Name: La combinaison unique molécule manipulation et dimagerie pour létude des interactions protéine-ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Découvrez une méthode combinant pinces optiques doubles et microscopie à fluorescence pour observer les interactions protéine-ADN à l'échelle de la molécule unique. Cette technique permet d'étudier la dynamique de liaison des protéines sur l'ADN avec une précision nanométrique.

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Nous remercions Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, et Peter Gross pour l&#39;aide à la microfluidique et Alessia Tempestini de l&#39;aide pour la préparation des échantillons. Cette recherche a été financée par le septième programme-cadre de l&#39;Union européenne (7e PC / 2007-2013) sous convention de subvention n ° 284464 et par le ministère italien de l&#39;éducation, Université et recherche FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro dans Ricerca 2013 RBFR13V4M2, et dans le cadre de la NANOMAX projet phare.

<ol><li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li>
<li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms%2C+one+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li>
<li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+chemistry+chemical+physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans la dernière décennie, les techniques de manipulation et d&#39;imagerie de molécules simples ont vu de grands progrès en termes de résolution spatiale et temporelle. La combinaison des techniques de manipulation et d&#39;imagerie est à la base de puissants outils qui permettent maintenant le contrôle de l&#39;état mécanique d&#39;un polymère biologique unique, tels que ADN, ARN ou du cytosquelette des filaments, et la localisation simultanée de protéines individuelles en interaction avec le même polymère . Contrôle ...

Molécule unique (SM) techniques ont considérablement développé au cours des trente dernières années pour répondre à la nécessité de surmonter certaines des limites de mesures de la solution, en vrac traditionnels 1-3. La manipulation de molécules biologiques simples a créé la possibilité de mesurer les propriétés mécaniques des biopolymères 4 et de contrôler les paramètres mécaniques de protéine-protéine 5 et interactions protéine-ADN 6,7. SM détection de fluorescence, d&#39;autre part, représente un outil très polyvalent pour l&#39;étude de l&#39;activité de la protéine in vitro et in vivo, ce qui conduit à la possibilité de localisation et de suivi de molécules individuelles avec une précision nanométrique. Par ajustement de l&#39;appareil d&#39;étalement de point de fonction-SM de l&#39;image, en fait, on peut réaliser avec une précision de localisation en fonction principalement de rapport signal-sur-bruit (SNR) et d&#39;atteindre une limite de l&#39;ordre de 8,9 nanomètre. Ces méthodologies trouver puissantedes applications dans l&#39;étude de la dynamique des protéines motrices, ainsi que des processus de diffusion qui sous-tendent la recherche de cible dans des protéines de liaison à l&#39;ADN. La fonction de détermination de constantes de diffusion en fonction de la séquence d&#39;ADN, le temps de séjour sur la cible et en mesurant la longueur de l&#39;ADN étudié lors d&#39;événements de diffusion à une dimension avec précision, représentent un outil puissant pour l&#39;étude de la dynamique de l&#39;interaction protéine-ADN et à l&#39;enquête des mécanismes de recherche de cible spécifique. Récemment, la combinaison de ces deux techniques a produit une nouvelle génération de dispositifs expérimentaux de 10 à 14 permettant la manipulation simultanée d&#39;un substrat biologique (par exemple un filament d&#39;actine ou une molécule d&#39;ADN) et la détection / localisation d&#39;un partenaire d&#39;interaction enzyme (par exemple myosine ou d&#39;une protéine de liaison à l&#39;ADN). Les avantages de ces techniques reposent principalement sur la possibilité d&#39;exercer un contrôle mécanique sur le polymère piégé, ainsi enabling l&#39;étude de la dynamique d&#39;interaction par rapport à des forces ou des couples. En outre, la méthode permet de mesurer les réactions biochimiques loin de la surface, en évitant l&#39;une des principales limites des méthodes classiques SM, à savoir, la nécessité pour l&#39;immobilisation des molécules à l&#39;étude sur une surface (lame de verre ou microsphères). La combinaison des deux techniques de molécules simples, il faut surmonter plusieurs difficultés techniques, principalement en raison des exigences de stabilité mécanique et SNR suffisant (en particulier en exigeant la localisation avec une précision nm) 15. En particulier, lors de l&#39;accouplement détection par fluorescence SM avec des pincettes optiques, la réduction du bruit et photoblanchiment des lasers infrarouges piégeage 16 et le contrôle des tampons biochimiques pour l&#39;assemblage des complexes biologiques et la performance des mesures expérimentales 11 sont d&#39;une importance primordiale. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer avec succèsmesures dans une configuration de localisation double piégeage / SM fluorescence. La méthodologie est illustrée par l&#39;exemple de la protéine répresseur lactose (Lad) marqué par fluorescence (avec Atto532) et détecté comme il se lie à une molécule d&#39;ADN (coincé entre deux pinces optiques) contenant des séquences spécifiques Laci liaison (c.-à-opérateurs). Nous démontrons l&#39;efficacité de la méthode de détection de la liaison à l&#39;ADN de LacI et la diffusion le long de son contour dans le processus de recherche de cible. La méthode est applicable à n&#39;importe quelle combinaison de séquences d&#39;ADN et de protéine de liaison à l&#39;ADN, ainsi que pour d&#39;autres systèmes (microtubules ou des filaments d&#39;actine et de protéines interagissant avec les moteurs).

