Name: Isolation des petits ARN non codant de sérum humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Apprenez à isoler des petits ARN non codants de haute qualité à partir de sérum humain en utilisant des tubes phase lock et une centrifugation flash optimisée. Cette méthode améliore le rendement et la pureté des microARN pour les applications en biologie moléculaire.

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Samantha Khoury et Pamela Ajuyah sont pris en charge par le Postgraduate Award australien. Nous tenons également à remercier le Réseau de recherche translationnelle sur le cancer, Centre de recherche sur le cancer Lowy, l&#39;Université de Nouvelle-Galles du Sud et l&#39;Unité de recherche translationnelle du cancer du Nord pour leur soutien supplémentaire de Samantha Khoury.

Remarque: les échantillons de sérum humain provenant de patients sains ou des patients atteints de cancer ont été obtenus avec le consentement éclairé sous protocoles éthiques humaines agréés du Royal Prince Alfred Hospital de Sydney (numéro de protocole X10-0016 et HREC/10/RPAH/24) et l&#39;Université de Technologie, Sydney. Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des patients avant la chirurgie de divers hôpitaux de Sydney et placés dans le stockage à -80 ° C. 1. Petite isolement d&#39;ARN à partir de sérum L&#39;ARN total a été préparé à partir de sérum humain à l&#39;aide d&#39;une version modifiée du protocole du Tri-Reagent LS RT. <ol><li> Décongeler échantillon de sérum congelé sur de la glace, puis transférer 400 pl de sérum fraîchement décongelé dans un tube à centrifuger étiqueté. </li><li> Diluer le sérum avec 100 ul de RNase H 2 O et ajouter la proteinase K à une concentration de 1 mg / ml. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 20 min pour permettre la digestion des protéines par la protéinase K. </li><li> To assurer la solubilisation complète, ajouter 1,5 fois son volume de Tri-Reagent RT LS et 100 pi de 4 bromoanisole. </li><li> Inverser brièvement l&#39;homogénat, effectuer pipetage répétitif pendant 5 secondes et transférer dans un tube de 2 ml lourd à verrouillage de phase marquée. </li><li> Spin l&#39;homogénat à 12 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Décanter avec soin au moins 1 ml de la solution aqueuse obtenue dans un nouveau tube ADN LoBind. L&#39;interphase organique et doit être pris au piège sous le gel blanc du tube à verrouillage de phase. </li><li> Ajouter 5,0 pl de glycogène (5 mg / ml) et 500 ul d&#39;isopropanol à 100% à la solution aqueuse, mélanger par retournement, et incuber O / N à 20 ° C. </li><li> Suite à O / N incubation, centrifuger l&#39;échantillon pendant 20 min à 12 000 x g dans une centrifugeuse 4 C °. </li><li> Jeter le surnageant clair et effectuer un &quot;flash&quot; rotation pendant 2 min à 16000 x g dans une centrifugeuse C 4 °. </li><li> Retirez délicatement le sol clairution entourant la pastille à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Laver le culot avec 1 ml d&#39;éthanol à 70% et centrifuger à 10 000 g pendant 10 min. Décanter la solution de lavage et répétez l&#39;étape de lavage. </li></ol> 2. ARN remise en suspension dans la solution <ol><li> Reprendre le culot dans 10 ul de RNase H 2 O, en assurant le culot est complètement dissous. Afin de s&#39;assurer que l&#39;ARN est complètement solubilisé l&#39;échantillon peut être chauffé à 55 ° C pendant 5 min. Pendant ce temps, mélanger l&#39;échantillon avec pipetage répété. Pour un rendement élevé de l&#39;ARN total, en commun deux préparations d&#39;ARN provenant du même patient. </li><li> Quantifier l&#39;ARN remises en suspension à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre UV-Vis et évaluer la qualité de l&#39;ARN en utilisant une Bioanalyseur 2100. Stocker les échantillons d&#39;ARN regroupées à -80 ° C pour une utilisation dans des applications en aval. </li></ol>

<ol><li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li>
<li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li>
<li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li>
<li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li>
<li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum%2FPlasma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li>
<li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
<li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li>
</ol>

Il n&#39;y a rien à divulguer.

