Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer l’interaction entre deux protéines et des cellules vivantes cultivées. Ceci est réalisé en sous-clonant les CDNA des deux protéines d’intérêt dans des plasmides contenant la séquence d’enrobage de la luciférase ou de la protéine fluorescente jaune, abrégée YFP pour créer des vecteurs pour l’expression de la protéine dans les cellules de mammifères. Dans un deuxième temps, les plasmides sont transfectés dans des cellules cultivées, ce qui conduit à l’expression des protéines de fusion YFP et luciférase.

Ensuite, un substrat de luciférase est ajouté aux cellules afin d’initier l’émission de lumière de la luciférase. On obtient des résultats qui montrent l’interaction entre les deux protéines de fusion sur la base du transfert d’énergie de LUCIFERASE à YFP. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la précipitation par câble, est qu’elle permet d’observer les interactions protéiques dans les cellules vivantes.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle en déterminant si une mutation trouvée chez un patient affecte les interactions protéiques-protéines. La démonstration de la première étape de la procédure sera faite par RAB tric, un étudiant en doctorat de mon laboratoire, pour commencer à créer les plasmides comme décrit dans le protocole de texte. Estimez leur concentration sur la base de l’absorbance à 260 nanomètres.

Déterminez la masse moléculaire de chaque plasmide en multipliant le nombre de paires de bases par 650.Daltons. Utilisez la concentration et la masse moléculaire pour calculer la concentration molaire de chaque préparation plasmidique. Diluez les préparations d’ADN plasmidique à une concentration de 36 nanomolaires.

Ce seront les stocks de travail qui seront utilisés pour préparer les mélanges d’ADN. Pour la transfection. L’aspect le plus difficile de cette procédure est la mise en place des mélanges d’ADN Pour assurer le succès, nous créons des feuilles de calcul pour précalculer la quantité correcte de chaque composant, et nous apportons le plus grand soin.

Lors de la configuration des mixages DN. Préparez le premier mélange d’ADN de contrôle contenant 1800 nanogrammes de plasmide de remplissage dans un volume final de 20 microlitres d’eau. Ensuite, mettez en place un deuxième mélange d’ADN contrôlé en préparant cinq microlitres de la construction de contrôle P look.

Ajoutez un plasmide de remplissage pour porter la masse totale d’ADN à 1800 nanogrammes. Ajouter de l’eau pour porter le volume final à 20 microlitres. Préparez un troisième mélange d’ADN de contrôle contenant cinq microlitres de construction de contrôle P look et cinq microlitres de construction de contrôle PYFP.

Ajouter le plasmide de remplissage et l’eau comme précédemment. Enfin, mettez en place un quatrième mélange d’ADN de contrôle contenant cinq microlitres de la construction de contrôle positif. Encore une fois, ajoutez la charge, le plasmide et l’eau de la même manière.

Ensuite, préparez des mélanges NA 3D pour tester l’homodimérisation d’une protéine d’intérêt x. Pour chaque mélange d’ADN, combinez cinq microlitres de la construction P look pertinente et cinq microlitres de la construction PYFP, en ajoutant du plasmide de remplissage et de l’eau. Préparez ensuite des mélanges d’ADN pour tester une interaction entre une paire de protéines d’intérêt X et Y.Pour chaque mélange d’ADN, combinez cinq microlitres de la construction P look pertinente et cinq microlitres de la construction PYFP avec un plasmide de remplissage et une récolte d’eau sub confluent hec 2 9 3 cellules d’un flacon de 75 centimètres carrés, diluez 10 % du total des cellules dans 13 millilitres de milieu de culture.

Ensuite, versez 130 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire blanche à fond clair de 96 puits avant de cultiver les cellules pendant 24 heures. Ensuite, calculez le nombre de puits à transfecter en multipliant le nombre de mélanges d’ADN par trois. Préparez un mélange maître contenant 6,3 microlitres de milieu sans sérum à température ambiante et 0,18 microlitre de réactif de transfection par puits mélangé par vortex avant d’incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, 20 microlitres de mélange maître de réactif de transfection sans sérum dans le nombre requis de tubes. Ajoutez deux microlitres du mélange d’ADN correspondant dans chaque tube, incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Enfin, transfectez trois puits avec chaque mélange de transfection.

