La combinaison unique molécule manipulation et d'imagerie pour l'étude des interactions protéine-ADN

L’objectif global de cette procédure est d’observer l’interaction dynamique entre une seule protéine de liaison à l’ADN et une molécule d’ADN. Ceci est réalisé en combinant dans un microscope construit sur mesure, deux techniques à molécule unique, une pince à épiler optique double et une microscopie à fluorescence. Cette configuration est également équipée d’un éclairage en champ clair pour la visualisation et la stabilisation nanométrique de l’échantillon.

Dans un deuxième temps, une cellule d’écoulement multicanaux intégrée dans un système de micro-flux est construite pour permettre jusqu’à quatre écoulements laminaires de recruter et d’assembler efficacement tous les composants nécessaires à l’expérience. Ensuite, la construction d’une seule molécule est assemblée afin de réaliser les expériences. Les deux premières microsphères enrobées de titin sont capturées à l’aide de la pince à épiler optique double dans le premier canal.

Les deux billes piégées sont ensuite déplacées vers le deuxième canal pour permettre la fixation de la matrice d’ADN marquée à la biotine aux deux extrémités. La présence d’une seule molécule d’ADN est vérifiée dans le troisième canal par une analyse d’extension de la force de l’ADN. Enfin, la construction de la perle d’ADN de la perle appelée haltère d’ADN est déplacée vers le canal protéique où la protéine répressrice de lactose marquée par fluorescence est présente.

On obtient des résultats qui montrent la diffusion et la liaison spécifique de molécules oculaires LAC uniques sur une seule molécule d’ADN étirée et la quantification des paramètres cinétiques du mouvement oculaire LAC. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes monomoléculaires existantes sont la possibilité de contrôler la tension appliquée à la nouvelle molécule, la possibilité de suivre avec précision les mouvements des protéines de liaison sur un point stable nanométrique, ainsi que la possibilité d’opérer loin de la surface de sommeil de la couverture. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les interactions entre les protéines et l’ADN, en particulier sur la mécanique de la régulation de l’expression des gènes, ainsi que sur la dynamique de la diffusion des protéines le long de l’ADN dans les mécanismes de recherche de cibles.

Ces démonstrations de cette méthode sont très utiles pour montrer les aspects pratiques de la construction de la cellule d’écoulement, de la manipulation des échantillons et de l’assemblage de la construction de la bille d’ADN beat. Cette vidéo montrera d’abord comment vérifier la stabilité du pointage des deux lasers de piégeage à l’aide de microbilles collées sur une surface de recouvrement comme référence. Des détails sur la conception et la construction de la configuration de la pince à épiler optique peuvent être trouvés dans le texte du protocole d’accompagnement.

À l’aide d’une lamelle de 24 x 60 millimètres, étalez deux microlitres de billes de silice sur la surface d’une lamelle de 24 x 32 millimètres. À l’aide de deux morceaux de ruban adhésif double face. Fixez la lamelle de 24 x 32 millimètres sur une lame de microscope pour créer une cellule d’écoulement.

Remplissez la cellule d’écoulement avec 50 millimolaires de tampon phosphate et scellez-la avec une image de graisse au silicium. Une bille de silice en microscopie à fond clair à un grossissement d’environ 2000 fois. Le champ de vision doit être d’environ sept par cinq micromètres, acquis à 7 68 par 5, 76 pixels de sorte que l’image de la perle ait un diamètre d’environ 190 pixels, compenser les dérives thermiques avec un logiciel de rétroaction qui calcule la position XY à partir du centre de l’image et Z à partir des anneaux de diffraction et corrige les dérives.

En déplaçant un étage pizo avec une précision nanométrique ou mieux, en superposant le centre du piège gauche avec le centre de la bille et en mesurant le bruit de position et son écart-type par rapport au détecteur de quadrant, à la photodiode ou au QDP. Répétez la mesure pour le bon piège. L’écart-type du bruit de position doit être de quelques nanomètres pour permettre une localisation précise des protéines de liaison à l’ADN pour former la cellule d’écoulement.

Une pointe de diamant est d’abord utilisée pour percer des trous d’un millimètre de diamètre dans un microscope de 76 x 76 x 1 millimètre. Faites glisser pour créer quatre entrées et une sortie. Cela permet d’utiliser jusqu’à quatre flux de mémoire tampon parallèles.