La population de microARN représente environ 0,4-0,5% de l&#39;ARN total dans le sérum. En outre il existe également une teneur élevée en protéine présente dans le sérum humain. Pour améliorer l&#39;ARN et de réduire à la fois la protéine et le phénol contamine nous avons modifié l&#39;approche traditionnelle Chomczynski 9 avec l&#39;ajout de plusieurs étapes. L&#39;ARN total a été isolé à partir de sérum en utilisant la norme Tri-Reagent RT-LS (Centre de recherche moléculaire) ma...

Au cours des dernières années, il ya eu une poussée de plus en plus de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies humaines. Beaucoup d&#39;attention a été porté sur l&#39;utilisation de petits ARN tels que les microARN 2 (miARN ou mirs) comme marqueurs potentiels. Ces petits ARN sont trouvés dans les fluides corporels tels que le sérum, et des études ont montré qu&#39;ils sont résistants à la dégradation et sont stables dans une gamme de conditions environnementales variables 3. Compte tenu de ces caractéristiques miARN, de sérum ou de circulation sont le biomarqueur idéal 4, 5. Actuellement, il existe deux approches principales pour l&#39;isolement de petits ARN à partir de fluides biologiques. La première approche utilise une technologie basée sur les colonnes de lier et éluer les petits ARN 6, tandis que la seconde approche utilise le protocole de longue date avec le phénol et guanidinium thiocyanate réactifs 7. Nous avons développé un protocole simple, efficace, sans colonne pour isoler de petits ARN à partir de sérum humain. L&#39;ARN isolé est immédiatementment utilisable dans des applications en aval, y compris les tableaux ADN d&#39;oligonucléotides et le séquençage de l&#39;ARN. Ce protocole a été développé parce que nous avons été confrontés à plusieurs problèmes lors de l&#39;utilisation des méthodes à base de phénol pour isoler l&#39;ARN à partir de sérum. L&#39;approche traditionnelle Chomczynski est fréquemment utilisé dans la plupart des laboratoires avec une gamme de réactifs disponibles dans la plupart des fournisseurs commerciaux. Toutefois, compte tenu de leur utilisation généralisée, les lignes directrices strictes n&#39;ont pas été développées pour produire toujours ARN de haute qualité à partir de fluides corporels, dans le sang ou le sérum particulier. Les problèmes courants associés à l&#39;isolement d&#39;ARN à partir de sérum d&#39;ARN comprennent des rendements faibles et une contamination par des réactifs utilisés au cours de l&#39;isolement, en particulier le phénol. Notre approche élimine ces impuretés phénoliques pour fournir de l&#39;ARN de haute qualité pour analyse en aval telles que la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de l&#39;ARN. Nous avons également testé cet ARN sur les tableaux de miARN.

<table><tbody><tr><td>Tri-réactif RT LS</td><td>Molecular Research Center, États-Unis</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>RNase libre H2O</td><td>GIBCO Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Finnzymes, Finlande</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Tube Heavy Phase Lock</td><td>5PRIME</td><td>2302830</td><td>capacité de 2 ml</td></tr><tr><td>DNA Tube Lobind</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.078</td><td>1,5 ml capacité</td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Invitrogen,</td><td>États-Unis 10814-010</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Isopropanol de qualité ARN</td><td>Sigma Aldrich, États-Unis</td><td>I9516 Centrifugeuse</td><td>réfrigérée à 100 %</td></tr> <tr><td></td><td>Spectrophotomètre UV-Vis John Morris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Thermo</td><td>Fisher Scientific, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol de qualité ARN</td><td>Sigma Aldrich, États-Unis</td><td>E7023</td><td>70 %</td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100</td><td>Agilent, États-Unis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation des petits arn non codant de sérum humain

