Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la teneur en lipides neutres des cellules d’algues à l’aide d’un colorant fluorescent rouge du Nil. Ceci est réalisé en suspendant d’abord les cellules dans une solution d’éthanol pour perméer la paroi cellulaire et la membrane cellulaire. Dans un deuxième temps, un colorant fluorescent rouge du Nil est ajouté, qui pénètre dans les cellules et s’accumule dans les régions non polaires de la cellule, y compris les corps lipidiques neutres.

Ensuite, les échantillons sont exposés à une source lumineuse d’excitation de 530 nanomètres, ce qui fait que le rouge du Nil absorbé dans les corps lipidiques neutres devient fluorescent à 604 nanomètres. Les résultats sont obtenus à l’échelle de masse en effectuant les tests individuels dans un micro-puits multipl et en utilisant un spectrophotomètre pour produire des lectures de fluorescence rapides. Les lectures montrent une relation linéaire entre la teneur en lipides neutres des cellules lgal et l’intensité de la mesure de fluorescence.

La conversion des mesures de fluorescence en teneur en huile peut être réalisée à l’aide d’une courbe d’étalonnage préparée avec des cellules dont la composition en huile est connue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants, tels que la méthode gravimétrique de Blydire, est qu’elle permet de déterminer rapidement la teneur en lipides neutres à l’aide de matériaux disponibles dans la plupart des laboratoires. Cette méthode fournit un retour d’information immédiat sur les performances des bioprocédés lors de la culture d’algues.

De plus, le débit élevé permis par le lecteur de plaques à 96 puits est idéal pour les études de criblage et les expériences factorielles. Bien que cette technique ait été optimisée pour la chlorelle et le Desus, elle peut être facilement modifiée pour l’analyse d’autres espèces de lgal. D’accord. Pour commencer, prélevez un volume d’échantillon de la culture d’algues en croissance qui fournira au moins 200 milligrammes de biomasse sèche.

400 à 600 milligrammes sont préférables. Centrifugez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 10 000 fois. G, jeter le surnageant et laver la pastille avec un volume égal de tampon phosphate formulé au même pH que le milieu de croissance.

Répétez ce processus pour un total de trois étapes de lavage. Remettez le granulé en suspension dans de l’eau déminéralisée et transférez-le dans un plat de pesée pré-pesé. Laissez sécher l’échantillon à 50 degrés Celsius pendant 48 heures.

Les cultures d’algues séchées peuvent être conservées à température ambiante pour une utilisation future. Mesurez environ 50 milligrammes de biomasse d’algues sèches dans une boîte de lactosérum. Transférez la biomasse dans un mortier prélavé à l’hexane si nécessaire, lavez le plat de lactosérum avec une petite quantité d’hexane à l’aide d’une pipette passée afin de transférer complètement la biomasse dans la commande de mortier.

Ensuite, broyez la biomasse d’algues pendant cinq minutes à l’aide d’un pilon. Commencez par un broyage doux et augmentez progressivement l’intensité. Broyez la biomasse en une pâte fine et lisse.

Pendant la période de cinq minutes, ajoutez quelques millilitres d’hexane au mortier et mélangez la boue obtenue avec le pilon jusqu’à ce qu’elle soit homogénéisée. Assurez-vous que tous les débris de la cellule adhérant aux parois du mortier sont libérés et en suspension dans le liquide. Ensuite, transférez le mélange de masse cellulaire d’hexane dans un tube à centrifuger compatible.

Répétez trois à cinq fois jusqu’à ce que toute la biomasse ait été transférée dans le tube de centrifugation. Centrifugez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes à 10 000 fois. G.Après la centrifugation, pipeter soigneusement le surnageant dans un plat métallique pré-pesé, qui peut être stocké dans la hotte.

Effectuez une deuxième extraction d’hexane en ajoutant trois millilitres d’hexane à la pastille et en faisant un tourbillon vigoureux. Pendant une minute, répétez la centrifugation et le transfert du surnageant. Déterminer la masse d’huile extraite gravimétriquement après l’évaporation complète de l’hexane.

Pour la quantification fluorométrique, préparer tous les échantillons d’algues à la même concentration de biomasse et de la même manière que les étalons utilisés pour la mesure. Pour ce faire, mettez en suspension les échantillons pré-séchés dans la quantité appropriée de tampon phosphate. Si nécessaire, utilisez un homogénéisateur pour faciliter la suspension réanimation des cellules lgal séchées.

