Name: Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez une méthode rapide de quantification des lipides neutres dans les cellules algales par coloration au Nile Red et spectrofluorimétrie. Cette technique permet de surveiller efficacement les performances des bioprocédés de culture.

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Les auteurs tiennent à remercier le Conseil de recherches en sciences naturelles et de fournir un soutien financier à ce projet.

1. Isolation de sec biomasse algale à servir de normes pour fluorescence Lectures <ol><li> Supprimer un volume d&#39;échantillon de la culture d&#39;algues croissante qui fournira au moins 200 mg de biomasse sèche, 400-600 mg est préférable. </li><li> Extrait Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g. Jeter le surnageant et laver le culot avec un volume égal de tampon phosphate formulé pour le même pH que le milieu de croissance. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.2 pour un total de 3 étapes de lavage. </li><li> Re-suspendre le culot dans de l&#39;eau déminéralisée et transférer dans un plat préalablement pesé peser. Laissez sécher à 50 ° C pendant 48 heures. NOTE: Le séchage sous vide diminue le temps de séchage et le séchage de la culture à des températures supérieures à 50 ° C peut, par remise en suspension difficile. </li><li> Séché magasins algues cultures à la température ambiante pour une utilisation future. </li></ol> 2. Quantification gravimétrique des lipides neutres par hexane Extraction (Adapté de Bligh et Dyer 4) <ol><li> Mesurer environ 50 mg de biomasse d&#39;algues sèches dans un plat peser. REMARQUE: messes allant de 40 à 80 mg peuvent être utilisés sans perte de reproductibilité. </li><li> Transférer la biomasse à un mortier pré-lavé avec de l&#39;hexane. Le cas échéant, laver le plat peser avec une petite quantité (1 ml) d&#39;hexane à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur afin de transférer totalement la biomasse au mortier. NOTE: L&#39;hexane est une substance hautement volatile et toxique. Il doit être manipulé dans la hotte avec des vêtements de protection appropriés. </li><li> Broyer la biomasse algale pendant 5 minutes à l&#39;aide d&#39;un pilon. Commencez par broyage doux et augmenter progressivement l&#39;intensité. Broyer la biomasse dans une pâte fine et lisse dans la période de 5 min. Si un excès d&#39;hexane est utilisé lors du transfert de la biomasse dans le mortier, il est préférable d&#39;attendre que l&#39;hexane s&#39;évaporer avant le broyage. </li><li> Ajouter quelques ml d&#39;hexane pour le mortier et mélanger la suspension résultante avec le pilon jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit homogénéisée. Assurez-vous que tous les débris cellulaires adhère aux parois de la mortar sont frappé libre et en suspension dans le liquide. </li><li> Transférer le mélange de la masse de l&#39;hexane-cellules dans un tube de centrifugeuse. NOTE: Le tube de centrifugation doit être en verre ou en un polymère approprié compatible avec de l&#39;hexane tel que le Teflon. </li><li> Répéter les étapes 2.4 et 2.5 jusqu&#39;à ce que toute la biomasse a été transféré dans le tube de centrifugation (3-5x). </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 4 ° C pendant 20 min à 10 000 x g. </li><li> Pipette avec précaution le surnageant dans un métal pré-pesée peser plat. Stocker dans la hotte. </li><li> Effectuer une extraction par l&#39;hexane 2 ème ajout de 3 ml d&#39;hexane à la pastille et vigoureusement au vortex pendant 1 minute. </li><li> Répétez les étapes 2.7 et 2.8. Si nécessaire, exécutez les échantillons pendant 30 min dans la centrifugeuse pendant la seconde extraction pour s&#39;assurer que tous les débris cellulaires s&#39;installe entièrement. Déterminer la masse d&#39;huile extraite par gravimétrie après hexane s&#39;évapore. </li></ol> 3. Fluorometric quantification des lipides neutres Utilisation Nil Rouge (comme Rapported par de la Hoz Siegler et al. 11) NOTE: Seuls 10 pi d&#39;une suspension d&#39;algues à 5 g / L est nécessaire pour la lecture de fluorescence. En général, l&#39;isolement de la biomasse d&#39;algues sèches de 1,5 ml de bouillon de culture est plus que suffisante. Par ailleurs, l&#39;intensité lumineuse de la lampe dans le spectrophotomètre peut se dégrader au fil du temps. Il est recommandé d&#39;inclure des normes dans chaque expérience pour assurer que les variations de l&#39;instrument n&#39;ajoutent pas d&#39;erreur inutile aux mesures. <ol><li> Préparer une solution rouge Nil à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l&#39;éthanol de qualité réactif à l&#39;alcool. Conserver cette solution dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Préparer une solution à 30% (v / v) d&#39;éthanol dans de l&#39;eau déminéralisée et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer tous les échantillons d&#39;algues à la même concentration de la biomasse (il est recommandé de 5 g / L) et de la même manière que les critères utilisés dans l&#39;évaluation. Pour ce faire, soit par des échantillons de suspension pré-séchés dans la quantité appropriéede tampon