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

L&#39;analyse de l&#39;ARN et son expression est une caractéristique commune à de nombreux laboratoires. D&#39;importance est l&#39;émergence de petits ARN comme les microARN, qui se trouvent dans les cellules de mammifères. Ces petits ARN sont des régulateurs de gènes puissants de contrôle des canaux vitaux tels que la croissance, le développement et la mort et beaucoup d&#39;intérêt a été réalisé à leur expression dans les fluides corporels. Ceci est dû à leur dérégulation dans les maladies humaines telles que le cancer et leur application possible en tant que biomarqueurs sériques. Cependant, l&#39;analyse de l&#39;expression des miARN dans le sérum peut être problématique. Dans la plupart des cas, la quantité de sérum est de limiter et de sérum contient de faibles quantités d&#39;ARN total, dont de petits ARN constituent seulement 0,4-0,5% 1. Ainsi l&#39;isolement de quantités suffisantes d&#39;ARN de qualité à partir de sérum est un défi majeur pour les chercheurs d&#39;aujourd&#39;hui. Dans ce document technique, nous démontrons une méthode qui utilise seulement 400 pi de sérum humain pour obtenir l&#39;ARN est suffisante pour soit des puces à ADN ou analyse qPCR. L&#39;unvantages de ce procédé sont sa simplicité et sa capacité à produire de l&#39;ARN de haute qualité. Il ne nécessite pas de colonnes spécialisées pour la purification de petits ARN et utilise des réactifs généraux et du matériel trouvés dans des laboratoires communs. Notre procédé utilise un gel de verrouillage de phase pour éliminer la contamination de phénol tout en donnant en même temps l&#39;ARN de haute qualité. Nous introduisons également une étape supplémentaire pour éliminer encore tous les contaminants lors de l&#39;étape d&#39;isolement. Ce protocole est très efficace pour isoler l&#39;ARN total des rendements allant jusqu&#39;à 100 ng / ul de sérum, mais peut également être adapté à d&#39;autres tissus biologiques.

La figure 1 représente un spectre typique UV / Vis de l&#39;ARN isolé à partir de sérum. De ce profil, nous avons constaté la contamination de la protéine à 280 nm avec du phénol et de contaminants organiques à la fois à 270 nm et 230 nm, respectivement. Résidu thiocyanate de guanidinium a également été noté à 260 nm. Afin de réduire les contaminants, une série d&#39;étapes d&#39;optimisation ont été apportées à la procédure de Tri-Reagent RT-LS standard. On a ajouté 5 mg / ml de glycogène à augmenter à...

Ce protocole décrit un procédé d&#39;extraction de petits ARN à partir de sérum humain. Nous avons utilisé cette méthode pour isoler les micro-ARN à partir de sérum de cancer destiné à être utilisé dans les puces à ADN et PCR quantitative singleplex également. Le protocole utilise le phénol et du thiocyanate de guanidinium réactifs avec des modifications pour donner l&#39;ARN de haute qualité.

Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler de l'ARN de haute qualité à partir d'échantillons de sérum. À l'aide de notre version optimisée du protocole courant MRC try réactif RTLS. Ceci est réalisé en diluant d'abord le sérum dans un rapport de un à cinq avec de l'eau sans nucléase afin de réduire la contamination par les protéines.La deuxième étape consiste à introduire deux tubes de verrouillage de phase de deux millilitres pour la première étape de centrifugation. Cela piège la majorité des contaminants, tels que le phénol et les protéines, dans la phase organique. Ensuite, la troisième et dernière étape d'optimisation est une courte centrifugation à 12 000 ×g, qui élimine toute contamination résiduelle du culot d'ARN avant les lavages à l'éthanol.La dernière étape consiste à regrouper deux préparations d'ARN modifiées provenant du même patient si un rendement total d'ARN plus élevé est requis. En utilisant finalement cette méthode modifiée, qui solubilise le sérum dans de l'eau exempte de nucléase et utilise un tube à verrouillage de phase pour piéger les principales contaminants, ainsi qu'une courte centrifugation. Nous montrons qu'il est possible de maximiser la récu

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