Name: ScanLag: haut débit Quantification de Colony croissance et décalage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Découvrez la méthode ScanLag pour quantifier la distribution du temps de latence des cultures bactériennes et distinguer les variants à croissance lente. Cette technique d'imagerie en haut débit permet d'analyser la dynamique de croissance coloniale avec précision.

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Nous remercions Eliq Oster pour les images du Bacillus subtillis. Le travail est soutenu par le Conseil européen de la recherche (# 260871) et la Fondation israélienne pour la science (# 592/10).

1. Construire le programme d&#39;installation <ol><li> Choisissez un scanner à plat, résolution optique: 4800 dpi; Résolution de matériel: 4800 x 9600 dpi; couleur profondeur de bits: 48 bits, qui peut fonctionner à des niveaux de température et d&#39;humidité pertinents. </li><li> Boîtes de Pétri ont un volume important, contrairement au papier habituellement utilisé sur les scanners commerciaux. Les colonies se situent au-dessus de la couche de gélose, d&#39;environ 5 mm au-dessus de la surface du scanner. Remarque: Pour la plupart des scanners les colonies seront mis au point. </li><li> Certaines entreprises du scanner ne permettent pas la connexion de plus d&#39;un exemple de scanner du même type sur le même ordinateur. Assurez-vous que plus d&#39;un scanner peut être attaché et identifié de manière unique. </li><li> Préparer les accessoires tels que détaillés ci-dessous: <ol><li> Préparer des morceaux de feutrine noire stérile pour couvrir les plaques (figure 1 étape 2). </li><li> Pour tenir les boîtes de Pétri en place, préparer les détenteurs de plaques blanches (Matériels et méthodes) qui correspondent aux scanners et qui ont 6 holes de la taille des plats (figure 1 de l&#39;étape 3). </li></ol></li><li> Si nécessaire pour la croissance du micro-organisme, mettre les scanners dans un environnement à température contrôlée. Connectez les scanners à l&#39;ordinateur. </li><li> Facultatif: Connectez le relais à l&#39;ordinateur et de contourner l&#39;interrupteur marche / arrêt du scanner à surmonter gradient de température. NOTE: L&#39;unité de relais est pour les micro-organismes extrêmement sensibles à la température. Il s&#39;éteint le scanner de sorte que l&#39;électronique ne chauffent pas la surface inégale. En utilisant seulement une partie de la surface du scanner peut obtenir des résultats similaires. </li></ol> 2. Installez le Gestionnaire de numérisation <ol><li> Copiez tous les fichiers de l&#39;application &quot;Gestionnaire de numérisation&quot; dans un répertoire désigné de http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Configurez fichier ScanningManager.exe.config selon les noms des scanners telles qu&#39;elles apparaissent dans Management-&gt; Gestionnaire de périphériques-&gt; Périphériques d&#39;images informatiques ( <strong&gt; Figure 2). </li><li> Pour le dépannage de l&#39;application &quot;Gestionnaire de numérisation», voir le fichier lisez-moi. </li><li> Pour la documentation sur l&#39;application &quot;Gestionnaire de numérisation», voir Documentation.html. </li></ol> 3. Réaliser une expérience <ol><li> Préparer les boîtes de Pétri (figure 1): <ol><li> Diluer la culture à environ 2000 CFU / ml. Plate 0,1 ml de culture de manière uniforme sur la surface de la plaque. </li><li> Pour obtenir un bon contraste entre les colonies et le plat et à absorber l&#39;humidité, couvrir la plaque avec un morceau de feutrine noire stérile. Mettre le couvercle sur la plaque. </li></ol></li><li> Placer les plaques dans les supports sur les scanners. </li><li> Démarrez le Gestionnaire de numérisation (Figure 3): Choisissez les scanners participants de la liste des scanneurs connectés. Choisissez le nombre d&#39;images à prendre (répétitions), l&#39;intervalle de temps entre les images suivantes (l&#39;écart du temps), et le délai d&#39;attente avant de commencer til expérimenter (démarrer après). </li></ol> 4. L&#39;analyse des images REMARQUE: Un aperçu des méthodes de calcul est prévu pour analyser les images en utilisant MATLAB &quot;ScanLag&quot;, qui est disponible gratuitement pour un usage non-commercial à http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Autres fonctions disponibles sont décrites dans le manuel du logiciel, et un exemple de code est complété. <ol><li> Trier les images de chaque scanner dans des dossiers séparés. </li><li> Utilisation de la fenêtre de commande de Matlab, exécutez les procédures suivantes. Les paramètres requis pour exécuter ces procédures sont définies dans le manuel du logiciel. <ol><li> Exécutez PreparePictures pour effectuer un prétraitement: En pré-traitement, les images d&#39;un scanner sont alignés. Chaque boîte de Pétri est rognée de chaque séquence d&#39;images. L&#39;heure à laquelle chaque image a été recueilli est récupérée à partir de l&#39;horodatage. </li><li> TLAllPlates Exécuter pour exécuter la détection et le suivi en ehaque plat Petri séparément, les colonies sont détectés et attribuer un numéro d&#39;identification. </li><li> L&#39;analyse des données extraites: Les tailles de chaque colonie détectée est mesurée en fonction du temps. Pour extraire la distribution de l&#39;apparence des colonies utiliser les fonctions suivantes dans la fenêtre de commande de Matlab (des informations complémentaires sont disponibles dans le manuel du logiciel): <ol><li> Exécutez ScanLagApp pour afficher l&#39;analyse d&#39;un certain côté boîte de Pétri avec le graphique des colonies dimensionner en fonction du temps (figure 4). <ol><li> Utilisez le curseur pour modifier l&#39;heure de la plaque. Le moment est également indiquée par une ligne verticale correspondant sur le graphique de la zone de colonies. </li><li> Cliquez sur une colonie de voir sa courbe associée, et vice versa, cliquez sur une courbe de trouver sa colonie associé. Après identification de la colonie, le phénotype peut être récupéré par la cueillette de la colonie de la boîte de Pétri identifié. </li><li> Filtrer les défauts de l&#39;analyse automatique par choochanter une colonie et en cliquant sur le bouton exclure. En cliquant exclure le numéro de la colonie devient jaune. </li></ol></li><li> Après être passé par les résultats de l&#39;analyse de chaque plaque, résumer les résultats: <ol><li> Exécutez AddHistograms pour créer un histogramme des temps d&#39;apparence. </li><li> Exécuter plotDeathCurve pour créer une représentation de la courbe de survie de la distribution. </li><li> Exécutez GetAppearanceTimes pour obtenir le temps d&#39;apparition de toutes les colonies dans l&#39;expérience. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Méthodes microscopiques basées sur l&#39;observation directe sont souvent considérés comme la «norme d&#39;or» pour étudier le comportement de cellule unique. ScanLag, ce qui permet la mesure de la distribution des temps de latence dans les populations bactériennes, fournit des données en bon accord avec la distribution obtenue à partir de l&#39;analyse à cellule unique et permet d&#39;obtenir des statistiques beaucoup plus élevées. Plusieurs étapes critiques doivent être effectuées pour que cette méthode fonctionne bien: d&#39;abord, ne pas transiger sur la résolution du scanner, qui devrait être de 4800 x 9600 pour obtenir de bonnes images. Deuxièmement, être conscient que sans le module de gestion de l&#39;alimentation (étape 1.6), le gradient de température peut se développer sur la surface à plat et affecter la croissance. Une autre étape importante est la filtration de défauts tels que des poussières qui peuvent avoir été comptées à tort comme des colonies par le logiciel. La soustraction de fond intégré du logiciel surmonte généralement ces défauts, mais les colonies parfois «faux» ont pourfiltrer manuellement. Les principales étapes de dépannage peuvent répondre à la variation inter-plaque dans la configuration, pour plusieurs raisons: (a) Le taux de micro-organismes de la croissance est affectée par la température. Différentes conditions de température et d&#39;humidité peuvent se produire en raison de la ventilation inégale ou l&#39;emplacement de l&#39;antenne dans l&#39;incubateur. (B) L&#39;électronique du scanner peuvent chauffer et provoquer un