Chacun contenant l’un des différents composants nécessaires à l’expérience : des billes, des protéines marquées par fluorescence à ADN et un tampon d’imagerie. Nettoyez la lame de microscope avec de l’éthanol et centrez le port avec le joint torique inséré et l’anneau adhésif dans la lame entourant les trous d’accès. Il est indispensable de porter des gants lors de cette étape pour éviter les traces de doigts, qui perturberaient le processus de collage.

À l’aide d’une deuxième glissière, fixez les nanoports à la glissière et placez-la dans un four préchauffé à 180 degrés Celsius pendant une heure pour permettre une fixation complète. Pendant ce temps, dessinez le contour de la cellule d’écoulement sur une feuille de papier. Le canal doit avoir une largeur d’environ trois millimètres et correspondre à toutes les positions sur la lame de microscope.

Placez le dessin sur deux morceaux de fil et avec un scalpel, faites des coupes nettes et continues le long du contour dessiné. Retirez toutes les protubérances formées, jetez la couche inférieure de parfum, qui sert juste à garantir un support propre. Ensuite, placez la lame de microscope contenant les nanoports attachés à l’envers dans le support métallique.

Alignez soigneusement le contour de la chambre de paraforme avec les trous, en vous assurant que le paramètre n’extrude pas les entrées et sorties du couvercle de la chambre avec une lamelle de protection de microscope nettoyée et retirez soigneusement l’excès de paramètres entourant la chambre. Placez deux blocs chauffants préalablement chauffés à 120 degrés Celsius sur le dessus de la cellule d’écoulement pour appliquer une pression homogène sur celle-ci. Laissez fondre le film para pendant environ 25 minutes.

L’étape suivante consiste à préparer le réservoir sous pression et les récipients tampons. Le réservoir sous pression est en plexiglas et permet d’accueillir jusqu’à six conteneurs tampons. Tout d’abord, connectez les vannes d’arrêt à la sortie des conteneurs tampons pour activer le débit tampon avec le levier de la vanne en position verticale ou désactivé en position de rotation dans le sens des aiguilles d’une montre.

Pendant les expériences, montez la cellule d’écoulement sur la platine du microscope. Connectez ensuite les vannes d’arrêt à travers le tube en polyéther, en éther cétone ou en pointe, et les filatures sans bride aux entrées de la chambre d’écoulement. Le tube de pointe a un diamètre intérieur d’environ 150 micromètres kilomètres, environ trois centimètres de tube d’éthylène-propylène fluoré d’un diamètre intérieur d’environ 500 micromètres sont utilisés comme lien entre le tube de pointe et les assemblages de ports nano de la cellule d’écoulement.

Ceci est essentiel pour réduire le flux tampon à l’entrée de la chambre afin d’éviter la rupture de la cellule d’écoulement ou le détachement du port nano du verre. En revanche, l’utilisation de tubes de grand diamètre intérieur nécessiterait à elle seule de grands volumes d’échantillons biologiques. Connectez la sortie de la chambre d’écoulement à un tube Falcon ouvert à la pression atmosphérique.

Ce tube sert d’élimination pour le tampon s’écoulant de la chambre d’écoulement. Pour commencer cette procédure, ajoutez un millilitre de tampon A dans chacun des récipients tampons et appliquez une pression de 200 millibars pour laver les tubes de raccordement et la cellule d’écoulement. Un système de contrôle de la pression est capable.

Enfin, ajustez la pression de l’air à l’intérieur du réservoir de pression. Vérifiez la présence de bulles d’air, qui pourraient perturber la fluidité de l’écoulement. Un léger mouvement sur le tube de sortie aidera à éliminer toutes les bulles restantes, à réduire la pression à 20 millibars et à vérifier que tous les canaux et tubes sont exempts de bulles d’air et que le tampon s’écoule à des vitesses similaires dans tous les canaux.

