ScanLag: haut débit Quantification de Colony croissance et décalage

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la distribution du décalage d’une culture bactérienne afin de permettre la distinction entre un temps de latence long et une croissance lente au niveau d’un seul variant. Pour ce faire, il faut d’abord configurer un ensemble de scanners identifiés par un seul ordinateur. La deuxième étape consiste à appliquer une unité de formation de colonie définie à la culture bactérienne sur des boîtes de Pétri contenant de la gélose nutritive conventionnelle.

Ensuite, les paraboles sont placées dans des supports conçus sur les scanners et des images en accéléré des colonies sont prises avec les scanners. La dernière étape consiste à exécuter l’analyse d’image à l’aide du logiciel de décalage de balayage, qui analyse automatiquement les images et extrait des paramètres quantitatifs tels que le moment de l’apparition de chaque colonie et le temps de croissance de chaque colonie. En fin de compte, les fonctions MATLAB sont utilisées pour générer l’histogramme de décalage à partir de ces données.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des infections persistantes car elle permet de détecter des variants lents. Pour commencer, choisissez un scanner à plat avec une résolution optique de 4, 800 DPI, une résolution matérielle de 4, 800 par 9, 600 DPI et une profondeur de couleur de 48 bits qui peut fonctionner aux niveaux de température et d’humidité appropriés. Choisissez un scanner qui permet de connecter plusieurs scanners à l’ordinateur et de les identifier.

De manière unique, les boîtes de Pétri ont un volume important. Contrairement au papier, qui est généralement utilisé dans les scanners commerciaux, les colonies se trouvent au-dessus de la couche de gélose à environ cinq millimètres au-dessus de la surface du scanner. Pour la plupart des scanners, les colonies seront au centre de l’attention.

Préparez des morceaux de feutre noir stérile pour couvrir les plaques afin de maintenir les boîtes de Pétri en place. Préparez des supports de plaques blancs qui s’adaptent aux scanners et qui ont six trous de la taille des plats si nécessaire pour la croissance du micro-organisme. Placez les scanners dans un environnement à température contrôlée.

Connectez les scanners à l’ordinateur pour installer le gestionnaire de numérisation. Copiez tous les fichiers de l’application du gestionnaire d’analyse dans un répertoire désigné à partir du site Web de décalage d’analyse. Utilisez un ordinateur doté d’un système d’exploitation Windows XP et assurez-vous que microsoft.

Net Framework version 2.0 est installé. Bloqué. Recherchez les noms des scanners dans les périphériques de gestion d’ordinateur du gestionnaire de périphériques. Configurez ensuite le fichier de configuration du gestionnaire d’analyse en fonction de ces noms.

Pour réaliser une expérience, il faut d’abord diluer la culture à environ 2000 UFC par millilitre. Ensuite, versez 0,1 millilitre de culture uniformément sur des boîtes de Pétri préparées avec de l’agar nutritif conventionnel. Couvrez ensuite la plaque d’un morceau de feutre noir stérile pour obtenir un bon contraste entre les colonies et le plat, et pour absorber l’humidité.

Placez le couvercle sur la plaque et placez les plaques dans les supports des scanners. Pour démarrer le gestionnaire d’analyse. Choisissez les scanners participants dans la liste des scanners connectés.

Choisissez ensuite le nombre d’images à prendre, l’intervalle de temps entre les images suivantes et le délai avant de commencer l’expérience pour l’analyse d’images. Tout d’abord, triez les images de chaque scanner dans des dossiers distincts à l’aide de la fenêtre de commande de MATLAB. Préparez d’abord les images pour effectuer le prétraitement.

Lors du prétraitement, les images d’un scanner sont alignées. Chaque boîte de Pétri est recadrée à partir de chaque séquence d’images. L’heure à laquelle chaque image a été collectée est récupérée à partir de l’exécution de l’horodatage.

Le laps de temps nécessaire à toutes les plaques pour effectuer la détection et le suivi des colonies est détecté dans chaque boîte de Pétri et un numéro d’identification lui est attribué. Les tailles de chaque colonie détectée sont mesurées en fonction du temps. Extrayez la distribution d’apparence des colonies à l’aide de la fenêtre de commande de MATLAB.

Exécutez d’abord l’application de décalage de balayage pour afficher l’analyse d’une certaine boîte de Pétri avec le graphique de la taille en fonction du temps pour les colonies. Utilisez ensuite le curseur pour changer l’heure actuelle de la plaque. Le moment sera également indiqué par une ligne verticale correspondante sur le graphique en aires des colonies.

Cliquez sur une colonie pour voir sa courbe associée et vice versa. Après avoir identifié la colonie, le phénotype peut être récupéré en sélectionnant la colonie dans la boîte de Pétri identifiée. Filtrez les défauts dans l’analyse automatique en choisissant une colonie et en cliquant sur le bouton Exclure.

En cliquant sur exclure, le numéro de la colonie deviendra jaune. Après avoir parcouru les résultats de l’analyse de chaque plaque, résumez les résultats. Première exécution, ajoutez des histogrammes pour créer un histogramme d’apparence.

Les temps tracent ensuite la courbe de mort pour créer une représentation de la courbe de survie de la distribution. Un exemple d’extrait de distribution de temps de latence est présenté ici. Le décalage de balayage permet d’identifier et de suivre chaque colonie présentant des caractéristiques spécifiques sur une seule plaque au fil du temps, comme on le ferait dans un essai de dépistage.

Lorsque la culture du micro-organisme est hétérogène, les différentes sous-populations peuvent se révéler au cours de l’essai. Cette figure montre la quantification de l’apparence et révèle ainsi la distribution bimodale du temps de latence dans une souche mutante d’e coli. Voici des histogrammes bidimensionnels du temps d’apparition et du temps de croissance de deux conditions différentes.

La comparaison des histogrammes des deux souches montre la différence de temps d’apparition, alors que les temps de croissance sont similaires. Lorsque les colonies se développent au même rythme, l’apparition tardive peut être attribuée au temps de latence. L’influence des colonies précoces sur l’apparence des colonies ultérieures a été examinée.

On voit ici la distribution du temps de latence des cellules de type sauvage, plaquées seules, et la distribution du temps de latence d’une souche sensible au froid. Mis seul après transfert à des expériences de contrôle de température permissif ont confirmé que l’apparence ultérieure n’était pas affectée tant que le nombre total de colonies par plaque ne dépassait pas 200. En suivant cette procédure.

D’autres méthodes, comme le séquençage du génome entier ou l’analyse de l’expression, peuvent être effectuées sur des colonies avec un phénotype de croissance intéressant afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le caractère génétique ou épigénétique.