gradient de température à travers la surface du scanner. Figure 10 montre l&#39;influence d&#39;un tel gradient thermique spatiale sur les bactéries du genre Bacillus, en même temps que les mesures de la température sur la surface de balayage avant et après mise en oeuvre du module de gestion de l&#39;alimentation (étape 1.6). A noter que ce module peut ne pas être nécessaire pour les scanners les plus récents, et si seule une partie de la surface du scanner est utilisé, la gestion d&#39;énergie peut être inutile. (C) Plaques avec différents opacité de la gélose nutritive pourrait mener à différents niveaux de détection. Figure 11 montre èmee pour la tolérance aux différents volumes de gélose nutritive qui se traduisent par des opacités différentes. Expérimentalement la technique de ScanLag est facile à réaliser et ne nécessite que la plaque de micro-organismes sur des boîtes de Pétri standard et pour les placer sur la surface de l&#39;analyseur. Le logiciel qui a été développé commande l&#39;ensemble de la procédure. L&#39;acquisition des images se fait automatiquement, et l&#39;analyse d&#39;image pour le suivi des colonies est également automatique. En outre, le système peut être adapté en place pour mesurer de nombreuses conditions différentes en même temps. Enfin, la méthode repose sur les scanners de bureaux commerciaux et, par conséquent, est à faible coût. Cette technique peut être étendue à l&#39;étude des micro-organismes qui sont différentes de E. coli K-12, mais plusieurs considérations doivent être faits. Tout d&#39;abord, l&#39;influence des premières colonies apparaissant sur ​​les plus tardives doit être évaluée, comme décrit en détail dans une publication précédente 7. Pour E. Coli K-12, l&#39;densité maximale de UFC par plaque est de 200. D&#39;autres souches de différentes tailles de colonies, et d&#39;autres possible diaphonie entre les colonies, pourrait exiger une densité différente. Deuxièmement, l&#39;analyse des plaques est calibré à des seuils de logiciels basés spécifiques qui pourraient avoir besoin d&#39;être modifié, en fonction du contraste entre le support solide et les colonies. Le logiciel peut aussi être étendue pour extraire d&#39;autres caractéristiques de la colonie, au-delà de retard et le taux de croissance. Le code de logiciel est ouvert et peut être modifiée pour en extraire la forme de colonies, la luminosité, la couleur et la douceur. Parce que les mesures sont faites sur les colonies qui proviennent de cellules individuelles, les données révèlent de nouveaux phénotypes qui ne peuvent pas être mesurés par des mesures au niveau de la population. L&#39;importance de la distribution des temps de latence est révélé en présence d&#39;antibiotiques. Beaucoup d&#39;antibiotiques sont connus pour être efficaces seulement contre les cellules en croissance; Par conséquent, tant que les cellules restent dans la phase de latence et ne se développent pas, elles sont proprotégés contre les effets de ces antibiotiques 21. Lorsque le nombre de bactéries survivant sont évaluées à des intervalles de temps au cours du traitement antibiotique 15,22,23, une sous-population de bactéries, appelé persistants, est souvent révélée. Dans certains cas, l&#39;immunité à un traitement antibiotique prolongé provient du décalage. En utilisant cette configuration, ce retard est révélé et a souvent une distribution non-trivial 24 (figure 6). Ce procédé permet également la récupération de mutants rares. Par exemple, après le placage d&#39;une population ayant subi une mutagenèse, les mutants peuvent être identifiés en se basant sur le phénotype et isolés directement, sans sélection. La configuration peut également surveiller les interactions cellule-cellule en mesurant la croissance des colonies en fonction de la densité des colonies voisines et de quantifier les phénomènes tels que la détection de quorum ou la propagation des bactéries essaimage. Informations multidimensionnelles découvert par les expériences futures en utilisant cette méthode mènera à une meilleure caractérisation de la population microbiennes et aux progrès de la recherche médicale et de l&#39;environnement.