Pour chaque échantillon, mélangez 80 microlitres d’une solution préparée à 30 % d’éthanol, 10 microlitres d’une solution préparée de rouge du Nil et 10 microlitres de suspension d’algues dans un seul puits d’une plaque à 96 puits. Afin de bien tenir compte de la variabilité de la mesure de fluorescence, effectuez cinq répétitions de chaque échantillon. Ensuite, exécutez une courbe d’étalonnage en deux points avec des étalons préparés précédemment.

Afin de tenir compte des variations quotidiennes de l’instrument et de la préparation pour effectuer les mesures de fluorescence dans un spectrophotomètre à lecteur de plaques multipuits, réglez les paramètres pour qu’ils agitent à 1 200 tr/min et orbitent sur trois millimètres pendant 30 secondes, suivis d’une incubation à 40 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une autre secousse à 1 200 tr/min et une orbite de trois millimètres pendant 30 secondes, et pour enregistrer la fluorescence avec excitation à 530 nanomètres et émission à 604 nanomètres. Ensuite, commencez la course comme dernière étape.

Convertir les mesures de fluorescence en teneur en huile à l’aide des résultats des étalons internes pour effectuer la microscopie à fluorescence. Utilisez l’échantillon préparé avec le colorant rouge du Nil pour préparer une lame de microscope de l’échantillon de procédé conformément aux procédures de laboratoire standard. En commençant avec le microscope en mode transmission, chargez la lame préparée dans le microscope et localisez les cellules au grossissement souhaité.

Une fois la mise au point effectuée, basculez le microscope du mode d’éclairage par transmission au mode d’éclairage par épifluorescence. La source lumineuse doit maintenant provenir directement de l’objectif, ce qui peut être confirmé visuellement en observant l’espace entre la diapositive et l’objectif. Insérez un filtre d’excitation vert dans la source lumineuse et un filtre d’émission rouge dans le trajet de la lumière d’observation.

La fluorescence des cellules colorées devrait maintenant être directement visible à travers l’oculaire. Basculez le mode d’observation du microscope de l’oculaire à la caméra montée et utilisez un logiciel de visualisation pour capturer une image des cellules fluorescentes. Les paramètres spécifiques varient selon les instruments, l’équipement et les types de cellules.

Des cellules d’algues représentatives colorées avec un colorant rouge du Nil montrent des images d’un prothe cultivé dans un excès d’azote conduisant à une très faible accumulation de lipides intracellulaires, qui sont montrées en contraste avec des échantillons d’un OID cultivé sous limitation en azote. Sous éclairage de transmission, les corps lipidiques des cellules peuvent être visualisés avec une inspection minutieuse où ils apparaissent sous forme de structures circulaires brillantes et constituent la majorité du volume cellulaire. Les cellules montrées ici ne contiennent que 5 % d’huile en poids sec et ne contiennent pas de niveaux significatifs de corps lipidiques lorsqu’on leur montre les conditions de lumière appropriées.

Les différences entre ces échantillons sont amplifiées. Les cellules pauvres en huile apparaissent sous forme d’anneaux fluorescents avec des corps sombres, tandis que les cellules riches en huile affichent une lueur rouge orangé vif là où elles ont accumulé des corps lipidiques. Le rouge du Nil sera fluorescent à différentes longueurs d’onde en fonction de la présence de lipides neutres, de phospholipides situés sur la paroi cellulaire et de protéines cellulaires non polaires, c’est pourquoi les cellules maigres apparaissent comme des anneaux fluorescents avec des corps sombres.

Cette non-spécificité est également à l’origine du niveau de fond de fluorescence lors des mesures par spectrophotomètre des lipides neutres Dans les conditions optimisées du dosage, des courbes d’étalonnage avec des valeurs R carrées supérieures à 0,980 sont facilement réalisables. La relation entre la teneur en huile cellulaire et la fluorescence devient non linéaire si les cellules sont colorées dans une solution, en l’absence d’un solvant porteur tel que l’éthanol. Les données présentées ici ont un R carré de 0,395 et ont été obtenues en réalisant le protocole dans une solution d’éthanol à 0 %.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 à 20 minutes si elle est correctement exécutée. Lors de l’exécution de cette procédure, il est essentiel de s’assurer que tous les échantillons sont préparés à la même concentration de biomasse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la teneur en lipides neutres des cellules lgal en utilisant à la fois les protocoles d’extraction traditionnels de l’hexane et la procédure plus simple de coloration fluorescente rouge NAL.