Name: Imagerie confocale de clos de repos et Flowing mélanges colloïdes-polymères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez comment la microscopie confocale quantifie les changements de comportement de phase et les propriétés de transport des suspensions colloïdales attractives confinées. Cette méthode révèle la solidification et l'écoulement non newtonien.

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Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l&#39;Université de Houston New Faculté Grant, une subvention de démarrage du Centre du Texas pour la supraconductivité, et le Fonds de recherche de l&#39;American Petroleum Chemical Society (52537-DNI).

1. Préparation des mélanges colloïdes-polymères Remarque: Ce protocole utilise le poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA), des particules, stabilisées stériquement à l&#39;aide de poly (acide 12-hydroxystéarique) et marqué avec un colorant fluorescent (comme Nile Red, la rhodamine B, ou la fluorescéine), qui ont été synthétisé en suivant une norme recette 52. <ol><li> Préparer un w / w mélange de bromure de cyclohexyle (CXB) et décahydronaphtalène (DHN) comme solvant d&#39;actions 03h01. Ce mélange correspond à peu près la densité et l&#39;indice de réfraction des particules. Ajouter un sel organique, le chlorure de tétrabutylammonium (TBAC) 46, pour le solvant à une concentration de 1,5 mM pour cribler partiellement les charges sur les particules. </li><li> Pour déterminer avec précision la densité des particules, préparer une suspension à une fraction approximative du volume de particules Φ = 0,10 dans le CXB: solvant DHN. Centrifuger la suspension à 800 g pendant 75 min et ajouter CXB ou DHN goutte à goutte à améliorer la flottabilitél&#39;appariement. Dans ces expériences, la densité des particules de PMMA a été mesurée à ρ = 1,223 g / ml. </li><li> Préparer une suspension de concentré de particules de PMMA (ici, Φ = 0,40) dans le CXB: DHN mélange de solvants. </li><li> Préparer une solution concentrée de polystyrène linéaire (PS) dans la CXB: DHN mélange de solvants. Ici, une solution de PS de masse moléculaire M w ≈ 3000000 (rayon de giration r g = 15 nm) est préparé à la concentration c p ≈ 50 mg / ml. </li><li> Mélanger les poids appropriés de la particule, polymère, et mélanges de solvant d&#39;actions de formuler des suspensions aux concentrations désirées de particules et de polymères. Remarque: ici, des suspensions de particules monodispersées sont préparées à une fraction constante du volume de colloïde Φ = 0,15 et la concentration en polymère variable dans le volume libre 53 c p = 0 à 25 mg / ml, et les suspensions contenant deux tailles différentes de particules colloïdales bidispersed, wrâce à chaque taille portant un marqueur fluorescent distinct, sont préparés à une fraction totale fixe du volume de colloïde Φ = 0,15, rapport volumique de fraction de petites particules r = 0,50, et la concentration de polymère dans le volume libre de 5 ou 25 mg / ml. </li><li> Après chaque suspension est préparée, ajouter CXB ou DHN goutte à goutte et centrifuger les échantillons à 800 g pendant au moins 75 min pour confirmer que les particules et les clusters dans la suspension restent flottabilité identifié. </li><li> Tous les échantillons s&#39;équilibrer pendant au moins 24 heures avant des expériences d&#39;imagerie. </li></ol> . 2 exemples expériences quiescentes: Phase comportement <ol><li> Pour déterminer le comportement de phase en vrac, fabriquer chambres rectangulaires de lamelles de verre (figure 1a). Pour les mélanges colloïdes polymères dans cette étude, les chambres de l&#39;épaisseur h = 1 mm (fixé par l&#39;épaisseur d&#39;une lame de microscope) donnent le comportement en vrac. </li><li> Pour accéder à plusieurs accouchements dans une expérience de microscopie unique, fabriquer mince coinchambres en forme, à l&#39;aide d&#39;une seule lamelle couvre-objet comme un élément d&#39;espacement sur ​​une cale (figure 1b). L&#39;angle de la chambre d&#39;ouverture est &lt;0,5 °, de sorte que dans un seul champ de vision, les murs sont à peu près parallèles. Une chambre représentant permet d&#39;accéder à des épaisseurs de confinement de h = 6 à&gt; 100 um. </li><li> Construire des enceintes sur une base de lamelle couvre-objet pour une imagerie sur un microscope inversé et sceller avec époxy durcissant aux UV, qui ne se dissout pas dans le mélange solvant-CXB DHN. </li><li> échantillons de l&#39;image à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Ce protocole démontre l&#39;imagerie confocale d&#39;une ligne de balayage fixée à un microscope inversé équipé d&#39;un objectif 100X à immersion dans l&#39;huile de l&#39;ouverture numérique NA = 1,40. </li><li> Exciter les colorants à l&#39;aide d&#39;une source laser. Voici les longueurs d&#39;onde λ = 491 nm ou 561 sont utilisés pour exciter la fluorescéine et la rhodamine colorants / Nil rouge, respectivement. </li><li> Dans le système de point de balayage, de générer une image en balayant rapidement le point focal à travers l&#39;échantillon (dans le x-y plane) en utilisant le logiciel confocal. Une image en deux dimensions de 512 pixels x 512 pixels, couvrant environ 50 um x 50 um, peuvent être acquises en 1/32 sec. Améliorer la qualité de l&#39;image en faisant la moyenne de plusieurs images ou d&#39;augmenter le temps d&#39;acquisition. </li><li> Localiser