<table><tbody><tr><td>Isolateurs élastomères</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Choisissez l’élastomère Newdamp approprié en fonction du poids du microscope et des fréquences de résonance</td></tr><tr><td>Isolateur optique</td><td>Optique pour la recherche</td><td>Laser IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Nd :YAG, longueur d’onde de 1 064 nm</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Déflecteurs acousto-optiques (AOD)</td><td>A& A optoélectronique</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Direct Digital Synthétiseurs</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de quadrants photodiodes</td><td>OSI optoélectronique</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO et FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Lampe halogène</td><td>Schott</td><td>KL 1500</td><td></td></tr><tr><td>LCD Condenseur</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA immersion</td><td></td>dans l’eau</tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X et 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>CCD multiplié par électrons</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Platine piézoélectrique avec précision nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Billes de silice (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de pentyle&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Liquide et vapeur inflammables (n° 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Solide inflammable&nbsp ; (n° 1272/2008)</td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>avec 2 blocs amovibles ; préchauffé à 120 &deg ; C</td></tr><tr><td>NanoPort assemble</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyétheréthercétone&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Support métallique fait maison pour le montage du réservoir de pression de la chambre d’écoulement en plexiglass</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues à embout verrouillable Luer 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Vannes d’arrêt&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Raccords sans bride&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’éthylène-propylène fluoré&nbsp ;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Deux électrovannes commandées par ordinateur</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotine-14-dCTP&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Désoxynucléotidyltransférase terminale (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide (DMF)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Liquide combustible, nocif par absorption cutanée. Irritant, tératogène. H226 ; H303 ; H312 ; H316 ; H319 ; H331 ; H360 ; P201 ; P261 (traduction libre) P280 ; P305 ; P. 351 ; P. 338 ; P311</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion réduit (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Toxicité aiguë, orale (catégorie 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, Membrane PLQK Ultracel-PL, 10&nbsp ; Concentrateurs de centrifugation de coupure kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>billes de polystyrène recouvertes de streptavidine 1.87 &micro ; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

la combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-adn

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

L’article décrit la combinaison de pinces optiques et de détection de fluorescence de molécules uniques pour l’étude de l’interaction protéine-ADN. La méthode offre la possibilité d’étudier les interactions se produisant en solution (évitant ainsi les problèmes dus aux surfaces proches comme dans d’autres méthodes à molécule unique), de contrôler l’extension de l’ADN et de suivre la dynamique des interactions en fonction des paramètres mécaniques et de la séquence d’ADN. Les méthodes permettant d’établir avec succès le piégeage optique et la localisation nanométrique de molécules uniques sont illustrées. Nous illustrons les conditions expérimentales permettant l’étude de l’interaction du répresseur de lactose (lacI), marqué avec Atto532, avec une molécule d’ADN contenant des séquences cibles spécifiques (opérateurs) pour la liaison de Laci. La méthode permet l’observation d’interactions spécifiques au niveau des opérateurs, ainsi que la diffusion unidimensionnelle de la protéine pendant le processus de recherche de cibles. La méthode est largement applicable à l’étude des interactions protéine-ADN mais aussi aux moteurs moléculaires, où le contrôle de la tension appliquée au polymère de piste partenaire (par exemple l’actine ou les microtubules) est souhaitable.

