Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

L'objectif général de cette procédure est d'isoler de l'ARN de haute qualité à partir d'échantillons de sérum. À l'aide de notre version optimisée du protocole courant MRC try réactif RTLS. Ceci est réalisé en diluant d'abord le sérum dans un rapport de un à cinq avec de l'eau sans nucléase afin de réduire la contamination par les protéines.

La deuxième étape consiste à introduire deux tubes de verrouillage de phase de deux millilitres pour la première étape de centrifugation. Cela piège la majorité des contaminants, tels que le phénol et les protéines, dans la phase organique. Ensuite, la troisième et dernière étape d'optimisation est une courte centrifugation à 12 000 ×g, qui élimine toute contamination résiduelle du culot d'ARN avant les lavages à l'éthanol.

La dernière étape consiste à regrouper deux préparations d'ARN modifiées provenant du même patient si un rendement total d'ARN plus élevé est requis. En utilisant finalement cette méthode modifiée, qui solubilise le sérum dans de l'eau exempte de nucléase et utilise un tube à verrouillage de phase pour piéger les principales contaminants, ainsi qu'une courte centrifugation. Nous montrons qu'il est possible de maximiser la récupération des petits ARN non codants lors d'une isolation d'ARN à partir de sérum.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le protocole standard d'isolement d'ARN triol, est que, grâce à de simples modifications, nous pouvons maximiser le rendement en ARN à partir de sérum. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les petits ARN sont présents en faible quantité dans le sérum. La méthode optimisée et la visualisation de ces étapes amélioreront la récupération de ces ARN et guideront les débutants vers une isolation réussie.

Pour commencer, décongelez l'échantillon de sérum préparé au préalable sur de la glace, puis transférez 400 microlitres du sérum fraîchement décongelé dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté. Ensuite, diluez le sérum avec 100 microlitres d'eau libre de RNase et ajoutez 50 microlitres de protéinase K à une concentration de un milligramme par millilitre. Incubez ensuite le sérum dilué à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes afin de permettre une digestion protéique adéquate, garantissant ainsi une solubilisation complète avec 1,5 millilitre de tri réactif RTLS et 100 microlitres de quatre promonol.

Retournez brièvement l'homogénat et effectuez un pipetage répétitif pendant cinq secondes. Transférez ensuite le mélange dans un tube verrou à phase lourde de deux millilitres étiqueté. Faites centrifuger l'homogénat à 12 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, versez soigneusement un millilitre de la solution aqueuse obtenue dans un nouveau tube à ADN à faible rétention. La phase organique et l'interface doivent rester piégées sous le gel blanc du tube avec verrouillage de phase. Ajoutez alors cinq microlitres de glycogène et 500 microlitres d'isopropanol à 100 % à la solution aqueuse.

Mélangez la solution par retournement et incubez-la toute la nuit à moins 20 degrés Celsius. Après l'incubation nocturne, centrifugez l'échantillon pendant 20 minutes à 12 000 ×g dans une centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant clair et effectuez une centrifugation rapide pendant deux minutes à 16 000 ×g dans une centrifugeuse à quatre degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette, retirez soigneusement la solution claire entourant le culot. Ensuite, lavez le culot avec un millilitre d’éthanol à 70 % et centrifugez l’échantillon à 10 000 ×g pendant 10 minutes. Pour visualiser le culot, inclinez le tube devant un fond sombre et éliminez délicatement la solution de lavage.

Répétez le lavage. Passez à l'étape suivante. Nous suspendons le culot dans 10 microlitres d'eau exempte d'ARN.

Veillez à ce que le culot soit complètement dissous en chauffant l'échantillon à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant ce temps, mélangez l'échantillon par pipetage répété pour obtenir un meilleur rendement total en ARN, deux préparations d'ARN provenant du même patient. Quantifiez l'ARN resuspendu en utilisant un UV par rapport à.

Spectrophotomètre et évaluer la qualité de l'ARN à l'aide d'un bioanalyseur 2100. Ensuite, conserver les échantillons d'ARN regroupés à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation dans des applications en aval. Les profils spectrophotométriques de l'ARN provenant de sérum humain démontrent le rendement amélioré de l'ARN dû à l'ajout de plusieurs étapes à l'approche traditionnelle de chum Chomsky.

Un profil UV typique de l'ARN isolé à partir de sérum humain se distingue de ceux utilisant des étapes d'optimisation, notamment l'ajout de glycogène et une centrifugation supplémentaire, chaque outil combiné entraînant une réduction des contaminants et un rendement total accru en ARN. La pureté de l'échantillon d'ARN a été davantage améliorée grâce à l'utilisation d'un gel de verrouillage de phase, qui piège le phénol et les protéines. De plus, l'augmentation du volume de sérum a un impact notable sur le rendement en ARN.

Une analyse sur bioanalyseur a été réalisée afin d'évaluer davantage la qualité de l'échantillon. Un seul pic à environ 21 nucléotides représente la fraction de microARN. Le profilage par puces à ADN et la QPCR ont été effectués selon la procédure. Ce profil d'expression obtenu par puces pour trois cancers de la tête et du cou et un échantillon normal S montre l'expression des microARN, analysée par regroupement hiérarchique et présentée sous forme de carte thermique, où l'on peut observer la surexpression et la sous-expression des microARN.

Les courbes d'amplification de la PCR quantitative ont été générées pour des microARN spécifiques. Ces données ont ensuite été utilisées pour tracer les valeurs brutes de CT pour le sérum normal. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur un nombre quelconque de patients, produisant de l'ARN de haute qualité dans les conditions maximales actuelles, à condition d'être correctement exécutée en suivant la procédure. D'autres méthodes, telles que la PCR quantitative ou le séquençage de nouvelle génération, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la découverte et la validation de biomarqueurs.