Fabrication de concentré, de l'oxygène à base de lipides microbulles émulsions par cisaillement élevé homogénéisation et la concentration de série

L'objectif général de cette procédure est de produire un grand volume de microbulles d'oxygène, auto-assemblées et à base de lipides, ou OMS, destinées à une administration intraveineuse d'oxygène. Cela est réalisé à l’aide d’un homogénéisateur à haute cisaillement et d’un réservoir étanche aux gaz afin de fabriquer et de concentrer de façon sériée les OMS. La deuxième étape consiste à utiliser des seringues modifiées pour extruder une émulsion LOM contenant 70 pour cent en volume d’oxygène.

Ensuite, l'émulsion est concentrée par centrifugation afin d'obtenir une mousse d'oxygène à 90 pour cent en volume. La dernière étape consiste à effectuer un contrôle qualité en calculant le pourcentage volumique d'oxygène et en évaluant la distribution de la taille des particules à l'aide de la technologie de diffusion de la lumière. En définitive, l'homogénéisation à haute cisaillement produit deux litres de SMO contenant 90 % d'oxygène en volume.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes de fabrication existantes, telles que la sonication et l'amalgamation, est que l'homogénéisation produit des microbulles s'auto-assemblant en volumes de l'ordre du litre, un volume nécessaire pour les tests sur de grands animaux concernant l'administration thérapeutique d'oxygène. L'une des utilisations de cette technique consiste à traiter les patients présentant une hypoxémie sévère, car les microbulles remplies de gaz oxygène transfèrent l'oxygène à l'hémoglobine désaturée en quelques secondes et transportent trois fois la quantité d'oxygène contenue dans le sang. La démonstration de cette méthode revêt une importance particulière en raison de la profondeur de la tête de l'homogénéisateur.

Le maintien d'un environnement purement oxydatif et la distinction entre la phase organique concentrée (LMS) et la phase aqueuse peuvent être difficiles à appréhender. Le système de fabrication des microbulles d'oxygène à base de lipides, ou OMS, comprend un réservoir de maintien et de concentration (HCT) équipé d'un agitateur à un seul étage, d'un homogénéiseur in-line à haute cisaillement, d'une pompe à rouleaux permettant de déplacer le fluide entre le HCT et l'homogénéiseur, et d'un échangeur de chaleur.

Pour commencer la configuration du système, placez un récipient de collecte en verre stérilisé de quatre litres à large ouverture, équipé de deux orifices à la base et de trois orifices latéraux, sous le mélangeur à un seul étage. Branchez l'un des orifices de base du HCT, le numéro un, à un tube transparent stérile de trois huitièmes de pouce de diamètre intérieur, d'environ 25 cm de long, muni à son extrémité d'un robinet à trois voies destiné à la collecte de l'émulsion concentrée. Ensuite, reliez le deuxième orifice de base, le numéro deux, à un tube stérile de trois huitièmes de pouce de diamètre intérieur, d'environ 91 cm de long. Passez ce tube à travers la pompe à rouleaux.

L'entrée de l'homogénéisateur à haute cisaillement est équipée d'un té comportant deux orifices. Relier le tube de l'orifice numéro deux au travers de la pompe péristaltique, puis le relier à l'orifice latéral du té. Rattacher l'autre orifice à une bouteille d'oxygène à l'aide d'un débitmètre de gaz d'oxygène à faible débit.

Reliez le port de sortie de l'homogénéisateur à cisaillement élevé à l'entrée d'un échangeur de chaleur en ligne maintenu à quatre degrés Celsius. Reliez le port de sortie de l'échangeur de chaleur au port de retour du HCT afin de créer un système en boucle fermée. Fixez la bouteille d'oxygène, via un débitmètre, au HCT par le biais du port numéro quatre.

Enfin, fixez un moniteur de composition gazeuse ouvert à l'atmosphère au port supérieur du HCT. Pour commencer cette procédure, placez 20 grammes d'huile de GMP un deux DYS, de SN glycérol trois PHOSPHOCHOLINE ou DSPC et 10 grammes de cholestérol au fond du HCT. Ajoutez un litre de plasma light A au HCT et mélangez à la main pendant une minute, en intégrant autant de lipide que possible dans la phase aqueuse.

Abaisser le mélangeur à une seule étape dans la phase aqueuse, en veillant à ce que toute la tête du mélangeur soit recouverte par la phase aqueuse. Pour éviter que l'air ambiant ne contamine l'espace libre, utiliser des joints en caoutchouc ou du ruban adhésif afin de garantir que le haut du HCT soit étanche aux gaz et qu'il n'y ait aucun orifice latéral ouvert. Enclencher la source de gaz raccordée au port numéro quatre et attendre jusqu'à ce que la fraction d'oxygène dans l'espace libre du HCT atteigne une valeur supérieure à 95 %. À l'aide du mélangeur à une seule étape, mélanger l'émulsion précurseur pendant cinq minutes. À 5 000 tr/min, le mélange obtenu doit apparaître blanc pâle et ne présenter aucun agrégat lipidique visible.

