Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'interaction entre deux protéines dans des cellules vivantes en culture. Cela est réalisé en sous-clonant les ADNc des deux protéines d'intérêt dans des plasmides contenant la séquence codant pour la luciférase ou la protéine fluorescente jaune, abrégée en YFP, afin de créer des vecteurs d'expression des protéines dans des cellules de mammifères. Dans une deuxième étape, les plasmides sont transfectés dans des cellules en culture, ce qui conduit à l'expression de protéines de fusion YFP et luciférase.

Ensuite, le substrat de la luciférase est ajouté aux cellules afin d'initier l'émission de lumière par la luciférase. Les résultats obtenus montrent une interaction entre les deux protéines de fusion basée sur le transfert d'énergie de la LUCIFERASE vers le YFP. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la co-immunoprécipitation est qu'elle permet d'observer les interactions entre protéines dans des cellules vivantes.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle en déterminant si une mutation identifiée chez un patient affecte les interactions entre protéines. La première étape de la procédure sera démontrée par RAB tric, étudiante au doctorat dans mon laboratoire. Pour commencer, créez les plasmides comme décrit dans le protocole écrit. Estimez leur concentration en fonction de l'absorbance à 260 nanomètres.

Déterminez la masse moléculaire de chaque plasmide en multipliant le nombre de paires de bases par 650.Daltons. Utilisez la concentration et la masse moléculaire pour calculer la concentration molaire de chaque préparation de plasmide. Diluez les préparations d'ADN plasmidique à une concentration de 36 nano molaire.

Il s'agit des stocks de travail qui seront utilisés pour préparer les mélanges d'ADN destinés à la transfection. L'aspect le plus délicat de cette procédure consiste à préparer les mélanges d'ADN. Pour garantir le succès, nous créons des feuilles de calcul afin de précalculer la quantité exacte de chaque composant, et nous faisons preuve d'une grande rigueur.

Lors de la préparation des mélanges d'ADN, préparez un premier mélange d'ADN témoin contenant 1800 nanogrammes de plasmide porteur dans un volume final de 20 microlitres d'eau. Préparez ensuite un second mélange d'ADN témoin en utilisant cinq microlitres du construct témoin P look.

Ajouter du plasmide vecteur pour obtenir une masse totale d'ADN de 1800 nanogrammes. Ajouter de l'eau pour ajuster le volume final à 20 microlitres. Préparer un troisième mélange d'ADN témoin contenant cinq microlitres de la construction témoin P look et cinq microlitres de la construction témoin PYFP.

Ajouter le plasmide vecteur et de l'eau comme précédemment. Enfin, préparer un quatrième mélange d'ADN témoin contenant cinq microlitres du construct témoin positif. Ajouter à nouveau le vecteur, le plasmide et l'eau de la même manière.

Ensuite, préparez des mélanges d'ADN tri-dimensionnels pour tester l'homodimérisation d'une protéine d'intérêt x. Pour chaque mélange d'ADN, associez cinq microlitres du vecteur P look approprié et cinq microlitres du vecteur PYFP, en ajoutant du plasmide de remplissage et de l'eau. Préparez ensuite des mélanges d'ADN pour tester une interaction entre une paire de protéines d'intérêt X et Y. Pour chaque mélange d'ADN, associez cinq microlitres du vecteur P look approprié et cinq microlitres du vecteur PYFP, ainsi que du plasmide de remplissage et de l'eau. Récoltez des cellules HEC 293 subconfluentes à partir d'un flacon de 75 centimètres carrés, puis diluez 10 % du nombre total de cellules dans 13 millilitres de milieu de culture.

Ensuite, distribuer 130 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire 96 puits à fond clair et blanc, puis cultiver les cellules pendant 24 heures. Calculez ensuite le nombre de puits à transfecter en multipliant le nombre de mélanges d'ADN par trois. Préparez un mélange maître contenant 6,3 microlitres de milieu sans sérum à température ambiante et 0,18 microlitre de réactif de transfection par puits, en mélangeant par vortexage, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, distribuer 20 microlitres de milieu sans sérum contenant le réactif de transfection dans le nombre requis de tubes. Ajouter 2 microlitres du mélange d'ADN correspondant dans chaque tube, puis incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Enfin, transfecter trois puits avec chaque mélange de transfection.

Distribuer 6,5 µL de mélange de transfection par puits avant de cultiver les cellules pendant encore 36 à 48 heures. Pour mesurer le signal BRET. Dissoudre d'abord le substrat de luciférase pour cellules vivantes à 34 mg/mL dans du DMSO en vortexant.

