. La deuxième étape consiste à optimiser et à appliquer la matrice MALDI sur l'échantillon de tissu.Ensuite, l'échantillon est soumis à la MALDI, et les MSI et les spectres sont collectés à travers le tissu. La dernière étape consiste en le traitement des données, au cours duquel les analytes biologiquement importants peuvent être identifiés. En définitive, la MSI par MALDI est utilisée pour détecter les métabolites endogènes présents dans les nodosités racinaires des légumineuses.Cette méthode peut fournir des informations sur les métabolites présents dans les tissus racinaires de plantes, mais elle peut également être appliquée à l'étude de petites molécules et de tissus provenant d'autres systèmes modèles, notamment les mammifères, les insectes crustacés, et d'autres encore. Tout d'abord, retirez les échantillons de tissu végétal préalablement préparés du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, retirez le godet plastique du cryostat et éliminez l'excès de gélatine. Fixez le tissu inclus sur un porte-échantillon de cryostat à l’aide d’une quantité de milieu de congélation OCT (optimal cutting temperature) équivalente à celle d’une pièce de dix cents, en veillant à ce que l’OCT n’entre pas en contact avec le tissu.Placer le porte-échantillon du cryostat dans une boîte de cryostat réglée à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce que l'OCT soit solidifié. Après avoir laissé le porte-échantillon et la gélatine équilibrer en AC dans la boîte de cryostat pendant environ 15 minutes, utiliser le cryostat pour couper le tissu en sections d'une épaisseur d'environ une cellule. Ensuite, monter chaque section sur une lame de verre prérefroidie à l'aide du pouce en réchauffant le côté non revêtu de la lame sur le dos de la main.Placez ensuite le côté du porte-objet réchauffé recouvert d'ITO près de la tranche de tissu congelé et laissez la tranche adhérer au porte-objet en vue de l'application au pulvérisateur de la matrice MALDI. Nettoyez soigneusement le récipient de la solution du pulvérisateur et le tuyau avec du méthanol, puis remplissez le récipient avec la solution de matrice DHB. Tenez le pulvérisateur à environ 35 centimètres de l'échantillon et appliquez 10 à 15 couches de matrice sur la surface du porte-objet, chaque pulvérisation durant 10 secondes, suivie d'un temps de séchage de 30 secondes entre chaque couche.Une fois terminé, nettoyer soigneusement l'aérographe avec du méthanol afin d'éviter tout colmatage. En raison de la solution matricielle, il est important de noter que, bien que les aérographes soient plus facilement disponibles, les systèmes automatiques de pulvérisation de matrice produisent souvent une couverture de matrice plus uniforme et reproductible pour l'application par sublimation de la matrice MALDI. Peser 300 milligrammes de DHB au fond de la chambre de sublimation. Fixer la lame de verre sur le doigt froid à l'aide d'un ruban adhésif conducteur double face, les sections tissulaires étant orientées vers le bas. Couper la lame si elle est trop grande.Pour la chambre de sublimation, fixez les deux moitiés supérieure et inférieure de la chambre ensemble à l’aide d’une pince C. Ensuite, placez la chambre de sublimation dans un chauffe-ballon à température ambiante. Branchez le vide et ajoutez de la glace dans de l’eau froide dans le réservoir supérieur.Une fois la pompe à vide en marche, attendez 15 minutes, puis allumez le chauffage du manteau. Après 10 minutes, éteignez le chauffage, fermez le robinet du vide et arrêtez la pompe à vide. Une fois que l'enceinte a refroidi à température ambiante, ouvrez le robinet pour relâcher la pression du vide et retirez l'échantillon.Ensuite, marquez un motif en forme de croix sur chaque coin de l'échantillon à l'aide du stylo à encre correctrice, afin de l'utiliser comme points de repère. Placez la lame de verre dans la plaque adaptateur Maldi et prenez une image optique de l'échantillon à l'aide d'un scanner. Vérifiez l'image sur l'ordinateur et faites pivoter l'image pour qu'elle s'affiche correctement à l'écran.Dans la même orientation, l'échantillon sera placé dans l'appareil. Configurez un fichier d'acquisition d'image à l'aide du