phosphate (0,6 g / L de phosphate de potassium dibasique, 1,4 g / L de phosphate de potassium monobasique), ou en ajustant la concentration d&#39;une culture d&#39;algues en croissance à 5 g / L de tampon phosphate après la mesure de la turbidité. REMARQUE: Les mesures effectuées sur des cultures d&#39;algues vivantes auront souvent plus grande erreur qui leur est associé en fonction de la précision de la courbe d&#39;étalonnage de la turbidité. La remise en suspension des échantillons secs peut nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un homogénéisateur pour disperser complètement la biomasse. </li><li> Pour chaque échantillon, mélanger 80 ul de la solution d&#39;éthanol à 30%, 10 ul de la solution rouge Nil, et 10 ul de suspension d&#39;algues dans un seul puits d&#39;une plaque à 96 puits. Afin de bien rendre compte de la variabilité de la mesure de fluorescence, effectuer 5 répétitions de chaque échantillon. </li><li> Exécutez une courbe d&#39;étalonnage en deux points aux normes préalablement préparés afin de tenir compte des variations au jour le jour de l&#39;instrument et de la préparation. Préparer les étalons pour la mesure de la fluorescence à l&#39;aide de la sProcédure ame que les échantillons. REMARQUE: En général, deux points est suffisant pour un recalibrage de l&#39;instrument, trois points peuvent être exécutés pour vérifier la linéarité. </li><li> Effectuer les mesures de fluorescence dans un multi-puits lecteur de plaque spectrophotomètre. Les conditions suivantes ont été trouvées pour obtenir les résultats les plus cohérents 11: <ol><li> Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec. </li><li> Incuber à 40 ° C pendant 10 min. </li><li> Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec. </li><li> fluorescence d&#39;enregistrement, l&#39;excitation à 530 nm, émission à 604 nm. </li></ol></li><li> Convertir les mesures de fluorescence à la teneur en huile en utilisant les résultats des étalons internes. </li></ol> 4. Technique microscopie de fluorescence REMARQUE: Le protocole de coloration décrit dans l&#39;article 3 est conçu pour l&#39;analyse quantitative, mais il peut aussi être utile de fournir des représentations visuelles des techniques basées taches pour unité centrale d&#39;éducation et d&#39;illustrationrposes. Pour produire des images de l&#39;échantillon fluorescence nécessite un microscope optique avec des sources de transmission et d&#39;éclairage à épifluorescence plus traditionnels. Excitation et d&#39;émission filtres de lumière dans le 530 nm (vert) et 604 nm (rouge) gamme, respectivement, sont nécessaires pour la tache rouge du Nil ainsi que d&#39;une caméra montée au microscope avec un logiciel associé. Les images présentées dans cette étude (figure 1) ont été acquises à l&#39;aide d&#39;un microscope en champ clair équipé d&#39;une caméra et monochrome à l&#39;unité de convertisseur RGB. Le procédé de production du Nil Red images de fluorescence à l&#39;aide de ces outils est décrit ci-dessous: <ol><li> Préparer un échantillon de la culture avec la tache rouge Nil conformément à l&#39;article 3 du protocole. REMARQUE: un échantillon de 5 g / L gamme de concentration produit des lames de densité adéquate des cellules sans surpopulation. </li><li> Après avoir terminé l&#39;étape 3.6 du protocole de coloration, préparer une lame de microscope de l&#39;échantillon traité selon les procédures standard de laboratoire. </li><li> En commençant par le microscope en transmission, charger la lame préparée dans le microscope, et de localiser les cellules à l&#39;agrandissement souhaité (images présentées dans cet article ont été acquis avec l&#39;objectif 100X). </li><li> Une fois la mise, passer le microscope de transmission en mode d&#39;éclairage à épifluorescence. La source lumineuse doit maintenant être vient directement de la lentille d&#39;objectif (ce qui peut être confirmé par l&#39;observation visuelle de l&#39;espace entre la lame et la lentille d&#39;objectif). </li><li> Insérer un filtre d&#39;excitation verte dans la source de lumière et un filtre d&#39;émission de rouge dans le trajet de lumière d&#39;observation; la fluorescence des cellules colorées devrait maintenant être directement visible à travers l&#39;oculaire. </li><li> Changez le mode de l&#39;observation au microscope de l&#39;oculaire de l&#39;appareil photo monté et utiliser un logiciel de visualisation pour capturer une image des cellules fluorescentes. Selon la sensibilité de la caméra, l&#39;échantillon peut ne pas apparaître d&#39;abord dans la fenêtre d&#39;aperçu (c&#39;est à dire l&#39;écranêtre noir); pour remédier à cela, ajuster le temps et le gain de l&#39;appareil d&#39;exposition à un niveau où les cellules sont visibles. Paramètres spécifiques varient selon les instruments, du matériel et des types de cellules. </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+%26+Renewable+Energy%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Department+of+Energy%2C+Office+of+Energy+Efficiency+and+Renewable+Energy%2C+Biomass+Program%22%5BJournal%5D)">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from:
 