Les bactéries ont évolué pour répondre à de nombreuses conditions stressantes. Une caractéristique générale de l&#39;adaptation au stress est un changement dans la dynamique de croissance de 1,2. dynamique de croissance se caractérisent essentiellement par deux paramètres: le taux de croissance exponentielle et le temps de latence, à savoir le temps nécessaire pour s&#39;adapter aux nouvelles conditions. Attendu qu&#39;un grand nombre de méthodes à haut débit se concentrer sur des mesures de la vitesse de croissance, le temps de latence est souvent un paramètre vis à vis, bien qu&#39;il soit le paramètre essentiel pour la caractérisation de l&#39;adaptation à des conditions nouvelles. Quantification de l&#39;adaptation aux conditions changeantes a toujours été effectuée en utilisant des méthodes manuelles laborieuses 3,4. Plus récemment, des techniques de pointe ont été mis au point pour l&#39;analyse de cellules uniques 5,6. Cependant, il est encore difficile de faire la distinction croissance normale suite à un retard de croissance (à savoir un temps de retard) à partir de 2,3 croissance lente. Procédé automatisé a été construit, ScanLag 7, àla distinction entre ces deux phénotypes similaires. Un exemple frappant de l&#39;importance de l&#39;étude de la distribution des temps de latence est révélé sous traitement antibiotique. Antibiotiques et d&#39;autres contraintes Beaucoup tuer les cellules en croissance active seulement, et, par conséquent, les cellules qui sont &quot;en&quot; sont protégés 8. Pour surveiller le temps de latence, on peut observer des cellules individuelles sous un microscope et de surveiller le temps de première division. Un inconvénient majeur de cette méthode est que l&#39;intervalle de temps dynamique est limité; les cellules qui se développent au début couvrent la surface à une vitesse exponentielle, ce qui diminue efficacement la croissance des cellules avec un plus long temps de latence. L&#39;utilisation de chambres d&#39;écoulement contourne quelque peu cette 5, mais un nombre limité de cellules peut être suivi et la fraction des bactéries qui sortent de la phase de latence après que la majorité de la population a commencé à croître ne peut être observée. En dépit de ces limitations, plusieurs études ont évalué l&#39;influence du niveau de différentes insiste sur la distribution du temps de retard en utilisant la microscopie de cellules isolées 9-12. Une autre façon de surveiller la distribution des temps de latence se fait par des mesures de turbidité 13,14. Beaucoup de cultures parallèles, chacun a commencé à partir d&#39;une seule cellule, sont cultivées dans un lecteur de densité optique qui mesure le nombre de bactéries dans la culture au fil du temps. Cette méthode est limitée par la précision de l&#39;extrapolation et pour le nombre de puits dans une plaque. Procédé automatisé a été développé, appelé ScanLag, qui permet des temps de retard et les distributions des temps de croissance doit être évaluée, même pour le petit pourcentage de bactéries dans une population et ayant des temps de latence très long. La méthode est basée sur la détection de colonies sur des plaques de gélose nutritive classiques 15 (figure 1). Pour automatiser la détection 16,17 une gamme de scanners commerciaux 18 qui sont dirigés par des logiciels maison pour acquérir périodiquement des images des plaques, a été conçu. Logiciel a étéconçu pour analyser automatiquement les images et extraire des paramètres quantitatifs 19,20, telles que le temps d&#39;apparition de chaque temps de chaque colonie, qui est défini ici comme le temps de se développer à partir de 20 pixels à 80 pixels et la croissance des colonies. Ici, nous présentons le procédé en détail, y compris la configuration du système et l&#39;utilisation du logiciel automatisé d&#39;analyse d&#39;image qui a été amélioré avec une meilleure interface utilisateur. Cette méthode peut être adaptée pour mesurer d&#39;autres caractéristiques des colonies, tels que la morphologie et la couleur. La mesure de ces types de paramètres permet l&#39;utilisation du système dans phénomique multidimensionnels. Comme la méthode détecte colonies de cellules individuelles, le système peut révéler de nouveaux phénotypes qui ne peuvent être mesurés par des mesures au niveau de la population. La technique permet la détection et la récupération des variantes rares, et facilite le dépistage des caractéristiques souhaitées.