Dans une expérience réussie, une (ou plusieurs) des protéines marquées subissent liaison / déliaison diffusion et / ou monodimensionnelle long de la molécule d&#39;ADN (figure 3A). La localisation des protéines le long de la molécule d&#39;ADN permet la quantification de paramètres cinétiques en fonction de la séquence d&#39;ADN. Lorsque les conditions de tampon provoquant la diffusion 1D sont appliqués, il est possible de suivre des trajectoires de protéines, et de déterminer, par exemple, le coefficie...

Nous décrivons ici l&#39;instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d&#39;ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer l'interaction dynamique entre une seule protéine de liaison à l'ADN et une molécule d'ADN. Cela est réalisé en combinant, dans un microscope sur mesure, deux techniques de molécule unique : les pinces optiques doubles et la microscopie de fluorescence. Ce dispositif est également équipé d'un éclairage en champ clair pour la visualisation et la stabilisation nanométrique de l'échantillon.En second lieu, une cellule d'écoulement multicanaux intégrée dans un système de micro-écoulement est conçue afin de permettre jusqu'à quatre écoulements laminaire de recruter efficacement et d'assembler tous les composants requis pour l'expérience. Ensuite, le montage monocellulaire est assemblé afin de réaliser les expériences. Tout d'abord, deux microsphères revêtues de titine sont capturées à l’aide de pinces optiques doubles dans le premier canal.Les deux billes piégées sont ensuite déplacées vers le deuxième canal afin de permettre l'attachement du brin d'ADN marqué par de la biotine à ses deux extrémités. La présence d'une seule molécule d'ADN est vérifiée dans le troisième canal par une analyse de force-extension de l'ADN. Enfin, l'assemblage bille-ADN-bille, appelé haltère d'ADN, est déplacé vers le canal contenant les protéines, où se trouve la protéine répresseur de lactose marquée au fluorochrome.Des résultats sont obtenus, montrant la diffusion et la liaison spécifique de molécules individuelles de LAC eye sur une molécule unique d'ADN étiré, ainsi que la quantification des paramètres cinétiques du mouvement de LAC eye. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'analyse de molécules uniques sont la possibilité de contrôler la tension appliquée à la molécule d'ADN, la capacité de suivre précisément les mouvements des protéines liantes sur une zone stable de quelques nanomètres, ainsi que la possibilité de travailler loin de la surface du couvercle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les interactions protéine-ADN, notamment sur la mécanique de la régulation de l'expression des gènes, ainsi que sur la dynamique de la diffusion des protéines le long de l'ADN dans les mécanismes de recherche de cibles.La démonstration de cette méthode est très utile pour illustrer les aspects pratiques de la construction de la cellule d'écoulement, de la manipulation de l'échantillon et du montage du construct de perles d'ADN battante. Cette vidéo montrera d'abord comment vérifier la stabilité du pointage des deux lasers de piégeage en utilisant des microperles fixées sur la surface d'un coverslip comme référence. Des détails sur la conception et la réalisation du dispositif de pinces optiques sont disponibles dans le texte du protocole associé.Utilisez un couvre-objet de 24 sur 60 millimètres pour étaler deux microlitres de billes de silice sur la surface d'un couvre-objet de 24 sur 32 millimètres. À l'aide de deux morceaux de ruban adhésif double face, fixez le couvre-objet de 24 sur 32 millimètres sur une lame de microscope afin de créer une chambre d'écoulement.Remplissez la cellule d'écoulement avec un tampon phosphate à 50 millimolaire et scellez-la avec de la graisse de silicone image. Une microbille de silice en microscopie en champ clair à une amplification d’environ 2000 fois. Le champ de vision doit mesurer environ sept par cinq micromètres, acquis en 768 par 576 pixels, de sorte que l’image de la microbille ait un diamètre d’environ 190 pixels. Compensez les dérives thermiques à l’aide d’un logiciel de rétroaction qui calcule la position en XY à partir du centroïde de l’image et en Z à partir des anneaux de diffraction, puis corrige les dérives.Déplacez une platine piézo avec une précision nanométrique ou meilleure afin de superposer le centre du piège gauche au centre de la perle, puis mesurez le bruit de position et son écart type à partir de la photodiode à quadrant ou QDP. Répétez la mesure pour le piège droit. L’écart type du bruit de position doit être de quelques