Name: La combinaison unique molécule manipulation et dimagerie pour létude des interactions protéine-ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Découvrez une méthode combinant pinces optiques doubles et microscopie à fluorescence pour observer les interactions protéine-ADN à l'échelle de la molécule unique. Cette technique permet d'étudier la dynamique de liaison des protéines sur l'ADN avec une précision nanométrique.

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Nous remercions Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, et Peter Gross pour l&#39;aide à la microfluidique et Alessia Tempestini de l&#39;aide pour la préparation des échantillons. Cette recherche a été financée par le septième programme-cadre de l&#39;Union européenne (7e PC / 2007-2013) sous convention de subvention n ° 284464 et par le ministère italien de l&#39;éducation, Université et recherche FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro dans Ricerca 2013 RBFR13V4M2, et dans le cadre de la NANOMAX projet phare.

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<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
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<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans la dernière décennie, les techniques de manipulation et d&#39;imagerie de molécules simples ont vu de grands progrès en termes de résolution spatiale et temporelle. La combinaison des techniques de manipulation et d&#39;imagerie est à la base de puissants outils qui permettent maintenant le contrôle de l&#39;état mécanique d&#39;un polymère biologique unique, tels que ADN, ARN ou du cytosquelette des filaments, et la localisation simultanée de protéines individuelles en interaction avec le même polymère . Contrôle ...

Molécule unique (SM) techniques ont considérablement développé au cours des trente dernières années pour répondre à la nécessité de surmonter certaines des limites de mesures de la solution, en vrac traditionnels 1-3. La manipulation de molécules biologiques simples a créé la possibilité de mesurer les propriétés mécaniques des biopolymères 4 et de contrôler les paramètres mécaniques de protéine-protéine 5 et interactions protéine-ADN 6,7. SM détection de fluorescence, d&#39;autre part, représente un outil très polyvalent pour l&#39;étude de l&#39;activité de la protéine in vitro et in vivo, ce qui conduit à la possibilité de localisation et de suivi de molécules individuelles avec une précision nanométrique. Par ajustement de l&#39;appareil d&#39;étalement de point de fonction-SM de l&#39;image, en fait, on peut réaliser avec une précision de localisation en fonction principalement de rapport signal-sur-bruit (SNR) et d&#39;atteindre une limite de l&#39;ordre de 8,9 nanomètre. Ces méthodologies trouver puissantedes applications dans l&#39;étude de la dynamique des protéines motrices, ainsi que des processus de diffusion qui sous-tendent la recherche de cible dans des protéines de liaison à l&#39;ADN. La fonction de détermination de constantes de diffusion en fonction de la séquence d&#39;ADN, le temps de séjour sur la cible et en mesurant la longueur de l&#39;ADN étudié lors d&#39;événements de diffusion à une dimension avec précision, représentent un outil puissant pour l&#39;étude de la dynamique de l&#39;interaction protéine-ADN et à l&#39;enquête des mécanismes de recherche de cible spécifique. Récemment, la combinaison de ces deux techniques a produit une nouvelle génération de dispositifs expérimentaux de 10 à 14 permettant la manipulation simultanée d&#39;un substrat biologique (par exemple un filament d&#39;actine ou une molécule d&#39;ADN) et la détection / localisation d&#39;un partenaire d&#39;interaction enzyme (par exemple myosine ou d&#39;une protéine de liaison à l&#39;ADN). Les avantages de ces techniques reposent principalement sur la possibilité d&#39;exercer un contrôle mécanique sur le polymère piégé, ainsi enabling l&#39;étude de la dynamique d&#39;interaction par rapport à des forces ou des couples. En outre, la méthode permet de mesurer les réactions biochimiques loin de la surface, en évitant l&#39;une des principales limites des méthodes classiques SM, à savoir, la nécessité pour l&#39;immobilisation des molécules à l&#39;étude sur une surface (lame de verre ou microsphères). La combinaison des deux techniques de molécules simples, il faut surmonter plusieurs difficultés techniques, principalement en raison des exigences de stabilité mécanique et SNR suffisant (en particulier en exigeant la localisation avec une précision nm) 15. En particulier, lors de l&#39;accouplement détection par fluorescence SM avec des pincettes optiques, la réduction du bruit et photoblanchiment des lasers infrarouges piégeage 16 et le contrôle des tampons biochimiques pour l&#39;assemblage des complexes biologiques et la performance des mesures expérimentales 11 sont d&#39;une importance primordiale. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer avec succèsmesures dans une configuration de localisation double piégeage / SM fluorescence. La méthodologie est illustrée par l&#39;exemple de la protéine répresseur lactose (Lad) marqué par fluorescence (avec Atto532) et détecté comme il se lie à une molécule d&#39;ADN (coincé entre deux pinces optiques) contenant des séquences spécifiques Laci liaison (c.-à-opérateurs). Nous démontrons l&#39;efficacité de la méthode de détection de la liaison à l&#39;ADN de LacI et la diffusion le long de son contour dans le processus de recherche de cible. La méthode est applicable à n&#39;importe quelle combinaison de séquences d&#39;ADN et de protéine de liaison à l&#39;ADN, ainsi que pour d&#39;autres systèmes (microtubules ou des filaments d&#39;actine et de protéines interagissant avec les moteurs).