le fond de la chambre (z = 0), par exemple en mettant l&#39;accent sur les particules adhérant à sa partie inférieure. Dans cette configuration, la hauteur (z) augmente avec la mise au point dans la chambre. </li><li> A titre d&#39;exemple, de caractériser l&#39;effet de confinement sur la dynamique des particules par l&#39;acquisition d&#39;une série temporelle de 2-D des images (dans le plan xy) dans le plan médian de la chambre. Dans une expérience typique, 500 images de la dimension 512 pixels x 512 pixels sont acquises à une cadence de 1 image / s (temps d&#39;espacement At = 1 s). </li><li> Comme deuxième exemple, de caractériser la structure 3-D des particules en acquérant une série tridimensionnelle d&#39;images (x, y, z). Dans une expérience typique, des images bidimensionnelles (512 pixels x 512 pixels) sontacquis à plusieurs positions z dans la chambre, avec un espacement constant de Az = 0,2 um entre les images consécutives fixées par un piézo. Une pile de volume couvrant une épaisseur h = 30 um contient donc 151 images. </li><li> Recherchez et particules de piste dans le temps de 2-D ou 3-D à l&#39;aide de logiciels de traces de particules écrite en IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, ou Python 60. Ces algorithmes permettent généralement les centres des particules à être résolues dans les 40-50 nm. Suivi des particules réussie nécessite que les particules se déplacent inférieure à l&#39;espacement interparticulaire entre les trames consécutives. </li><li> De la position des particules, calculer des métriques structurelles et dynamiques. Trois mesures pratiques présentées ici sont la fonction de corrélation de paires 3-D g (r) 61, le déplacement quadratique moyenne 2-D (MSD) 58,62, et l&#39;auto-partie 2 D de la fonction de corrélation van Hove G s ( x, t) 58. Les deux derniers paramètres peuvent également être calculées en 3-D. </li></ol> . 3 expériences Flowing: propriétés d&#39;écoulement <ol><li> Fabriquer une cellule d&#39;écoulement simple à l&#39;aide d&#39;un micro-capillaire de verre à section transversale carrée (100 um x 100 um) qui est fixée à un tube de Téflon. Utilisation des lamelles de verre pour supporter le tube capillaire et une rigidité mécanique, comme le montre le schéma de la figure 7. </li><li> Chargez le mélange colloïde-polymère dans une seringue en verre. Fixer la seringue à une pompe à seringue ou d&#39;un système de distribution de fluide pneumatique. </li><li> Montez la configuration de la cellule d&#39;écoulement sur le microscope inversé. Conserver la seringue, la cellule, la sortie d&#39;écoulement et à la même hauteur afin de minimiser l&#39;effet de la gravité sur le profil d&#39;écoulement. </li><li> Contrôler la vitesse de la suspension d&#39;écoulement à travers la cellule d&#39;écoulement par le débit volumétrique d&#39;écoulement (pour la pompe à seringue) ou la pression appliquée (pour la zone de pression). La vitesse moyenne de la suspension dans les microcanaux dépend aussi de la diformulation de spension. Les valeurs typiques de la vitesse maximale dans les micro-canaux carrés sont ici mesurées 200-2000 um / sec. </li><li> Au cours de l&#39;écoulement, d&#39;acquérir une série de temps confocale 2-D à des cadences rapides. Ici, les images de dimension 500 512 pixels x 512 pixels sont acquis à 32 images / s (espacement temps Δ t = 1/32 sec) à des hauteurs différentes au-dessus du fond du micro-canal (z = 0 um) allant de z = 5 - 50 um. Chaque image couvre environ la moitié de la dimension latérale (y) du micro-canal, comme indiqué dans l&#39;encart de la Figure 7. Si les particules apparaissent elliptique, augmenter le taux d&#39;acquisition de trame. </li><li> Comme dans les expériences de repos, de localiser les particules en 2-D en utilisant des algorithmes standard pour la localisation et le suivi des particules dans IDL ou MATLAB. Pour les flux lents, dans laquelle les particules se déplacent moins que la distance interparticulaire moyenne entre les cadres, utilisent des algorithmes de suivi pour obtenir les trajectoires. </li><li> Utilisez la corrélation d&#39;images à calcouler les profils de vitesse des flux rapides. <ol><li> Subdiviser l&#39;image en des images horizontales de hauteur constante (y) le long de la direction d&#39;écoulement (x). Pour deux images séquentielles I 1 (x, y) et I 2 (x, y) passer la dernière image par un facteur Ax et ensuite calculer la covariance croisée entre I 1 (x, y) et I 2 (x + Ax, y). </li><li> Identifier la position du pic de l&#39;histogramme des valeurs Ax qui maximisent la covariance croisée entre chaque paire d&#39;images pour obtenir la vitesse d&#39;advection moyen au niveau de chaque position latérale y. Si cette distribution n&#39;est pas fortement atteint un sommet, d&#39;acquérir des images à une cadence plus rapide. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Suspensions colloïdales sont largement étudiés comme modèles de comportement de phase confinée, car les particules colloïdales de taille micronique présentent dynamique nettement plus lent que les atomes et les molécules et donc peuvent être facilement visualisés et suivis dans le temps 10. Pour ces études fondamentales, la compréhension de l&#39;effet des attractions interparticulaires sur le comportement de phase confinée offre la possibilité d&#39;explorer des phénomènes tels que la condensation capillaire...

