Application de l'acide rétinoïque pour obtenir des cultures de ostéocytes de primaires ostéoblastes de souris

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des ostéocytes ramifiés matures à partir d’ostéoblastes primaires. Ceci est réalisé d’abord en isolant des ostéoblastes primaires à partir d’os de souris nouveau-nées et en les cultivant pour permettre la maturation des ostéoblastes. Ensuite, les ostéoblastes confluents sont les tryps.

Inisé, puis compté et replaqué à une densité définie pour garantir le succès. Ensuite, tout l’acide transrétinoïque ou ATRA est ajouté au milieu cellulaire pour réduire la prolifération cellulaire et induire une différenciation complète vers la morphologie ostéocytaire. Des résultats sont obtenus qui montrent qu’en présence d’ATRA, les cellules acquièrent rapidement une morphologie ramifiée, cessent de produire une matrice extracellulaire et se différencient vers un phénotype ostéocytaire mature, comme le montre l’expression des marqueurs ostéocytaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’isolement des ostéocytes primaires ou la différenciation des ostéoblastes dans une matrice tridimensionnelle, est qu’elle produit un nombre suffisant d’ostéocytes en quelques jours.

L’absence de paramètres environnants facilite l’utilisation de ces cellules dans les tests de biologie des cellules N et de biologie moléculaire. De plus, la méthode peut être appliquée à des souris transgéniques, permettant des études fonctionnelles sur des molécules d’intérêt. La démonstration de la procédure sera faite par Deborah, une docteure de mon laboratoire.

Pour commencer, préparez le milieu de digestion en ajoutant 0,1 % de collagénase P et 0,05 % d’essai à la solution saline équilibrée de Hank ou HBSS. Après avoir sacrifié et décapité des souris âgées de trois à quatre jours, utilisez de l’éthanol à 70 % pour vaporiser la tête et la placer sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux de dissection, retirez la peau et les couches musculaires.

Retirez délicatement les os pariétaux et séparez-les en deux moitiés en suivant la suture sagittale. Après avoir retiré les sutures et les tissus adhérents, placez les morceaux d’os individuels dans un milieu HBSS. Ensuite, jetez le HBSS et ajoutez le milieu de digestion à chacun.

Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez un milieu de digestion frais et répétez l’incubation. Après la deuxième incubation, prélevez le surnageant et combinez-le avec alpha mam complété par FBS et pen streptocoque.

Répétez la digestion deux fois de plus. En combinant le surnageant avec le milieu, puis centrifugez les fractions regroupées à 425 G pendant cinq minutes, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans de l’alpha-mam supplémenté, avant de transférer la suspension cellulaire dans une fiole de 25 centimètres carrés. Après une incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, retirez les débris et les cellules mortes.

Ajoutez ensuite de l’alpha mem, suivi de 50 microgrammes par millilitre d’acide ORIC ou d’aa, et trois millimolaires de glycérol, deux phosphate di, du sel de sodium, de l’hydrate ou du GP à la culture avant de retourner à l’incubateur. Après avoir retiré le milieu des cellules de sous-confluence et utilisé HBSS pour les laver, ajoutez de la trypsine fraîchement préparée et incubez pendant trois minutes. À 37 degrés Celsius, lorsque les cellules se sont détachées, ajoutez trois millilitres de milieu Alpha M pour inactiver la trypsine.

Récupérez les cellules et centrifugez à 425 G pendant 15 minutes avant de les réanimer, en suspendant la pastille cellulaire dans un milieu frais, placez une goutte de la suspension dans un hémocytomètre. Laissez-le se calmer pendant quelques minutes et comptez les cellules en utilisant les hommes alpha plus A A GP. Transférez les cellules dans des flacons de 25 centimètres carrés à une densité de 10 000 cellules par centimètre carré. Une densité cellulaire plus élevée nuira au bon développement des processus cellulaires, et un nombre inférieur de cellules peut entraîner la mort cellulaire en raison de l’absence de contacts intercellulaires, tandis que l’incubation ajoute de l’ATRA au milieu à une concentration de cinq micromolaires toutes les 24 heures.

Des changements morphologiques sont généralement observés après 48 heures. Une population homogène d’ostéocytes matures devrait être présente après quatre à cinq jours. Les cellules peuvent être utilisées jusqu’à 12 à 15 jours, comme indiqué ici.

Les cellules primaires traitées par GP ont principalement des caractéristiques semblables à celles des pavés. Caractéristique des ostéoblastes matures intercalés. Les cellules ramifiées indiquées par les flèches rouges représentent probablement des ostéocytes.

Après deux jours de traitement ATRA, les cellules commencent rapidement à présenter des ramifications, comme le montre cette figure. Les cellules ramifiées ont besoin d’espace pour étendre leurs dendrites au fur et à mesure que le traitement par ARA progresse, les ramifications augmentant progressivement en nombre et en complexité. La coloration d’une actine filamenteuse par rho domine marquée foid in met en évidence les processus cellulaires.

Les ostéoblastes primaires produisent de grandes quantités de matrice calcifiée, qui s’accumule au-dessus et entre les cellules et peut être visualisée par coloration au rouge d’alizarine. En revanche, les ostéocytes ne produisent pas de matrice extracellulaire calcifiée et la coloration alazar et rouge est complètement négative dans les cellules incubées par ATRA. En conséquence, aucun alazar et rouge minimes ne peuvent être mesurés après la procédure d’extraction.

Comme illustré ici. La coloration immunologique de la sclérostine révèle une expression cytoplasmique intense et la présence de points positifs le long des processus cellulaires. De plus, le FGF 23 est hautement détectable dans les cellules traitées par ATRA, à la fois dans le corps cellulaire et le long des processus cellulaires.

Pendant cette procédure, il est important de se rappeler que vous avez affaire à des cellules primaires, donc à l’ajustement de la concentration et au remplacement de la cellule. Si la prolifération reste élevée après une tradition doit être prise en considération, en particulier lorsqu’il s’agit d’animaux transgéniques. N’oubliez pas que la morphologie cellulaire est essentielle pour guider toutes les étapes de cette méthode.

Vérifiez la cellule tous les jours au microscope inversé.