logiciel fourni par le fabricant de l'appareil, avec une taille de pas de balayage de 50 micromètres et un diamètre de laser égal ou inférieur à la taille de pas de balayage. À ce stade, chargez l'image optique dans le logiciel et alignez la plaque avec l'image optique.Après avoir étalonné l'instrument, spécifiez les zones de tissu à analyser par imagerie de spectrométrie de masse (MSI), y compris un point de matrice pure sur la lame servant de témoin. Ensuite, lancez l'acquisition. Une fois l'acquisition des données terminée, ouvrez le fichier d'imagerie dans le logiciel fourni par le fabricant et extrayez les images ioniques en sélectionnant un rapport masse/charge spécifique d'intérêt à partir du spectre de masse. À l'aide du logiciel, créez une liste d'analytes spécifiques d'intérêt pour une identification ultérieure.Effectuez une recherche dans la base de données de masse exacte afin de déterminer les identifications présumées des analytes ciblés. Pour confirmer que les identifications présumées issues de la recherche dans la base de données de masse exacte correspondent aux spectres MS, comparez les spectres MS des analytes ciblés à des spectres MS/MS de standards, de données de la littérature ou de logiciels de prédiction de fragmentation. Ci-dessous figure une image optique d'une section de nodule racinaire de Tula mego.Voici un exemple d'image optique de la couverture de la matrice et des tailles de cristaux obtenues respectivement par pulvérisation au pistolet aérographe et par sublimation. La méthode d'application au pistolet aérographe génère des cristaux de grande et petite taille. Alors que la méthode au pulvérisateur automatique produit des cristaux petits et uniformes, la sublimation donne une couche unique et homogène de matrice.Les matrices classiques comme le DHB produisent de nombreux ions dans la plage de masse inférieure à 500 Daltons. Ces ions de matrice peuvent interférer avec la détection des métabolites dans cette plage. On montre ici les spectres de masse du matériau matrice DHB seul comparés à ceux de tissu de nodule racinaire recouvert de matrice DHB.Les pics de la matrice peuvent être distingués des véritables métabolites à l'aide des images MS. Lorsqu'on clique sur un pic, l'image ionique est extraite et affichée superposée à l'image optique. Les pics qui produisent des images présentant une localisation nette dans le tissu et qui ne sont pas présents dans la zone d'imagerie contenant uniquement la matrice sont considérés comme des métabolites. Ci-dessous figurent plusieurs images ioniques représentatives de métabolites trouvés dans le tissu des nodosités racinaires.Alors que des exemples d'images de spectrométrie de masse correspondant à des pics liés à la matrice sont illustrés ici, cette image montre une localisation distincte dans le tissu du nodule racinaire et l'absence de signal dans la zone de matrice uniquement qui a été imagée. Ce signal présente une faible localisation et est présent sur l'ensemble du tissu. Le signal est également observé dans la zone de matrice uniquement qui a été imagée.L'objectif final des expériences de métabolomique non ciblée est de détecter et de déterminer les analytes biologiquement importants, puis d'identifier les composés d'intérêt. Un exemple de métabolite détecté par IMS et LC-MS est présenté ici. Ce métabolite a été identifié comme étant l'hème sur la base de la masse exacte obtenue par LC-MS à haute résolution et du spectre MS/MS.Ces données MS/MS ont été comparées aux spectres MSM S publiés précédemment par Shima et Sato, correspondance confirmée par les deux spectres MSM S. Ainsi, l'identité du rapport masse sur charge de 6 1 6 0,2 a été attribuée avec certitude au hème, sur la base de la recherche dans une base de données de masses exactes et de la comparaison des données MS/MS avec celles de la littérature. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'utilisation de la technique MALDI et de l'imagerie par spectrométrie de masse pour détecter et cartographier la distribution spatiale de métabolites biologiquement pertinents, au moyen d'une méthode applicable à l'étude de petites molécules dans divers types de tissus et systèmes modèles.