Cet article démontre (a) l&#39;imagerie confocale de mélanges de repos et fluides confinés colloïdes polymères en deux et trois dimensions et (b) des particules suivi et analyses de corrélation des images résultantes pour obtenir des informations quantitatives sur le comportement de phase et propriétés d&#39;écoulement. Suspensions colloïdales avec les interactions entre particules intéressantes apparaissent de façon ubiquitaire dans les applications technologiques comme matériaux pour l&#39;assemblage dirigé 1-3, l&#39;administration de médicaments 4, l&#39;amélioration de 5-7 de récupération des hydrocarbures, et le stockage d&#39;énergie 8. Une caractéristique commune de ces applications est que les particules doivent être sous géométries fines, tels que des buses, têtes d&#39;impression, des microcanaux ou des milieux poreux, et / ou être façonnés en couches minces ou de tiges. Les techniques utilisées pour sonder la structure des colloïdes de l&#39;ordre du micromètre dans des géométries confinées, y compris la microscopie électronique 17,18, la microscopie à rayons X 19, et diffraction laser microscopy 20, peut être utilisé pour mesurer la structure et la dynamique des particules sur l&#39;échelle microscopique. Ces techniques, cependant, ne permettent pas l&#39;accès aux trajectoires des particules individuelles, dont les paramètres structurels et dynamiques peuvent être calculées pour une comparaison directe à des simulations numériques 21,22. La microscopie confocale est une variante de la microscopie à fluorescence qui permet l&#39;imagerie des sections minces d&#39;un échantillon fluorescent. Pour la science colloïdale 10, cette technique est particulièrement utile pour l&#39;imagerie profonde dans les suspensions denses ou en trois dimensions. Des algorithmes de poursuite de particules 23 appliqués à deux ou à une série de temps tridimensionnelles de micrographies confocales produire les trajectoires de toutes les particules visibles. Par conséquent, la combinaison de la microscopie confocale et de suivi des particules a été appliquée pour étudier le comportement de phase, la structure et la dynamique des suspensions colloïdales, notamment des cristaux de 24 à 27 commandés et troubleed lunettes 28-31 et 32-35 gels. D&#39;autres algorithmes d&#39;analyse d&#39;image peuvent être appliquées pour mesurer la dynamique des particules de série de temps de micrographies confocale. Par exemple, la dynamique des particules de diffusion peuvent être étudiés en analysant les fluctuations de l&#39;intensité au fil du temps à l&#39;aide différentielle de microscopie confocale dynamique 36. Lorsque les déplacements des particules sont plus grandes que l&#39;espacement interparticulaire, la corrélation d&#39;images sur la base de 37 particules vélocimétrie par image de 38 à 40 peut être appliquée pour mesurer les profils de vitesse des particules. La combinaison d&#39;algorithmes de suivi et de corrélation a permis dynamique colloïdales qui doivent être mesurés dans des systèmes soumis à écoulement lent et rapide 11-16,41-45. Nous utilisons des mélanges colloïdes polymères comme des modèles pour les suspensions colloïdales attrayantes 9. Dans ces mélanges, la plage et la force du potentiel interparticulaire attractive sont contrôlées par le rapportdu rayon de giration de polymère pour le rayon de la particule et la concentration du polymère et la répulsion électrostatique est commandé par l&#39;intermédiaire de l&#39;addition d&#39;un sel organique monovalent 46. Etant donné que les interactions interparticulaires peuvent être réglées avec soin, la solidification de ces mélanges a été étudiée par microscopie confocale 34,47-51. Ici, nous démontrons l&#39;imagerie confocale et analyse d&#39;image 37 de mélanges colloïdes polymères de repos et fluides, dans lequel la fraction de volume de colloïde est maintenu fixé à Φ = 0,15, qui sonde l&#39;effet du confinement sur ​​le comportement de phase et les propriétés d&#39;écoulement de ces mélanges. Ces techniques sont largement applicables à des systèmes de particules qui sont en correspondance l&#39;indice de réfraction, et dans laquelle les particules et / ou de solvant peuvent être marqués avec un colorant fluorescent.