<table><tbody><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB bouillon</td><td>BD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 90 mm</td><td>Miniplast</td><td>20090-01</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection v37</td><td>Epson</td><td>B11B207201</td><td>Scanner à plat avec résolution optique : 4 800 dpi, résolution matérielle : 4 800 x 9 600 ppp, profondeur de couleur 48 bits.</td></tr><tr><td>Epson Perfection v200</td><td>Epson</td><td>B11B188011</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 3490</td><td>Epson</td><td>B11B177011</td><td></td></tr><tr><td>ADU200 Relais USB</td><td>ONTRAK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morceaux de feutre noir stérile</td><td>Fabrication</td><td></td> sur mesure <td>Environ 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Porte-plaques blanches</td><td>Fabrication</td><td></td> sur mesure <td>Taille de surface, avec trou</td></tr> <tr><td>de 6 x 99 mm de diamètreAnneaux Delerin de la taille de la boîte de Pétri</td><td>Fait</td><td></td> sur mesure <td>Diamètre intérieur : 72 mm Diamètre extérieur : 86 mm Diamètre extérieur supérieur : 90 mm</td></tr></tbody></table>

scanlag: haut débit quantification de colony croissance et décalage

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

La dynamique de croissance est une caractéristique fondamentale des micro-organismes. La quantification précise de la croissance est un objectif important en microbiologie. La dynamique de croissance est affectée à la fois par le temps de doublement du micro-organisme et par tout retard de croissance lors du transfert d’une condition à une autre, le décalage. La méthode ScanLag permet de caractériser ces deux propriétés indépendantes au niveau des colonies issues chacune d’une seule cellule, générant une distribution bidimensionnelle du temps de latence et du temps de croissance. Dans ScanLag, la mesure du temps nécessaire à la détection des colonies sur des plaques de gélose nutritive conventionnelles est automatisée sur une gamme de scanners commerciaux contrôlés par une application interne. Des boîtes de Pétri sont placées sur les scanners et l’application acquiert des images périodiquement. L’analyse automatisée de la croissance des colonies est ensuite effectuée par une application qui renvoie le temps d’apparition et le taux de croissance de chaque colonie. D’autres paramètres, tels que la forme, la texture et la couleur de la colonie, peuvent être extraits pour la cartographie multidimensionnelle de sous-populations de cellules. Enfin, la méthode permet de récupérer des variants rares avec des phénotypes de croissance spécifiques pour une caractérisation plus approfondie. La technique pourrait être appliquée en bactériologie pour l’identification des longs retards qui peuvent entraîner la persistance des antibiotiques, ainsi qu’une technique générale à faible coût pour les criblages phénotypiques.

A titre d&#39;exemple d&#39;extraction de distribution de temps de latence, la figure 5 montre la capacité de ScanLag pour identifier et suivre chaque colonie avec des caractéristiques spécifiques sur une plaque avec le temps, comme on le ferait dans un essai de criblage. Lorsque la culture du micro-organisme est hétérogène, les différentes sous-populations peuvent se révéler lors de l&#39;essai. Par exemple, la figure 6 représente la quantification de l&#39;apparence et révèle la distribution des temps de latence bimodale dans une souche mutante de E. ainsi coli. Le taux de croissance des cellules influence le temps de l&#39;apparence de la colonie. Lorsque les colonies se développent à la même vitesse, l&#39;apparition tardive peut être attribuée à la durée de retard (Figure 7). Pour valider la méthode en effet de mesurer le temps de retard de cellules individuelles, on a comparé les résultats de la ScanLag avec ceux obtenus en utilisant la microscopie à cellule unique; cette validation est described en détail dans une publication précédente 7. Cette méthode permet de surveiller beaucoup plus de cellules que peut être évaluée par microscopie. Les distributions obtenues en utilisant la microscopie et obtenu à l&#39;aide ScanLag chevauchent largement. La distribution de ScanLag est légèrement plus large; Des analyses théoriques prévoient l&#39;élargissement à être de l&#39;ordre de l&#39;écart type du temps de division. Si le temps de croissance est différente pour chaque souche, l&#39;origine du retard dans l&#39;apparence doit être examinée plus en utilisant d&#39;autres méthodes. L&#39;influence des premières colonies apparaissant sur-l&#39;apparition de colonies a été examiné plus tard. Des expériences de contrôle ont confirmé que sept apparence n&#39;a pas été affectée par la suite, tant que le nombre total de colonies par plaque ne dépasse pas 200 (figure 8). Une autre expérience de contrôle a confirmé que l&#39;emplacement de la colonie sur la plaque n&#39;affectait pas son temps d&#39;apparition 7. L&#39;analyse de la pLates est calibré pour des seuils spécifiques qui pourraient avoir besoin de modification en fonction de nutriments présents dans le milieu de croissance ou du type de micro-organisme. Néanmoins, l&#39;analyse est assez robuste pour une grande gamme de seuils conformément à la figure 9. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Un schéma des étapes nécessaires pour créer une distribution de l&#39;apparence de la colonie. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Une capture d&#39;écran du gestionnaire de périphériques indiquant les noms des scanneurs connectés, et du fichier de configuration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande</a>version de ce chiffre. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Une capture d&#39;écran du gestionnaire de numérisation. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Une capture d&#39;écran de la ScanLagApp. Une image de la plaque est le volet de gauche, et les courbes de chaque colonie de croissance sont sur ​​le volet de droite, comme indiqué dans le manuel. Les pointes dans certaines des courbes de la zone des colonies se produisent lorsque deux ou plusieurs colonies se confondent. Lors de la fusion des colonies se produit, la surface de ces colonies est considérée comme la zone du joint. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. Un résultat représentatif de l&#39;analyse d&#39;une plaque (A). Une image de la sortie de l&#39;application de la détection à la fin de l&#39;expérience. Chaque zone de colonie est identifié, et de couleur assignée à un numéro d&#39;identification unique. Les flèches indiquent les colonies représentatives mesurées dans B. La colonie est détecté sur la base seuil d&#39;intensité (Pour colonies de E. coli sur gélose LB ou gélose M9 ce seuil est de 0,03. Pour les autres médias ou des bactéries, ce seuil peut être réglé dans les ProcessPictures de fonction ). Seuls les objets de plus de 10 pixels sont comptés (ce seuil peut être modifié dans les MatchColonies de fonction). Détection d&#39;une colonie commence à environ 10 5 bactéries. (B) Terrains de la zone en pixels par rapport au temps de quatre colonies représentatives de cette plaque. Le «temps d&#39;apparition» de chaque colonie, c&#39;est quand la colonie est détecté. Le «temps de croissance» de chaque colonie est défini ici comme le temps de grandir vientm 20 pixels à 80 pixels (ces limites sont réglables à l&#39;aide de la fonction getAppearanceGrowthByVec). Le logiciel exclut les colonies qui ont fusionné avant d&#39;atteindre la limite supérieure. Identification d&#39;une colonie spécifique en fonction de ses caractéristiques est facile grâce à la numéro d&#39;identification et la couleur attribuée à chaque colonie. Par exemple les colonies n ° 1, 56, 77 et 124 sont mises en évidence dans les deux graphiques. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6. Aspect quantification peut révéler la distribution des temps de latence bimodale. Comparaison des histogrammes de l&#39;analyse de ScanLag des temps d&#39;apparition pour les deux souches différentes. Ligne bleue: souche de type sauvage en croissance exponentielle (Total: 1320 colonies); rouge mutant de persistance ligne à grande enrichi avec des bactéries en retard (au total: 1 529 colonies). (A) des histogrammes d&#39;apparence normalisés. Le picd&#39;apparition de cellules en croissance exponentielle est le temps typique de croître à une colonie détectable. Encart: même histogramme de la souche mutante après soustraction de la durée du pic de la culture exponentielle pour obtenir le temps de retard réel sur les bacs de journaux interligne montrant la distribution des temps de latence bimodale. (B) Fonction de survie des mêmes données que dans (A) sur une échelle logarithmique. Cette représentation améliore l&#39;aspect de la fin de la queue de la souche mutante. <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Répartition Figure 7. Aspect et distribution du temps de croissance. (A) et (B) montrent deux histogrammes dimensionnelles du temps d&#39;apparition et la durée des deux conditions différentes (Le logiciel exclut les colonies qui ont fusionné avant d&#39;atteindre la limite supérieure) de croissance. (C) comparaison des histogrammesdes deux souches montrent la différence de temps d&#39;apparition, tandis que les temps de croissance (D) sont similaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Figure 8. L&#39;apparition des premières colonies n&#39;interfère pas avec l&#39;apparition de colonies ultérieures. (A) traîne la distribution temporelle des cellules de type sauvage plaquées seul. (B) la distribution des temps de retard d&#39;une souche sensible au froid seul, après transfert à la température permissive. (C) lag distribution de temps de deux souches plaqués ensemble dans les mêmes conditions. La ligne noire représente la distribution attendue sur la base des données obtenues lors de la mesure de chaque souche séparée. Un boncco rd entre les distributions attendues et mesurées est obtenue à condition que le nombre total de colonies par plaque est inférieur à 200. <img alt="Figure 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Figure 