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<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
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<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
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<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les algues utilisées dans la courbe standard doit être les mêmes espèces cultivées dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui sont mesurées. Des changements significatifs dans la composition du milieu, la technique de la culture, et le protocole de coloration peuvent influer sur l&#39;intensité de la lecture de fluorescence. extraction à l&#39;hexane (décrit dans les sections 1 et 2) a été utilisé pour déterminer la teneur en lipide neutre d&#39;échantillons utilisés dans la courbe standard. Pour des mesure...

En raison de leur capacité à stocker corps lipidiques sous certaines conditions de stress, les algues ont reçu beaucoup d&#39;attention ces dernières années comme une source de carburant renouvelable potentiel de 1,2. Lipides neutres peuvent représenter plus de 60% ​​du poids sec de la cellule dans des conditions de croissance appropriées 3. Pourtant, l&#39;industrie n&#39;a pas de protocole simple, propre, rapide, fiable et standardisée pour quantifier la teneur en lipides des cellules d&#39;algues afin de surveiller correctement le rendement des bioprocédés, analyser les cultures, et l&#39;écran de nouvelles souches. La méthode gravimétrique Bligh-Dyer développé il ya 50 ans reste parmi les techniques les plus couramment utilisés aujourd&#39;hui 4,5. Bien que cette procédure est simple, fiable et facile à mettre en oeuvre, il prend du temps, nécessite de grands volumes d&#39;échantillons, et rend l&#39;utilisation de solvants toxiques. Il n&#39;est pas pratique pour l&#39;analyse de nombreux échantillons à partir d&#39;un essai de fermentation ou de criblage de nouvelles souches riches en huile. D&#39;autres méthodes ont been développé, mais le plus souvent besoin d&#39;équipement de pointe et n&#39;ont pas été normalisés 6. Une alternative qui a suscité beaucoup d&#39;intérêt est la tache rouge Nil. Nile Red, un colorant qui émet une fluorescence de manière préférentielle dans des milieux non polaires, a été utilisée pour identifier ou quantifier les corps lipidiques dans différents organismes, y compris des nématodes 7, 8 levures, les bactéries et les algues 9, 10-19. Techniques initiales impliquant Nil Rouge étaient essentiellement qualitative ou semi-quantitative, combinant la tache avec une seule cuvette spectrophotométrie ou la cytométrie de flux. En outre, certaines classes d&#39;algues telles que les algues vertes ont des puits de cellules d&#39;épaisseur qui sont essentiellement imperméable au colorant, ce qui limite la portée de la technique 10. Récentes améliorations apportées à la méthode de coloration rouge Nil ont été signalés qui contournent les lacunes initiales du protocole 10,11. La coloration des cellules en présence d&#39;un carrier solvant tel que le DMSO 10 ou éthanol 10,11 linéarise la relation entre la teneur en huile et l&#39;absorbance, ce qui permet des mesures quantitatives fiables. Le solvant permet de perméabiliser la membrane cellulaire de façon que les molécules Nile Red peuvent passer à travers. En outre, l&#39;incorporation d&#39;un spectrophotomètre avec des capacités de lecture de micro-plaque permet protocoles à haut débit appropriés pour l&#39;analyse quantitative. En ce détail article de nous une méthode simple pour mesurer la teneur en huile des cellules algales par coloration cultures avec Nil Rouge en présence d&#39;éthanol, un solvant doux. Afin d&#39;expliquer plus précisément pour le bruit de fond dans les mesures, d&#39;une courbe standard corréler l&#39;intensité de fluorescence à la teneur en huile est développée à l&#39;aide de cellules d&#39;algues composition d&#39;huile connue. La méthode est une adaptation de protocoles précédemment publiés 10,11. En utilisant un spectrophotomètre à 96 puits, on est capable d&#39;analyser la même quantité d&#39;échantillons dans un tha heuresl faudrait jours pour surveiller par des méthodes gravimétriques. En outre, par une calibration en utilisant des échantillons représentatifs de l&#39;espèce algale désiré ce procédé produit des mesures relativement précises qui sont directement interprétables. Il existe de nombreux protocoles décrivant les méthodes de coloration des algues avec Red Nil optimisé pour différentes souches et des applications; le protocole présenté ici a été développé à l&#39;origine par de la Hoz Siegler et al. 11 pour protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, et Scenedesmus obliquus, mais il est probable approprié pour de nombreuses autres espèces et les classes. Il a été conçu à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance et il fonctionne aussi bien pour les échantillons préalablement séchés et des échantillons humides à partir d&#39;une culture de plus en plus.