<table><tbody><tr><td>Bromure de cyclohexyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>Numéro CAS&nbsp ; 108-85-0, Poids moléculaire = 163,06, Utilisé dans le solvant de base</td></tr><tr><td>Décahydronapthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>Numéro CAS 91-17-8, Poids moléculaire = 138,25, Utilisé dans le solvant de base</td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Colorant fluorescent</td></tr><tr><td>Fluorescéine 5(6)-isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Colorant fluorescent</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Colorant fluorescent</td></tr><tr><td>Diffusion dynamique de la lumière&nbsp ;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-APD</td><td>DLS équipement utilisé pour la mesure de la taille des particules</td></tr><tr><td>Polystyrène&nbsp ;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>Polystyrène (polymère) pour induire l’attraction de l’appauvrissement</td></tr><tr><td>Tétrabutyle (chlorure d’ammonium) (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>sel monovalent</td></tr><tr><td>Adhésif UV</td><td>Norland Adhesive</td><td>NOA 68T</td><td>Numéro de pièce 68T01 (adhésif durci UV)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Scanner</td><td>confocal</td>oculaire</tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Microscope</td><td>à scanner confocal</td>à</tr><tr><td>l’infini</td><td></td><td></td><td>Leica DMI3000B Microscope inversé</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5 000 tr/min</td></tr><tr><td>Tube en téflon petites</td><td>pièces</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016 » ID x 0.003 »</td></tr><tr><td>Wall Epoxy</td><td>Devcon</td><td>DA051 5</td><td>min</td></tr><tr><td>Seringue</td> époxy <td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>seringue en verre avec luer en métal embouts de</td></tr><tr><td>seringue</td>Embouts de précision <td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Système de pompe New Era Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Pompe microfluidique programmable (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Balance pesée</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0.0001-220 g particules</td></tr> de <tr><td>PMMA</td><td>synthétisées</td><td></td><td>en poly(méthacrylate) colloïdal</td></tr></tbody></table>