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JoVE Journal

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Biologie

Un moyen rapide est décrite afin de mieux connaître la structure des polysaccharides dans une matrice extracellulaire. La méthode tire parti de la spécificité de glycosylhydrolases et la sensibilité de la spectrométrie de masse permettant d'infimes quantités de matériaux à analyser. Cette technique est adaptable pour être utilisé directement sur le tissu lui-même.

Profilage de masse Oligo (OLIMP) de polysaccharides extracellulaires

Une source d’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) fonctionnant à pression atmosphérique a été développée en couplant la désorption laser dans l’infrarouge moyen et la post-ionisation par électronébulisation. Une matrice de glace exogène a été utilisée comme matrice d’absorption d’énergie pour faciliter la désorption résonnante du matériau lié aux tissus. Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape pour la réalisation de l’IR-MALDESI MSI de souris néonatale du corps entier.

Corps entier Spectrométrie de masse d&#39;imagerie par infrarouge laser assistée par matrice désorption Electrospray Ionisation (IR-MALDESI)

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire est une technique d’analyse chimique directe qui minimise la préparation de l’échantillon et élimine la chromatographie, permettant la détection rapide de petites molécules de tissus végétaux.

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

Cette méthode utilise l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) pour comprendre les processus métaboliques des feuilles de S. alba exposées aux xénobiotiques. La méthode permet la localisation spatiale des composés d’intérêt et de leurs métabolites prédits dans des tissus spécifiques et intacts.

Étude du métabolisme des xénobiotiques dans les feuilles de Salix alba par imagerie par spectrométrie de masse

Un protocole d’étude des tissus biologiques à haute résolution spatiale à l’aide d’une microscopie par résonance magnétique à champ ultra-élevé (MRM) à l’aide de microcoils est présenté. Des instructions étape par étape sont fournies pour caractériser les microcoils. Enfin, l’optimisation de l’imagerie est démontrée sur les racines des plantes.

Étalonnage et utilisation des performances de microcoil MRM démontrés sur les racines de la truncatule Medicago à 22 T

L’objectif de ce protocole est de fournir des conseils détaillés sur la préparation des échantillons lors de la planification d’expériences utilisant MALDI MSI pour maximiser la détection métabolique et moléculaire dans les échantillons biologiques.

Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Dans cette étude, une série de méthodes sont présentées pour préparer des échantillons DESI-MSI provenant d’usines, et une procédure d’installation d’assemblage DESI, d’acquisition de données MSI et de traitement est décrite en détail. Ce protocole peut être appliqué dans plusieurs conditions d’acquisition d’informations de métabolome spatial chez les plantes.

Visualisation des métabolites identifiés dans le métabolome spatial de la médecine traditionnelle chinoise à l’aide de DESI-MSI

Ce protocole visait à décrire des directives détaillées sur la préparation de sections d’échantillons de graines dures à faible teneur en eau pour l’analyse MALDI-IMS, en maintenant la distribution et l’abondance d’origine des analytes et en fournissant un signal de haute qualité et une résolution spatiale.

Préparation de graines de palmier dur pour l’analyse par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Une méthode avancée a été mise au point pour l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) des organoïdes cérébraux qui permet de cartographier la distribution des métabolites au sein de ces modèles. Cette technologie offre un aperçu des voies métaboliques cérébrales et des signatures des métabolites au cours du développement précoce et de la maladie, promettant une compréhension plus profonde du fonctionnement du cerveau humain.

Imagerie moléculaire d’organoïdes cérébraux humains à l’aide de la spectrométrie de masse 

Nous démontrons comment les plantes racines chevelues composite peut être utilisé pour étudier les interactions plante-Rhizobium et la nodulation dans les difficiles à transformer les...

Génération de plantes dans les composites Medicago truncatula Utilisées pour les dosages nodulation

Découvrez l'imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l'analyse des métabolites dans les nodules racinaires de Medicago truncatula. Cette méthode permet de détecter les métabolites endogènes et d'étudier les processus biologiques des légumineuses.

Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l'investigation des métabolites dans

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