Une fois mélangé, le mélange excédentaire de lipides et d'eau peut être conservé à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à 30 jours avant utilisation unique. Utilisez le précurseur d'émulsion pour amorcer tout le système en boucle fermée en mettant en marche la pompe à rouleaux à 1,3 litre par minute ou LPM. Une fois le système amorcé, maintenez la pompe en marche à 1,3 LPM pour commencer la fabrication des LO.

Mettre l'homogénéisateur à cisaillement élevé en ligne en marche à 7 500 tr/min. Immédiatement après, activer le débit d'oxygène vers la partie d'entrée de l'homogénéisateur à 0,5 L/min. Maintenir le mélangeur à une seule étape dans le HCT à 3 500 tr/min.

Les Oms se forment à l'interface des pales du rotor et des écrans d'émulsion à l'intérieur de l'homogénéisateur en ligne. En quelques minutes, le liquide devrait devenir visiblement plus visqueux. Faire fonctionner le système pendant 15 minutes, puis arrêter l'homogénéisateur à cisaillement élevé et l'arrivée d'oxygène.

Cela atténue la séparation de phase et maintient le produit relativement homogène à l'intérieur du HCT. Notez que le volume de l'émulsion chargée de gaz doit augmenter d'environ deux à trois fois pendant la phase de concentration en série. Les seringues de prélèvement de 140 millilitres équipées d'un système de verrouillage ont été préalablement modifiées en aspirant 100 millilitres d'air dans la seringue, puis en sciant l'excédent du piston et de la matière de la seringue au-dessus du repère de 140 millilitres.

Fixez une seringue stérile modifiée au robinet à trois voies relié au port inférieur numéro un du récipient de collecte ; utilisez une pince dentée pour abaisser le piston et aspirer 100 millilitres de liquide, puis capuchonnez hermétiquement la seringue. Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le liquide soit retiré. Centrifugez les seringues en orientant l’extrémité capuchonnée vers le bas dans une centrifugeuse à godets réfrigérée à 225 ×g pendant 10 minutes. Trois couches de matériau seront visibles après la centrifugation : expulsez et jetez la couche inférieure constituée d’un excès de phase aqueuse trouble.

La deuxième couche est blanche brillante et contient des oms concentrés. Transférez la mousse concentrée dans une seringue en verre imperméable aux gaz à l’aide d’un robinet à trois voies afin d’éviter toute contamination par les gaz ambiants. Jetez la couche finale, qui contient du gaz oxygène libre provenant des oms rompus.

La qualité de la mousse peut être évaluée en calculant la concentration en gaz comme suit. Une mousse de haute qualité atteindra une concentration en gaz supérieure ou égale à 90 pour cent en volume, les microbulles de qualité secondaire étant contrôlées par diffusion de la lumière optique afin de déterminer si la taille des particules se situe dans la plage attendue. Il convient de noter qu'une modification du temps d'homogénéisation ou de la formulation pourrait modifier la taille des bulles, les seringues en verre contenant les oms concentrés étant bien fermées.

Avec un raccord verrouillable, les seringues peuvent être conservées à 22 degrés Celsius, à quatre degrés Celsius ou à moins 20 degrés Celsius. Des températures plus basses peuvent offrir une meilleure stabilité de la durée de conservation. Selon ce protocole, jusqu'à deux litres d'OMS concentré peuvent être produits en 90 minutes.

La visualisation d'un échantillon de 10 microlitres d'OMS par microscopie optique a révélé des OMS sphériques ainsi qu'une relative abondance de débris lipidiques. Lorsque le même échantillon d'OMS a été analysé par diffusion optique, le diamètre moyen des particules était de 2,624 ± 0,332 micromètres. Plus de 90 % des OMS avaient un diamètre inférieur à 10 micromètres et la population était polydispersée.

La viscosité de l'émulsion dépendait fortement de la fraction de gaz et, par conséquent, de la concentration de microbulles. Des aliquotes de 2 mL d'émulsion LOM à 60, 70 et 90 pour cent de volume de gaz ont été étudiées à l’aide d’un balayage d’écoulement en régime permanent utilisant une plaque parallèle de 40 mm.

La géométrie en fonction de la contrainte a été modifiée de 0,1 à 1000 ; des gaz OMS contenant 60 % en volume de gaz ont présenté un profil radiologique similaire à celui du sang humain. La teneur en oxygène de l'OMS a été testée en ajoutant des volumes variables d'oxygène contenus dans 60 % en volume d'OMS à des aliquotes de sang humain désaturé présentant un déficit en oxygène connu. La relation entre le volume d'oxygène ajouté dans l'OMS et l'augmentation volumétrique de la teneur en oxygène du sang était de 1,053 plus ou moins 0,03025.

Suggérant que les SMO testés contiennent près de 100 % d'oxygène, ils présentaient peu de poches de gaz piégé et transféraient efficacement la totalité de leur charge d'oxygène au sang humain in vitro. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour produire deux litres de SML en 90 minutes, à condition d'être réalisée correctement et de manière efficace. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir une inspection visuelle des SMO en cours d'accumulation et d'effectuer un contrôle qualité sur la concentration de la mousse de SML. Après cette procédure de fabrication, les SMO peuvent être utilisés pour l'injection intraveineuse à grande échelle et la délivrance de gaz thérapeutiques.