imagerie confocale de clos de repos et flowing mélanges colloïdes-polymères

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

Le comportement des suspensions colloïdales confinés avec des interactions interparticulaires attractives est essentielle à la conception rationnelle de matériaux pour l&#39;assemblage dirigé 1-3, l&#39;administration de médicaments 4, l&#39;amélioration de la récupération des hydrocarbures 5-7, et des électrodes fluides de stockage d&#39;énergie 8. De suspensions contenant des colloïdes et polymères fluorescents non-adsorbantes sont attrayants systèmes modèles, comme le rapport du rayon de giration de polymère par rapport au rayon de la particule et la concentration de contrôle du polymère de la gamme et de la force de l&#39;attraction interparticulaire, respectivement. En ajustant les propriétés du polymère et la fraction volumique des colloïdes, des fluides colloïdaux, les fluides de grappes, gels, cristaux, et les verres peuvent être obtenus 9. Microscopie confocale, une variante de la microscopie de fluorescence, permet à un échantillon optiquement transparent et fluorescent à imager avec une haute résolution spatiale et temporelle en trois dimensions. Dans cette technique, un petit trou d&#39;épingle ou une fente bloque la lumière fluorescente émise à partir de régions de l&#39;échantillon qui sont en dehors du volume focal du système optique du microscope. En conséquence, seule une mince section de l&#39;échantillon dans le plan focal est imagé. Cette technique est particulièrement bien adaptée pour sonder la structure et la dynamique des suspensions colloïdales denses à l&#39;échelle unique de particules: les particules sont assez grands pour être résolus en utilisant la lumière visible et diffusent suffisamment lentement pour être capturés à des vitesses typiques de balayage des systèmes confocaux commerciaux 10 . L&#39;amélioration de la vitesse de balayage et des algorithmes d&#39;analyse ont également permis l&#39;imagerie confocale quantitative des suspensions découlant 11-16,37. Dans cet article, nous démontrons expériences de microscopie confocale à sonder le comportement de phase confiné et propriétés d&#39;écoulement des mélanges colloïdes polymères. Nous préparons premier collmélanges oid-polymères qui sont la densité et l&#39;indice de réfraction adaptés. Ensuite, nous présentons un protocole standard pour l&#39;imagerie mélanges colloïdes polymères denses de repos sous divers confinement dans des cellules en forme de coin minces. Enfin, nous démontrons un protocole pour l&#39;imagerie mélanges colloïdes polymères lors de l&#39;écoulement de microcanaux.

Pour démontrer l&#39;imagerie confocale et particules de suivi, nous avons étudié l&#39;effet du confinement sur ​​le comportement de phase de mélanges colloïdes polymères 63-65. Pour ces expériences, le diamètre des colloïdes est de 2 a = 0,865 um. La fraction volumique de colloïde a été fixé à Φ = 0,15 et la concentration du polymère c p a fait varier de 0 à 23,6 mg / ml. Images confocales représentatifs sont présentés dans la figure 2 63, colonne de ...

La microscopie confocale est utilisé pour les mélanges polymère-colloïde quiescentes et s&#39;écoulant image, qui sont étudiés en tant que systèmes modèles pour des suspensions attractifs. des algorithmes d&#39;analyse d&#39;image sont utilisés pour calculer des paramètres structuraux et dynamiques par des particules colloïdales qui permettent de mesurer les changements dus au confinement géométrique.