<table><tbody><tr><td>Poids</td><td></td><td></td><td></td>sec</tr><tr><td>Pipettes jetables de 25 ml</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Pipette à bulbe</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Tubes à centrifuger en téflon Nalgene</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Téflon nécessaire pour l’hexane</td></tr><tr><td>Plateaux de pesée (polypropylène)</td><td>Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de 1,5 ml tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Étuve de séchage (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de stockage</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de paillasse (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Quantification</td><td></td><td></td><td></td> gravimétrique</tr><tr><td>Mortier en porcelaine (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Pilon en porcelaine (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Tubes de centrifugation (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Peut également utiliser des tubes en verre</td></tr><tr><td>Pipettes en verre Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Plateaux de pesée en aluminium</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Quantification fluorométrique de la teneur en</td><td></td><td></td><td></td>huile</tr><tr><td>Lecteur de plaques multipuits à fluorescence Thermo</td><td>Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de lecture de fluorescence</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent Software 2.6</td><td></td></tr><tr><td>COSTAR 96 Plaque à fond rond</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (qualité réactif d’alcool)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Imagerie Cellules</td><td></td><td></td><td></td>fluorescentes</tr><tr><td>Microscope Leica DMRXA2 (ou équivalent)</td><td>Leica</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

une simple et rapide protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Les algues sont considérés comme d&#39;excellents candidats pour les sources de carburants renouvelables en raison de leurs capacités de stockage des lipides naturels. Un suivi rigoureux des processus de fermentation des algues et le dépistage de nouvelles souches riches en pétrole nécessite un protocole rapide et fiable pour la détermination de la teneur en lipides intracellulaires. Les pratiques actuelles reposent en grande partie sur les méthodes gravimétriques pour déterminer la teneur en huile, techniques développées il ya des décennies qui sont de temps et nécessitent de grands volumes d&#39;échantillons. Dans le présent document, le rouge Nil, un colorant fluorescent qui a été utilisé pour identifier la présence de corps lipidiques dans de nombreux types d&#39;organismes, est incorporé dans un protocole simple, rapide et fiable pour la mesure de la teneur en lipides neutres de protothecoides Auxenochlorella, un vert algue. Le procédé utilise de l&#39;éthanol, un solvant relativement doux, pour perméabiliser la membrane cellulaire avant coloration et un puits de micro-plaques 96 pour augmenter la capacité de l&#39;échantillon pendant les mesures d&#39;intensité de fluorescence. Il a été la conceptioned à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. Échantillons préalablement séchés ou des échantillons vivants à partir d&#39;une culture en croissance peuvent être utilisées dans le dosage.

Cellules d&#39;algues représentatives colorées avec le colorant rouge Nil sont illustrés dans la Figure 1. Parties A et B de la figure 1 images d&#39;affichage de A. protothecoides cultivées dans un excès d&#39;azote, conduisant à très faible accumulation de lipides intracellulaires. Dans les parties C et D, des échantillons de A. protothecoides cultivées sous limitation d&#39;azote sont présentés. Sou...

Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d&#39;algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance.

Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer la teneur en lipides neutres des cellules algales à l'aide du colorant fluorescent rouge Nil. Cette mesure est réalisée en premier lieu en suspendant les cellules dans une solution d'éthanol afin de rendre perméables la paroi cellulaire et la membrane cellulaire. Dans un deuxième temps, on ajoute le colorant fluorescent rouge Nil, qui pénètre dans les cellules et s'accumule dans les régions non polaires de la cellule, notamment dans les corps de lipides neutres.Ensuite, les échantillons sont exposés à une source lumineuse d'excitation de 530 nanomètres, ce qui provoque la fluorescence du Nile red absorbé dans les corps lipidiques neutres à 604 nanomètres. Les résultats sont obtenus à grande échelle en réalisant les tests individuels dans une plaque de microplaques et en utilisant un spectrophotomètre pour produire rapidement des mesures de fluorescence. Les mesures révèlent une relation linéaire entre la teneur en lipides neutres des cellules algales et l'intensité de la mesure de fluorescence.La conversion des mesures de fluorescence en teneur en huile peut être réalisée à l'aide d'une courbe d'étalonnage préparée avec des

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JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Nous introduisons une vitesse basées sur la fluorescence de dosage qui surveille le taux de la trempe de fluorescence comme une mesure de l'activité du canal gramicidine. Les canaux de gramicidine sont utilisés comme capteurs de force moléculaire pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant.

Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Cette vidéo présente un protocole de détection et de quantification des lipides neutres dans les cellules d’algues en les colorant rouge du Nil.

Coloration rouge du Nil : une technique pour détecter et quantifier les lipides neutres intracellulaires dans les algues

Procédé pour la détermination de la teneur en acides gras et de la composition en micro-algues sur la base de la rupture mécanique des cellules, le solvant d'extraction à base de lipide, de transestérification, et la quantification et l'identification des acides gras par chromatographie en phase gazeuse est décrit. Un étalon interne tripentadecanoin est utilisé pour compenser les pertes possibles lors de l'extraction et de transestérification incomplète.

Analyse de la teneur en acide gras et de la composition en microalgues

Nous décrivons un test basé sur la fluorescence pour mesurer le brouillage des phospholipides dans de grands liposomes unilamellaires reconstitués avec de l’opsine.

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir l’index de gouttelettes de lipides (index LD) pour étudier la dynamique des triacylglycérols dans les cellules cultivées dans des expériences de haut débit. L’essai d’index LD est une méthode simple et fiable qui utilise BODIPY 493/503. Ce test n’a pas besoin dispendious extraction de lipides ou d’analyse de la microscopie.

Lipides Index détermination par Fluorescence liquide de récupération dans le champignon pathogène Ustilago Maydis

Nous présentons ici un protocole visant à construire le laboratoire bulle colonne photobioréacteurs et utilisez-les pour la culture micro-algues. Il fournit également une méthode pour déterminer le taux de croissance de la culture et de la teneur en lipides neutres.

Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

Ce protocole décrit un test pour la caractérisation de la formation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les organoïdes intestinaux humains lors de la stimulation avec des acides gras. Nous discutons de la façon dont cet analyse est utilisé pour la quantification de la formation de LD, et comment il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les médicaments qui affectent la formation de LD.

Un test basé sur la fluorescence pour la caractérisation et la quantification de la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains

Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Ce protocole présente une méthode d’imagerie par fluorescence qui utilise une classe de fluorophores lipidiques sensibles au pH pour surveiller le trafic des membranes lipidiques pendant l’exocytose cellulaire et le cycle d’endocytose.

Mesure du renouvellement lipidique membranaire avec l’analogue lipidique fluorescent ND6 sensible au pH

Le présent protocole décrit l’imagerie par autofluorescence étape par étape et l’évaluation des changements phycobiliprotéiques dans les algues rouges sur la base d’une analyse spectrale. Il s’agit d’une méthode non marquée et non destructive pour évaluer l’adaptation cellulaire à des habitats extrêmes, lorsque seul du matériel rare est disponible et que les cellules se développent lentement, voire pas du tout, dans des conditions de laboratoire.

Imagerie par autofluorescence pour évaluer la physiologie des algues rouges

Découvrez une méthode rapide de quantification des lipides neutres dans les cellules algales par coloration au Nile Red et spectrofluorimétrie. Cette technique permet de surveiller efficacement les performances des bioprocédés de culture.

Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

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