nanomètres afin de permettre une localisation précise des protéines de liaison à l’ADN lors de la fabrication de la cellule d’écoulement.Une pointe en diamant est d'abord utilisée pour percer des trous de un millimètre de diamètre dans une lame de microscope de 76 sur 76 sur un millimètre. Cette opération crée quatre entrées et une sortie. Cela permettra jusqu'à quatre flux tampons parallèles.Chaque compartiment contient l'un des différents composants nécessaires à l'expérience : billes, ADN, protéine marquée au fluorochrome et tampon d'imagerie. Nettoyez la lame de microscope avec de l'éthanol et centrez le port muni de la joint torique inséré, ainsi que de l'anneau adhésif sur la lame autour des orifices d'accès. Il est essentiel de porter des gants pendant cette étape afin d'éviter les empreintes digitales, qui perturberaient le processus de collage.À l’aide d’un deuxième support, fixez les nano-ports sur la lame et placez-la dans un four préchauffé à 180 degrés Celsius pendant une heure afin de permettre une fixation complète. Pendant ce temps, dessinez sur une feuille de papier le motif du contour de la cellule d’écoulement. Le canal doit avoir une largeur d’environ trois millimètres et correspondre aux positions des puits sur la lame de microscope.Placez le dessin sur deux morceaux de perfil et, à l’aide d’un scalpel, effectuez des incisions nettes et continues le long du contour tracé. Retirez toutes les protubérances formées, jetez la couche inférieure de parfum, utilisée uniquement pour garantir un support propre. Ensuite, placez la lame de microscope contenant les nanoports fixés à l’envers dans le support métallique.Alignez soigneusement le contour de la chambre à paraffine avec les trous, en veillant à ce que la paraffine n'obstrue pas les entrées et la sortie de la chambre. Recouvrez la chambre d'une lamelle de microscope propre et retirez soigneusement l'excès de paraffine autour de la chambre. Placez deux blocs chauffants préalablement chauffés à 120 degrés Celsius sur la cellule d'écoulement afin d'appliquer une pression homogène. Laissez fondre la pellicule de paraffine pendant environ 25 minutes.L'étape suivante consiste à préparer le réservoir de pression et les récipients tampons. Le réservoir de pression, en plexiglas, permet d'accommoder jusqu'à six récipients tampons. Commencez par raccorder les vannes d'arrêt à la sortie des récipients tampons afin d'activer le débit du tampon en positionnant le levier de la vanne en position verticale ou de l'interrompre en tournant le levier dans le sens horaire.Pendant les expériences, fixez la cellule d'écoulement sur la platine du microscope. Ensuite, reliez les vannes d'arrêt au moyen de tubes en polyéther, éther, cétone (PEEK) et de raccords sans bride aux entrées de la chambre d'écoulement. Le tube PEEK a un diamètre intérieur d'environ 150 micromètres ; environ trois centimètres de tube en fluorure d'éthylène propylène avec un diamètre intérieur d'environ 500 micromètres sont utilisés comme liaison entre le tube PEEK et les embouts nano des ensembles de la cellule d'écoulement.Cela est essentiel pour réduire le débit du tampon à l'entrée de la chambre afin d'éviter la rupture de la cellule d'écoulement ou le détachement du nano-raccord du verre. L'utilisation de tubes à grand diamètre intérieur, d'autre part, nécessiterait de grands volumes d'échantillons biologiques. Connectez la sortie de la chambre d'écoulement à un tube Falcon ouvert à la pression atmosphérique.Ce tube sert à recueillir le tampon s'écoulant de la chambre d'écoulement. Pour commencer cette procédure, ajoutez un millilitre de tampon A dans chacun des récipients à tampon et appliquez une pression de 200 millibars pour rincer les tubes de connexion et la cellule d'écoulement. Un système de régulation de pression en est capable.Enfin, ajustez la pression d'air à l'intérieur du réservoir de pression. Vérifiez la présence de bulles d'air, qui pourraient perturber la régularité de l'écoulement. Un léger tapotement sur le tube de sortie permettra d'éliminer les bulles résiduelles, réduisez la pression à 20 millibars, puis vérifiez que tous les canaux et tubes sont exempts de bulles d'air et que le tampon s'écoule à des vitesses similaires dans tous les canaux.Préparez les échantillons à un volume final de 300 microlitres. Cette expérience utilise des billes de polystyrène revêtues de strept, de l'ADN linéaire biotinylé aux deux extrémités contenant des séquences cibles spécifiques pour la fixation du répresseur de lactose et une protéine répresseur de lactose marquée par fluorescence. Ajoutez chaque