<table><tbody><tr><td>Isolateurs élastomères</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Choisissez l’élastomère Newdamp approprié en fonction du poids du microscope et des fréquences de résonance</td></tr><tr><td>Isolateur optique</td><td>Optique pour la recherche</td><td>Laser IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Nd :YAG, longueur d’onde de 1 064 nm</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Déflecteurs acousto-optiques (AOD)</td><td>A& A optoélectronique</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Direct Digital Synthétiseurs</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de quadrants photodiodes</td><td>OSI optoélectronique</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO et FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Lampe halogène</td><td>Schott</td><td>KL 1500</td><td></td></tr><tr><td>LCD Condenseur</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA immersion</td><td></td>dans l’eau</tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X et 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>CCD multiplié par électrons</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Platine piézoélectrique avec précision nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Billes de silice (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de pentyle&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Liquide et vapeur inflammables (n° 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Solide inflammable&nbsp ; (n° 1272/2008)</td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>avec 2 blocs amovibles ; préchauffé à 120 &deg ; C</td></tr><tr><td>NanoPort assemble</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyétheréthercétone&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Support métallique fait maison pour le montage du réservoir de pression de la chambre d’écoulement en plexiglass</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues à embout verrouillable Luer 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Vannes d’arrêt&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Raccords sans bride&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’éthylène-propylène fluoré&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Deux électrovannes commandées par ordinateur</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotine-14-dCTP&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Désoxynucléotidyltransférase terminale (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide (DMF)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Liquide combustible, nocif par absorption cutanée. Irritant, tératogène. H226 ; H303 ; H312 ; H316 ; H319 ; H331 ; H360 ; P201 ; P261 (traduction libre) P280 ; P305 ; P. 351 ; P. 338 ; P311</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion réduit (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Toxicité aiguë, orale (catégorie 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, Membrane PLQK Ultracel-PL, 10&nbsp ; Concentrateurs de centrifugation de coupure kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>billes de polystyrène recouvertes de streptavidine 1.87 &micro ; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

la combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-adn

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

L’article décrit la combinaison de pinces optiques et de détection de fluorescence de molécules uniques pour l’étude de l’interaction protéine-ADN. La méthode offre la possibilité d’étudier les interactions se produisant en solution (évitant ainsi les problèmes dus aux surfaces proches comme dans d’autres méthodes à molécule unique), de contrôler l’extension de l’ADN et de suivre la dynamique des interactions en fonction des paramètres mécaniques et de la séquence d’ADN. Les méthodes permettant d’établir avec succès le piégeage optique et la localisation nanométrique de molécules uniques sont illustrées. Nous illustrons les conditions expérimentales permettant l’étude de l’interaction du répresseur de lactose (lacI), marqué avec Atto532, avec une molécule d’ADN contenant des séquences cibles spécifiques (opérateurs) pour la liaison de Laci. La méthode permet l’observation d’interactions spécifiques au niveau des opérateurs, ainsi que la diffusion unidimensionnelle de la protéine pendant le processus de recherche de cibles. La méthode est largement applicable à l’étude des interactions protéine-ADN mais aussi aux moteurs moléculaires, où le contrôle de la tension appliquée au polymère de piste partenaire (par exemple l’actine ou les microtubules) est souhaitable.

Dans une expérience réussie, une (ou plusieurs) des protéines marquées subissent liaison / déliaison diffusion et / ou monodimensionnelle long de la molécule d&#39;ADN (figure 3A). La localisation des protéines le long de la molécule d&#39;ADN permet la quantification de paramètres cinétiques en fonction de la séquence d&#39;ADN. Lorsque les conditions de tampon provoquant la diffusion 1D sont appliqués, il est possible de suivre des trajectoires de protéines, et de déterminer, par exemple, le coefficie...