Imagerie confocale de clos de repos et Flowing mélanges colloïdes-polymères

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier les changements dans le comportement de phase confinée et les propriétés de transport de suspensions colloïdales attractives à l'aide de la microscopie confocale. Cela est réalisé en formulant des mélanges colloïde-polymère afin de modéliser des suspensions colloïdales attractives. Les mélanges sont observés et confinés dans des cellules en coin minces afin de montrer comment le confinement modifie la structure, la dynamique et le comportement de phase de ces mélanges.Ensuite, les mélanges sont imagés pendant qu'ils s'écoulent à travers des microcanaux afin de déterminer l'effet de l'intensité de l'attraction entre les colloïdes sur les propriétés de transport confiné des mélanges. L'analyse d'image automatisée et les algorithmes de suivi de particules peuvent montrer comment un confinement au repos conduit à la solidification et à la corrélation d'images. Les algorithmes peuvent montrer comment une augmentation de l'intensité de l'attraction entraîne un comportement d'écoulement de plus en plus non newtonien.L'avantage principal de cette technique ou d'autres méthodes, comme le microscope électronique et la diffusion dynamique de la lumière, réside dans sa capacité à permettre l'observation directe des trajectoires individuelles des particules, à partir desquelles des paramètres dynamiques et structuraux peuvent être calculés et comparés directement aux simulations. Cette méthode standard peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la physique de la matière condensée molle, telles que la manière dont les suspensions s'auto-assemblent en présence d'interactions entre particules, ou comment les suspensions solides et fluides réagissent sous une force ou une contrainte appliquée. Pour ce protocole, des particules de PMMA marquées avec un colorant ont été préparées ; se référer au matériau de référence associé dans le protocole textuel pour les préparations standards.Préparez un mélange de trois à un en poids de broy heane dans deco hydro nataline lean, puis ajoutez du tétra-n-butylammonium et un sel organique jusqu'à une concentration de 1,5 millimolaire. Le solvant correspond à l'indice de réfraction des particules et écrante partiellement leur charge afin de déterminer précisément la densité des particules, puis de les suspendre à 0,1 volume par volume dans le solvant préparé. Centrifugez la suspension à 800 ×g pendant 75 minutes.Vérifiez que les particules ne sédimentent pas après la centrifugation. Ensuite, pour empêcher les particules de se déposer, ajoutez goutte à goutte le solvant de base afin d'ajuster la densité du solvant à celle des particules. Préparez ensuite une suspension à 40 % des particules de PMMA dans le mélange de solvants préparé.Préparez également du polycyrène linéaire dans le mélange de solvant à une concentration élevée. Par exemple, 50 milligrammes par millilitre, calculé à partir de la masse moléculaire et du rayon de giration du polystyrène. L'utilisation de la suspension concentrée de particules de PMMA et de la solution de polystyrène permet d'obtenir des suspensions contenant les particules et les polymères à la concentration souhaitée.Ici, la suspension contient 15 pour cent en volume de particules de PMMA, et la concentration en polymère varie de zéro à 25 milligrammes par millilitre, grâce à des suspensions dispersées de deux types de particules de PMMA de tailles et d'étiquetages différents, en volumes égaux. Les fractions peuvent également être mélangées avec la solution de polymère. Après avoir mélangé chaque suspension, centrifuger les échantillons, puis ajouter un solvant goutte à goutte afin d'ajuster au plus près la densité du solvant à celle des particules.Enfin, équilibrer tous les échantillons en plaçant les échantillons scellés dans un Tumblr pendant au moins 24 heures avant de les imager. Commencer par assembler des chambres rectangulaires à partir de lamelles en verre. L'épaisseur de la lame de microscope ici est d'un millimètre, et par conséquent, l'épaisseur de la chambre, qui permet un comportement en masse des mélanges polymériques cerclés.Si une chambre de hauteur multiple est souhaitée, fabriquez des chambres en forme de coin mince en utilisant une lame couvre-objet unique espacée par un coin. L'angle d'ouverture de la chambre est inférieur à 0,5 degré et l'épaisseur de la chambre augmente de six micromètres à un millimètre. Cette configuration permet de faire varier continuellement l'épaisseur de confinement ; fabriquez les chambres pour qu'elles soient placées sur un microscope inversé et scellez-les avec un époxyde durcissable par UV, résistant au mélange de solvant utilisé pour le microscope.Voici une tête de balayage confocale à balayage linéaire fixée à un microscope inversé équipé d'un objectif à immersion huile de 100 x. Ayant une ouverture numérique de 1,4, utilisez les longueurs d'onde appropriées pour exciter les colorants et acquérez des images carrées de 50 microns sur 512 pixels. Commencez avec un temps d'exposition d'un trente-deuxième de seconde, puis ajustez en fonction de la qualité de l'image.Ensuite, repérez la partie inférieure de la chambre où les particules adhéreront. Puis déplacez