échantillon à l'un des récipients de seringue dans l'ordre suivant : les billes dans le premier canal, l'ADN dans le deuxième, le tampon d'imagerie dans le troisième et la protéine marquée dans le quatrième canal.Activer le débit à 20 millibars et ouvrir les vannes d'arrêt pour permettre l'arrivée des échantillons dans le canal de débit. Ceci est facilement détectable dans le canal des billes. Pendant l'acquisition d'images du premier canal en éclairage en champ clair, activer les deux pinces optiques et capturer une bille de polystyrène dans chaque piège.Déplacez-vous rapidement vers le deuxième canal afin d'éviter que les autres billes ne tombent dans les pièges. Notez que l'arrivée dans le canal d'ADN est facilement visible à la fin du flux de billes. À l'aide d'un déflecteur optique AO ou d'un déplacement OD, déplacez une bille piégée en va-et-vient à proximité de l'autre bille afin de permettre l'attachement de l'ADN étiré par le flux entre les deux billes piégées optiquement.Lorsqu'un dumbbell d'ADN est formé, la perle statique commence à suivre le mouvement de la perle activement déplacée d'avant en arrière par le piège. Passez rapidement au canal de tampon et arrêtez l'écoulement du tampon. Effectuez une analyse de courbe force-extension pour vérifier la présence d'une seule molécule d'ADN.Cela est réalisé en séparant les deux billes tout en mesurant la tension de l'ADN. Une fois qu'un unique haltère d'ADN est obtenu, réactivez l'écoulement et déplacez l'haltère vers le canal protéique. Passez à la microscopie de fluorescence en champ large pour surveiller l'interaction entre la protéine répresseur de la lactose marquée et l'ADN, arrêtez l'écoulement et commencez l'acquisition.Cette méthode permet la détection de répresseurs uniques de lactose ou de molécules uniques de lac eye interagissant avec une molécule d'ADN étirée. Dans ce diagramme CH représentatif, une molécule unique de lac eye diffuse le long de séquences d'ADN non spécifiques, tandis qu'une autre molécule de lac eye est spécifiquement liée à un opérateur situé au centre de la molécule d'ADN. Ce graphique montre la position des deux molécules de lac eye le long de la direction reliant les centres des deux pièges.En fonction du temps, les positions des mol&eacute;cules ont &eacute;t&eacute; d&eacute;termin&eacute;es &agrave; l&apos;aide de l&apos;algorithme du centre de sym&eacute;trie radiale. On pr&eacute;sente ici un graphique du d&eacute;placement quadratique moyen, ou DQM, en fonction du temps, pour une seule mol&eacute;cule lac eye diffusant le long d&apos;une mol&eacute;cule d&apos;ADN &eacute;tir&eacute;e. Le coefficient de diffusion de la prot&eacute;ine peut &ecirc;tre facilement obtenu par r&eacute;gression lin&eacute;aire des donn&eacute;es. La combinaison de techniques de manipulation et d&apos;imagerie constitue une m&eacute;thode puissante, permettant un contr&ocirc;le m&eacute;canique sur un unique polym&egrave;re biologique tel que l&apos;ADN, l&apos;ARN ou un filament du cytosquelette, ainsi que la localisation simultan&eacute;e de mol&eacute;cules prot&eacute;iques uniques interagissant avec le polym&egrave;re lui-m&ecirc;me.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la combinaison de techniques de manipulation et d'imagerie à l'échelle d'une molécule unique nécessite une conception soigneuse du dispositif expérimental afin d'assurer une stabilité à l'échelle du nanomètre du polymère en suspension. Par ailleurs, une conception adéquate de la sonde biologique est nécessaire pour garantir une séparation spatiale entre le laser de piégeage G et la sonde fluorescente. Veuillez vous référer au texte du protocole accompagnant pour plus de détails.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assembler la molécule d'ADN entre les deux battements rapides optiques lors de l'assemblage de ce construct. Ce résultat est meilleur lorsqu'on utilise la chambre d'écoulement multicanal, dont nous avons fourni la description détaillée. Nous avons également indiqué comment optimiser le débit du tampon et éliminer les bulles d'air, qui pourraient autrement compromettre vos expériences.Dans le protocole combiné, vous trouverez les protocoles pour marquer l'ADN avec bioTE, ce qui est nécessaire pour l'assemblage avec les billes revêtues de streptavidine, ainsi que les protocoles pour marquer la protéine. Enfin, nous avons illustré les opérations étape par étape permettant de quantifier la liaison et la diffusion d'une seule protéine répressive de la lactose sur une molécule d'ADN étirée.

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