Effectuez une dilution du substrat de luciférase pour cellules vivantes reconstitué au 1/1000 dans le milieu de dilution de substrat préchauffé à 37 degrés Celsius. Prévoyez 50 microlitres de milieu de dilution de substrat par puits et vortexez pour homogénéiser. Un précipité peut se former, mais il n'interférera pas avec le test.

Aspirez le milieu de culture de la plaque 96 puits et ajoutez 50 microlitres de substrat luciférase pour cellules vivantes dilué dans chaque puits après avoir cultivé les cellules pendant au moins deux heures. Retirez le couvercle de la plaque 96 puits et incubez la plaque pendant 10 minutes à température ambiante à l’intérieur du luminomètre. Mesurez l’émission provenant de la LUCIFÉRASE et du YFP un puits à la fois selon les détails indiqués dans le protocole écrit, en intégrant les signaux d’émission sur 10 secondes.

Les membres de la famille Fox P de répresseurs transcriptionnels jouent un rôle dans le développement cérébral. Des mutations ont été associées à des troubles du langage et du spectre autistique. On sait que FOX P2 forme des homodimères afin de valider le test de Brett pour la détection de Fox.

Des cellules P deux homodimères ont été transfectées avec des constructions permettant l'expression de la luciférase en tant que donneur ou de la YFP en tant qu'accepteur, fusionnées soit à Fox P deux, soit à un signal de localisation nucléaire. Les protéines LUCIFERASE et YFP ciblées vers le noyau servent de contrôles négatifs, tandis que des cellules signal ont également été transfectées avec une construction permettant l'expression d'une protéine de fusion luciférase-YFP servant de contrôle positif pour la détection d'un Brett.

L'augmentation du signal BRET montre que le test BRET est efficace pour détecter les homodimères de Fox P deux. Des images de microscopie par fluorescence de cellules transfectées avec YFP fusionné à un signal de localisation nucléaire, ou avec YFP fusionné à FOX P deux, sont présentées ici. La spécificité de l'interaction a été démontrée en introduisant une mutation dans FOX P deux, connue pour perturber la dimérisation. Lorsque les protéines de fusion luciférase Fox P deux delta E 400 et YFP Fox P deux ont été coexprimées.

Une réduction du signal de respiration a été observée par rapport à la co-expression de Fox B deux et de Fox B deux-YFP. Cette diminution du signal n'était pas due à une altération de la localisation subcellulaire de la protéine mutante. Afin d'évaluer l'efficacité du test BRET dans la détection d'interactions typiques, l'interaction entre Fox P deux et Fox P un a été analysée. Un signal BRET a été observé dans les deux configurations possibles du test. En outre, la pertinence du test BRET pour détecter l'interaction de Fox P deux avec des protéines non FOX P a été évaluée en examinant son interaction avec CT BP un, un co-répresseur transcriptionnel et un partenaire d'interaction connu de Fox P deux.

L'interaction entre Fox P2 CT BP1 a été détectée par le test BRET lorsque Fox P2 était la protéine de fusion donneuse et CT BP1 l'accepteur, mais pas dans la configuration inverse. L'interaction entre FOX P2 et CT BP1 a été observée même si seule une faible proportion de CT BP1 était localisée dans le noyau, ce qui souligne la sensibilité de ce test. Enfin, le test BRET a été utilisé pour examiner les effets des mutations pathogènes dans Fox P2 sur les interactions protéine-protéine.

Deux mutations ponctuelles dans Fox P deux ont été signalées comme causant une affection rare à transmission autosomique dominante affectant la parole et le langage. La capacité des protéines mutantes à former des dimères avec la protéine Fox P deux de type sauvage a été évaluée à l'aide du test BRET. La mutation R 3 28 X, mais pas la mutation R 5 53 H, perturbe la dimerisation, comme le montrent les résultats obtenus en utilisant Fox B deux de type sauvage comme donneur et Fox B deux muté comme accepteur.

Comme le montre l'accepteur, les mêmes résultats ont été observés pour la configuration inverse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer le test de deux hybrides pour surveiller les interactions entre protéines. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer les interactions protéine-protéine dans des cellules vivantes.

Après cette procédure, des techniques supplémentaires peuvent être réalisées pour tester l'activité de votre protéine d'intérêt afin d'évaluer les conséquences fonctionnelles d'une interaction protéine-protéine observée.