le plan de mise au point vers le milieu de la chambre. Prenez maintenant environ 500 images à raison d'une image par seconde au plan médian pour une analyse en 2D.Ensuite, pour l'analyse 3D, acquérez des images en Z-stack avec des intervalles de 0,2 micron sur une profondeur de 30 microns dans tout autre expérience d'imagerie. L'optimisation des conditions d'imagerie afin d'obtenir des images à fort contraste est essentielle. Analysez les images à l'aide d'un logiciel de suivi de particules.Un algorithme capable de résoudre les particules jusqu'à 40 ou 50 nanomètres devrait être disponible. Le suivi des particules n'est possible que si les particules se déplacent de moins que la distance interparticulaire entre des images consécutives. Pour évaluer la structure et la dynamique des particules, utilisez les métriques suivantes.Une fonction de corrélation croisée tridimensionnelle, un déplacement quadratique moyen en deux ou trois dimensions, et la partie propre de la fonction de corrélation de Van Hove en deux ou trois dimensions. Pour cette expérience, fabriquez une simple cellule d'écoulement à partir d'une capillarité carrée en verre large de 100 microns. Fixez un tube en téflon et utilisez des lamelles en verre pour le soutien structurel.Ensuite, chargez le mélange colloïdal de polymères d'intérêt dans une seringue en verre et fixez-la à un système de distribution, tel qu'une pompe. Montez maintenant l'ensemble sur le microscope inversé utilisé dans la section précédente. La cellule d'écoulement de la seringue et la sortie doivent être maintenues aussi horizontales que possible.Régler le débit en fonction du mélange polymère colloïdal. Des vitesses de concentration allant de 200 à 2 000 microns par seconde à travers des capillaires carrés ont été utilisées lors de l'écoulement. Acquérir des images en 2D comme décrit dans la section précédente, à différentes distances du fond du canal, comprises entre cinq et 50 microns.Si les particules apparaissent elliptiques, augmentez la fréquence d'acquisition des images. Utilisez un logiciel de suivi et IDL ou MATLAB pour analyser l'écoulement. L'obtention d'une résolution sub-pixellique dans le suivi des particules nécessite un réglage minutieux des paramètres de suivi afin d'obtenir des OID non biaisés dans une direction particulière.Lors d'un écoulement lent. Lorsque les particules se déplacent moins que la distance interparticulaire entre deux images successives, des trajectoires peuvent être obtenues à l'aide de routines de suivi dans un écoulement plus rapide. Utiliser la corrélation d'images pour calculer la vitesse.Diviser chaque image en images horizontales dans le sens de l'écoulement. Dans des images consécutives, décaler la deuxième image afin de l'aligner sur la première, puis utiliser la distance de décalage pour calculer la vitesse entre les paires d'images ou chaque subdivision des images d'origine. Établir un histogramme de toutes les valeurs de décalage calculées.Si les valeurs ne présentent pas de pics marqués, répétez l'expérience à une fréquence d'images plus élevée. Des particules de PMMA ayant un diamètre nominal de 0,865 micromètre ont été suspendues à 15 % en volume dans un mélange de solvants contenant 23,6 milligrammes de polymère par millilitre. Des paramètres structuraux et dynamiques ont été utilisés pour évaluer les images, notamment la corrélation par paire et le déplacement quadratique moyen.Changer le liquide de dispersion peut modifier la structure et la dynamique des suspensions confinées. Par exemple, une suspension dispersée de particules de 1,48 micron et de 0,73 micron a été formulée de sorte que les particules occupent 15 % du volume en réduisant l'épaisseur de confinement. Une phase gel colloïdale, analogue à un solide, a été induite contenant les deux types de particules, et le déplacement quadratique moyen des particules plus grandes a diminué à mesure que le confinement du système augmentait.Conformément au flux de solidification, les propriétés des particules faiblement attractives et fortement attractives ont été comparées. La concentration en polymère variait de cinq à 25 milligrammes par millilitre. Dans les suspensions, la suspension faiblement attractive présentait un profil de densité qui variait fortement selon la position à travers le canal.Lors d'un débit de 10 microlitres par heure, le profil de densité de la suspension fortement attractive était presque constant à travers le canal dans les mêmes conditions. De même, on observait des différences dans les profils de vitesse de ces suspensions. Les particules faiblement attractives présentaient un profil de vitesse proche de la prédiction newtonienne, tandis que les particules fortement attractives s'écartaient légèrement de la prédiction newtonienne, en particulier près de la paroi latérale du canal où Y est nul.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la microscopie confocale pour étudier le comportement de phase et les propriétés flu des suspensions colloïdales en suivant cette procédure. D'autres paramètres, tels que les tailles des agrégats et les dimensions fractales, peuvent être calculés à partir des positions des particules afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont le confinement modifie la forme des agrégats formés.