Nous décrivons ici l&#39;instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d&#39;ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer l'interaction dynamique entre une seule protéine de liaison à l'ADN et une molécule d'ADN. Cela est réalisé en combinant, dans un microscope sur mesure, deux techniques de molécule unique : les pinces optiques doubles et la microscopie de fluorescence. Ce dispositif est également équipé d'un éclairage en champ clair pour la visualisation et la stabilisation nanométrique de l'échantillon.En second lieu, une cellule d'écoulement multicanaux intégrée dans un système de micro-écoulement est conçue afin de permettre jusqu'à quatre écoulements laminaire de recruter efficacement et d'assembler tous les composants requis pour l'expérience. Ensuite, le montage monocellulaire est assemblé afin de réaliser les expériences. Tout d'abord, deux microsphères revêtues de titine sont capturées à l’aide de pinces optiques doubles dans le premier canal.Les deux billes piégées sont ensuite déplacées vers le deuxième canal afin de permettre l'attachement du brin d'ADN marqué par de la biotine à ses deux extrémités. La présence d'une seule molécule d'ADN est vérifiée dans le troisième canal par une analyse de force-extension de l'ADN. Enfin, l'assembl

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Biologie

Un mode tapping microscope à force atomique (AFM) Méthode pour la visualisation de l'ADN plasmidique, protéines cytoplasmiques et complexes ADN-protéine est décrite. La méthode comprend d'autres approches pour la préparation d'échantillons pour l'imagerie AFM après manipulation biochimique. Spécifiques d'ADN contenant les régions interacting protein sont observées dans des conditions quasi-tampon physiologique.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Cette vidéo décrit une méthode permettant de visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des molécules d’ADN à des loci spécifiques à l’aide de l’imagerie à molécule unique. Ces condensats sont formés en raison d’interactions LCD-LCD et LCD-DBD, qui permettent le recrutement de l’ARN polymérase II et l’amélioration de la transcription des gènes.

Imagerie d’une seule molécule pour visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des rideaux d’ADN

Microscopie localisation photoactivé (PALM) combiné avec suivi molécule unique permet l'observation directe et la quantification d'interactions protéine-ADN dans des cellules vivantes d'Escherichia coli.

Visualiser les interactions protéine-ADN dans des cellules bactériennes vivantes en utilisant photoactivés suivi unique molécule

Nous présentons ici un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines par microscopie de fluorescence de la réflexion totale interne (TIRFM) en utilisant un substrat d’ADN modifié relativement λ et un point quantique-protéines marquées.

Visualisation de l’Interaction entre les protéines marquées Qdot et ADN λ modifiée relativement à l’échelle de la molécule unique

À l’aide de l’ADN marqué par des points quantiques et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale, nous pouvons étudier le mécanisme de réaction des endonucléases de restriction tout en utilisant des protéines non marquées. Cette technique à molécule unique permet d’observer massivement multiplexée les interactions protéine-ADN individuelles, et les données peuvent être regroupées pour générer des distributions de temps de séjour bien remplies.

Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Ici, nous décrivons l’utilisation de la méthode d’imagerie à molécule unique, les rideaux d’ADN, pour étudier le mécanisme biophysique des condensats EWS-FLI1 assemblés sur l’ADN.

Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

Le rideau d’ADN, une technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule, fournit une plate-forme pour la visualisation en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. Le présent protocole utilise la technique du rideau d’ADN pour étudier le rôle biologique et le mécanisme moléculaire d’Abo1, une ATPase AAA+ contenant du bromodomaine de Schizosaccharomyces pombe .

Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN

La biochimie visuelle à molécule unique étudiée à travers des chambres microfluidiques est grandement facilitée à l’aide d’un baril en verre, de seringues étanches aux gaz, de connexions stables de tubes aux cellules d’écoulement et d’élimination des bulles en plaçant des vannes de commutation entre les seringues et les tubes. Le protocole décrit deux pièges optiques qui permettent de visualiser les transactions d’ADN et les interactions intermoléculaires.

Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Il a été démontré que de nombreuses protéines intrinsèquement désordonnées participent à la formation de condensats biomoléculaires hautement dynamiques, un comportement important pour de nombreux processus cellulaires. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie à molécule unique pour quantifier la dynamique par laquelle les protéines interagissent les unes avec les autres dans les condensats biomoléculaires des cellules vivantes.

Mesure à molécule unique de la dynamique d’interaction des protéines dans les condensats biomoléculaires

Nous rapportons un ensemble hybride et un test à molécule unique pour imager et quantifier directement le mouvement de l’hélicase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) entièrement reconstituée et marquée par fluorescence sur des molécules d’ADN linéaires maintenues en place dans un piège optique.

Ensemble hybride et dosage d’une seule molécule pour imager le mouvement d’une CMG entièrement reconstituée

Ce protocole décrit la procédure pour réaliser la microscopie de localisation profonde à cellule entière à molécule unique (SMLM) à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant avec réassignation optique de photons, permettant ainsi l’imagerie DNA-PAINT sans besoin d’optiques personnalisées ou d’illuminations complexes.

Imagerie super-résolution de cellules entières via DNA-PAINT sur un disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons

Découvrez une méthode combinant pinces optiques doubles et microscopie à fluorescence pour observer les interactions protéine-ADN à l'échelle de la molécule unique. Cette technique permet d'étudier la dynamique de liaison des protéines sur l'ADN avec une précision nanométrique.

La combinaison unique molécule manipulation et d'imagerie pour l'étude des interactions protéine-ADN

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