Distribution de 6,5 microlitres de mélange de transfection par puits avant de cultiver les cellules pendant 36 à 48 heures supplémentaires. Pour mesurer le signal BRET. Dissoudre d’abord le substrat de luciférase de cellules vivantes à 34 milligrammes par millilitre dans du DMSO par vortexing.

Diluer le substrat de luciférase de cellules vivantes reconstituées à un à 1000 dans le milieu de dilution du substrat préchauffé à 37 degrés Celsius. Laisser mélanger 50 microlitres de milieu de dilution du substrat par vortex de puits. Un précipité peut se former, mais n’interférera pas avec le dosage.

Aspirez le milieu de culture de la plaque à 96 puits, distribuez 50 microlitres de substrat de luciférase de cellules vivantes dilué dans chaque puits après avoir cultivé les cellules pendant au moins deux heures. Retirez le couvercle de la plaque à 96 puits et incubez la plaque pendant 10 minutes à température ambiante à l’intérieur du luminomètre. Mesurez les émissions de LUCIFERASE et YFP un puits à la fois selon les détails du protocole texte, intégrez les signaux d’émission sur 10 secondes.

Les membres de la famille des répresseurs transcriptionnels Fox P jouent un rôle dans le développement du cerveau. Des mutations ont été impliquées dans les troubles de la parole et du spectre autistique. FOX P two est connu pour former des homodimères afin de valider le test de Brett pour la détection de Fox.

Les cellules P deux Homodimères ont été transfectées avec des constructions pour l’expression de la luciférase en tant que donneur ou de YFP en tant qu’accepteur fusionné soit à Fox P deux, soit à un signal de localisation nucléaire. Les protéines LUCIFERASE et YFP ciblées sur le nucléaire servent de contrôles négatifs en tant que contrôle positif pour la détection d’un Brett. Les cellules signaux ont également été transfectées avec une construction pour l’expression d’une protéine de fusion luciférase YFP.

L’augmentation du signal BRET montre que le test Bret est efficace pour détecter les homodimères Fox P deux Les images de microscopie à fluorescence de cellules transfectées avec YFP fusionné à un signal de localisation nucléaire, ou avec YFP fusionné à FOX P deux sont présentées ici. La spécificité de l’interaction a été démontrée par l’introduction d’une mutation dans FOX P deux, connue pour perturber la dimérisation. Lorsque la luciférase Fox P deux, les protéines de fusion delta E 400 et YFP Fox B deux ont été co-exprimées.

Une réduction du signal respiratoire a été observée par rapport à la co-expression de Fox B deux et de YFP Fox B deux. Cette réduction du signal n’était pas due à une altération de la localisation subcellulaire de la protéine mutante pour évaluer l’efficacité du test Bret dans la détection des interactions typiques, l’interaction de Fox P two avec Fox P one a été testée, un signal Brett a été observé dans les deux configurations possibles du test. De plus, la pertinence du test de Brett ou de la détection de l’interaction de Fox P two avec des protéines P non FOX a été testée en examinant l’interaction avec CT BP one, un co-répresseur transcriptionnel et un partenaire d’interaction connu de Fox P deux.

L’interaction Fox P deux CT BP un a été détectée par le test de Brett lorsque Fox P deux était la protéine de fusion du donneur et CT P un était l’accepteur, mais pas dans la configuration inverse. L’interaction entre FOX P deux et CT P 1 a été observée même si seule une proportion mineure de CT BP 1 était localisée dans le noyau, ce qui souligne la sensibilité de ce test. Enfin, le test Bret a été utilisé pour examiner les effets des mutations pathogènes de Fox P two sur les interactions protéiques.

Des mutations ponctuelles de Fox P deux ont été signalées comme provoquant une maladie autosomique dominante rare affectant la parole et le langage. La capacité des protéines mutantes à se dimériser avec le renard de type sauvage P two a été évaluée à l’aide du test BRET. La mutation R 3 28 X, mais pas la mutation R 5 53 H, perturbe la dimérisation des résultats en utilisant le renard de type sauvage B deux comme donneur et le renard mutant B deux.

Comme l’accepteur est montré, les mêmes résultats ont été observés pour la configuration inverse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer le dosage du pain pour surveiller les interactions protéine-protéine. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes.

À la suite de cette procédure, des techniques supplémentaires peuvent être effectuées pour tester l’activité de votre protéine d’intérêt afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles d’une interaction protéique observée.