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Ici nous démontrons les protocoles pour effectuer une seule molécule de microscopie par fluorescence sur des cellules vivantes pour permettre aux bactéries fonctionnelles complexes moléculaires à détecter, suivre et quantifiés.

Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Dans ce travail nous expliquer la fabrication et l'utilisation d'un mélangeur microfluidique capable de mélanger deux solutions dans ~ 8 ms. Nous démontrons également l'utilisation de ces mélangeurs avec détection spectroscopique utilisant la fluorescence UV et de fluorescence de transfert d'énergie par résonance (FRET).

Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

Un protocole pour la quantification et la comparaison simultanées de trois composants cellulaires et extracellulaires dans des biofilms est présenté. La méthodologie implique l’utilisation d’une microscopie confocale à balayage laser, d’un logiciel d’analyse structurelle et de visualisation de biofilm et d’un logiciel d’analyse statistique.

Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Les biofilms ont des interactions complexes avec leur environnement. Pour étudier de manière exhaustive les interactions biofilm-environnement, nous présentons ici une série de méthodes permettant de créer un environnement chimique hétérogène pour le développement de biofilms, de quantifier la vitesse d’écoulement locale et d’analyser le transport de masse dans et autour des colonies de biofilms.

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Pour étudier les vitesses d’écoulement et la directionnalité de l’actine filamenteuse au niveau de la synapse immunologique des lymphocytes T, l’imagerie à super-résolution des cellules vivantes est combinée à la fluorescence par réflexion interne totale et quantifiée par spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Polymérisation par précipitation non agité fournit une approche de prototypage rapide, reproductible à la synthèse de stimuli-sensibles poly (N -isopropylacrylamide) microgels de distribution de taille étroite. Dans cette synthèse de protocole, la caractérisation de la diffusion de la lumière et unique suivi de fluorescence des particules de ces microgels dans une configuration de microscopie à champ large sont démontrées.

Synthèse contrôlée et le suivi Fluorescence de très uniforme Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgels

Ce protocole décrit la synthèse et la formulation de biomatériaux injectables supramoléculaires d’hydrogel polymère-nanoparticule (PNP). Les applications de ces matériaux pour l’administration de médicaments, la stabilisation biopharmaceutique, l’encapsulation cellulaire et l’administration sont démontrées.

Hydrogels supramoléculaires injectables de polymères-nanoparticules pour les applications cellulaires et d’administration de médicaments

La technique proposée fournira une approche nouvelle, efficace, frugale et non invasive pour l’imagerie de l’écoulement fluidique à travers un lit de poudre garni, ce qui donnera une résolution spatiale et temporelle élevée.

Technique d’imagerie frugale de l’écoulement capillaire à travers des poudres d’impression polymères tridimensionnelles

Nous présentons un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie interférence-réflexion et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de protéines associées à des microtubules marquées par fluorescence.

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Ce protocole détaille la conception et la fabrication d’un dispositif microfluidique adapté à l’étude de la mécanique des polymères de microtubules. La synthèse de techniques de microfabrication, de contrôle automatisé des flux et de modélisation informatique permet d’obtenir un système flexible parfaitement adapté à l’exploration du cytosquelette cellulaire in vitro.

Développement d’une approche basée sur la microfluidique pour l’étude de la mécanique des polymères de microtubules

Découvrez comment la microscopie confocale quantifie les changements de comportement de phase et les propriétés de transport des suspensions colloïdales attractives confinées. Cette méthode révèle la solidification et l'écoulement non newtonien.

Imagerie confocale de clos de repos et Flowing mélanges colloïdes-polymères

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