Préparez les échantillons jusqu’à un volume final de 300 microlitres. Cette expérience utilise des billes de polystyrène recouvertes de streptocoque, de l’ADN linéaire biotinylé aux deux extrémités qui contiennent des séquences cibles spécifiques pour la liaison du répresseur de lactose et une protéine répresseur de lactose marquée par fluorescence. Ajoutez chaque échantillon dans l’un des récipients de seringue dans l’ordre suivant : les billes du premier canal : l’ADN dans le deuxième, le tampon d’imagerie dans le troisième et la protéine marquée dans le quatrième canal.

Allumez le débit à 20 millibars et ouvrez les vannes d’arrêt pour laisser les échantillons arriver à l’intérieur du canal d’écoulement. Ceci est facilement détectable dans le canal de bille. Pendant que vous imagez le premier canal sous éclairage en fond clair, allumez les deux pinces optiques et attrapez une bille de polystyrène dans chaque piège.

Déplacez-vous rapidement vers le deuxième canal pour éviter que les autres perles ne tombent dans les pièges. A noter que l’arrivée dans le canal ADN est facilement perceptible à la fin du flux de billes. À l’aide d’un déflecteur optique AO ou d’un mouvement OD, un piège perle d’avant en arrière à proximité de l’autre perle pour permettre la fixation de l’ADN étendu du flux entre les deux billes piégées optiquement.

Lorsqu’un haltère à ADN est formé, la perle statique commence à suivre le mouvement de la perle qui est activement déplacée d’avant en arrière par le piège. Passez rapidement au canal de mémoire tampon et désactivez le flux de mémoire tampon. Effectuez une analyse de la courbe d’extension de force pour vérifier la présence d’une seule molécule d’ADN.

Ceci est accompli en séparant les deux billes tout en mesurant la tension de l’ADN. Une fois qu’un seul haltère à ADN est obtenu, réactivez le flux et déplacez l’haltère vers le canal protéique. Passez à la microscopie à fluorescence à champ large pour surveiller l’interaction de la protéine répressrice de lactose marquée avec l’ADN, désactivez le flux et lancez l’acquisition.

Cette méthode permet de détecter des molécules uniques de lactose, répresseur ou de lac, de l’œil interagissant avec une molécule d’ADN étirée. Dans cet agramme CH représentatif, une seule molécule de l’œil du lac diffuse le long de séquences d’ADN non spécifiques, tandis qu’une autre molécule de l’œil du lac est spécifiquement liée à un opérateur situé au centre de la molécule d’ADN. Ce graphique montre la position des deux molécules de l’œil le long de la direction reliant les centres des deux pièges.

En fonction du temps, les positions des molécules ont été déterminées par l’algorithme du centre de symétrie radiale montré ici est un graphique du déplacement carré moyen ou MSD en fonction du temps pour une seule molécule de l’œil de lac diffusant le long d’une molécule d’ADN étirée. Le coefficient de diffusion de la protéine peut être facilement obtenu à partir d’une régression linéaire des données. La combinaison de techniques de manipulation et d’imagerie est une méthode puissante, permettant un contrôle mécanique sur un seul polymère biologique tel que D-N-A-R-N-A ou un filament cytosquelettique, et la localisation simultanée de molécules de protéines uniques interagissant avec le polymère lui-même.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la combinaison de la manipulation d’une molécule unique et des techniques d’imagerie nécessite une conception minutieuse de la configuration expérimentale pour assurer la stabilité au niveau nanométrique du polymère en suspension. D’autre part, une conception appropriée de la sonde biologique est nécessaire pour garantir une séparation spéciale entre le laser G de piégeage et la sonde fluorescente. Veuillez vous référer au texte du protocole ci-joint pour plus de détails.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler la molécule d’ADN entre les deux rapides optiques qui battent l’assemblage de cette construction. Il est préférable de l’obtenir avec la cellule d’écoulement multicanaux pour laquelle nous avons fourni la description détaillée. Nous avons également indiqué comment optimiser le flux tampon et éliminer les bulles d’air, qui pourraient autrement compromettre vos expériences.

Dans le protocole de texte combiné, vous pouvez trouver les protocoles pour marquer l’ADN avec bioTE, qui est nécessaire pour l’assemblage avec les battements enrobés de streptavidine ainsi que les protocoles pour marquer la protéine. Enfin, nous avons illustré les opérations étape par étape pour quantifier la liaison et la diffusion d’une seule protéine répressive du lactose sur une molécule d’ADN stretch.