9, le seuil de détection n&#39;affecte pas la forme de la distribution de l&#39;apparition de colonies La distribution de l&#39;apparence de la colonie a été analysé pour le même ensemble de données à l&#39;aide de deux tailles différentes de seuil; (A) taille de seuil est de 10 pixels; (B) la taille de seuil est de 50 pixels. Nombre de cellules par histogramme: env. 1500. Le seuil de détection différent en résulte que dans un décalage de la durée de détection. <img alt="Figure 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Figure 10. Température mesures de stabilité across surface de scanner. (A) l&#39;image d&#39;une plaque avec des colonies de Bacillus subtilis cultivés sur le scanner sans gestion de l&#39;alimentation. La surface est plus chaud sur la partie inférieure et par conséquent, les colonies se développent plus rapidement. La ligne progressive à côté de la plaque est une représentation schématique du gradient thermique. (B) La stabilité thermique a été mesurée à l&#39;aide de deux thermocouples placés sur la surface de l&#39;analyseur. Le scanner chauffe pendant chaque balayage et dans le temps. (C) avec gestion de l&#39;alimentation, la température est uniforme et les colonies croître à des taux similaires. (D) Identique à (B) avec le module de gestion de l&#39;alimentation. stabilité de température de ± 0,2 ° C. <img alt="Figure 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Figure 11. Différences dans la répartition de l&#39;aspect peuvent être dus à differences dans les volumes de milieu solide. La même culture bactérienne a été étalée sur des plaques avec différents volumes de la gélose LB, qui donne une hauteur différente de la surface de la gélose. Les différentes hauteurs différentes ont conduit à l&#39;opacité des plaques, et donc un temps de détection différent. La différence entre les plaques a été vérifiée et la différence entre les différentes conditions de hauteur. (A) les différences typiques entre les plaques de volumes égaux de 30 ± 0,5 ml de gélose LB. (B) Différence entre les différentes conditions de taille: la distribution de l&#39;apparence a été mesurée pour les plaques avec des volumes de 20 ± 0,5 ml (rouge), de 30 ± 0,5 ml (vert) et de 40 ± 0,5 ml (bleu). Chaque condition est la moyenne des six plaques différentes. Tant que le volume des plaques se situe dans une plage de ± 5 ml, l&#39;opacité est semblable et conduit à une distribution de temps d&#39;apparition similaire.

ScanLag est une méthode à haut débit pour mesurer le retard de croissance, à savoir le temps de latence, ainsi que le taux de croissance des colonies pour des milliers de cellules en parallèle. Le dépistage à l’aide de ScanLag permet de distinguer les temps de latence longs et les croissances lentes au niveau d’un seul variant.

ScanLag: haut débit Quantification de Colony croissance et décalage

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier la distribution du temps de latence d'une culture bactérienne afin de permettre la discrimination entre un temps de latence long et une croissance lente au niveau d'un variant unique. Ceci est réalisé en premier lieu en mettant en place un dispositif composé d'un réseau de scanners identifiés par un seul ordinateur. La deuxième étape consiste à déposer une unité formant colonie définie de culture bactérienne sur des boîtes de Petri contenant un agar nutritif classique.Ensuite, les boîtes sont placées dans des supports conçus sur les scanners et des images en prise de vue instantanée des colonies sont prises à l’aide des scanners. La dernière étape consiste à effectuer l’analyse d’image à l’aide du logiciel scan lag, qui analyse automatiquement les images et extrait des paramètres quantitatifs tels que le moment d’apparition de chaque colonie et le temps de croissance de chaque colonie. Enfin, des fonctions MATLAB sont utilisées pour générer l’histogramme de décalage à partir de ces données.Les implications de cette technique s'étendent au diagnostic des infections persistantes, car elle permet la détection de variants lents. Pour commencer, choisissez un scanner à plat doté d'une résolution optique de 4 800 DPI, d'une résolution matérielle de 4 800 par 9 600 DPI et d'une profondeur de couleur de 48 bits, capable de fonctionner aux niveaux de température et d'humidité appropriés. Sélectionnez un scanner permettant de connecter plusieurs appareils à l'ordinateur et de les identifier individuellement.Contrairement aux autres supports, les boîtes de Pétri possèdent un volume important. Contrairement au papier, généralement utilisé dans les scanners commerciaux, les colonies se trouvent au-dessus de la couche d'agar, à environ cinq millimètres au-dessus de la surface du scanner. Pour la plupart des scanners, les colonies seront donc nettes.Préparer des morceaux de tissu en feutre noir stérile pour couvrir les plaques afin de maintenir les boîtes de Pétri en place. Préparer des supports blancs pour plaques adaptés aux scanners et comportant six trous de la même taille que les boîtes, si nécessaire pour la croissance de l'organisme microbien. Placer les scanners dans un environnement à température contrôlée.Connectez les scanners à l'ordinateur pour installer le gestionnaire de numérisation. Copiez tous les fichiers d'application du gestionnaire de numérisation dans un répertoire désigné depuis le site web du scan lag. Utilisez un ordinateur doté d'un système d'exploitation Windows XP et assurez-vous que microsoft.La version 2.0 du framework .NET est installée. En attente. Recherchez les noms des scanners dans le gestionnaire de périphériques du gestionnaire de l'ordinateur, sous Périphériques d'imagerie. Ensuite, configurez le fichier de configuration du gestionnaire de numérisation selon ces noms.Pour réaliser une expérience, diluez d'abord la culture à environ 2000 UFC par millilitre. Ensuite, déposez uniformément 0,1 millilitre de culture sur des boîtes de Pétri préparées avec de l'agar nutritif classique. Puis recouvrez la boîte d'un morceau de tissu en feutre noir stérile afin d'obtenir un bon contraste entre les colonies et la boîte, et pour absorber l'humidité.Mettez le couvercle sur la plaque et placez les plaques dans les supports des scanners. Lancez le gestionnaire de numérisation. Sélectionnez les scanners participants dans la liste des scanners connectés.Ensuite, choisissez le nombre d'images à acquérir, l'intervalle de temps entre les images successives et le délai avant le début de l'expérience pour l'analyse d'images. Triez d'abord les images provenant de chaque scanner dans des dossiers séparés à l'aide de la fenêtre de commande de MATLAB. Exécutez d'abord « prepare images » pour effectuer le prétraitement.Lors du prétraitement, les images provenant d'un scanner sont alignées. Chaque boîte de Pétri est découpée à partir de chaque séquence d'images. Le moment auquel chaque image a été capturée est extrait à partir du timestamp de l'expérience.Chronométrage de toutes les plaques afin d'effectuer la détection et le suivi : les colonies sont détectées dans chaque boîte de Pétri et se voient attribuer un numéro d'identification. La taille de chaque colonie détectée est mesurée en fonction du temps. Extraire la distribution d'apparition des colonies à l'aide de la fenêtre de commande de MATLAB.Exécutez d'abord l'application scan lag pour afficher l'analyse d'une certaine boîte de Pétri accompagnée du graphique de la taille en fonction du temps pour les colonies. Ensuite, utilisez le curseur pour modifier l'instant courant de la boîte. Ce moment sera également indiqué par une ligne verticale correspondante sur le graphique de surface des colonies.Cliquez sur une colonie pour voir sa courbe associée et vice versa. Après avoir identifié la colonie, le phénotype peut être récupéré en prélevant la colonie depuis la boîte de Petri identifiée. Filtrez les défauts dans l'analyse automatique en choisissant une colonie et en cliquant sur le bouton d'exclusion.Lorsque vous cliquez sur « exclure », le numéro de la colonie devient jaune. Après avoir passé en revue les résultats de l'analyse de chaque plaque, faites la somme des résultats. Lors du premier passage, ajoutez des histogrammes pour créer un histogramme d'apparition.Ensuite, exécutez le tracé du temps de mort pour créer une représentation de courbe de survie de la distribution. Un exemple d'extraction de distribution du temps de latence est montré ici. Le balayage du temps de latence permet d'identifier et de suivre chaque colonie présentant des caractéristiques spécifiques sur une même plaque au fil du temps, comme cela serait effectué dans un dosage de criblage.Lorsque la culture de l'organisme microbien est hétérogène, les différentes sous-populations peuvent se distinguer au cours du test. Cette figure illustre la quantification du temps d'apparition et révèle ainsi une distribution bimodale du temps de latence chez une souche mutante d’E. coli. Sont représentés ici des histogrammes bidimensionnels du temps d'apparition et du temps de croissance sous deux conditions différentes.La comparaison des histogrammes des deux souches montre une différence dans le temps d'apparition, tandis que les durées de croissance sont similaires. Lorsque les colonies croissent au même rythme, une apparition tardive peut être attribuée au temps de latence. L'influence des colonies apparaissant précocement sur l'apparition des colonies ultérieures a été examinée.On voit ici la distribution des temps de latence des cellules de type sauvage ensemencées seules, et la distribution des temps de latence d'une souche sensible au froid. Des expériences témoins d'ensemencement seul après transfert à la température permmissive ont confirmé que l'apparition retardée n'était pas affectée tant que le nombre total de colonies par boîte ne dépassait pas 200. Suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que le séquençage complet du génome ou l'analyse d'expression, peuvent être réalisées sur des colonies présentant un phénotype de croissance intéressant afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si le phénotype est génétique ou épigénétique.

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