Name: Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez une méthode pour induire une neutrophilie pulmonaire par nébulisation de LPS aérosolisé chez la souris. Cette technique permet d'évaluer le recrutement des neutrophiles et d'analyser l'inflammation pulmonaire avec une distribution homogène.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous tenons à remercier Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Suède), Benita Dahlberg et le Dr Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Suède) ainsi que le Dr Martin Stampfli (Université McMaster, Hamilton, ON, Canada) à l&#39;aide habile et des conseils d&#39;experts.

Les études chez l&#39;animal ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de bien-être animal du Nord de Stockholm. Les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la législation suédoise. 1. Génération d&#39;un aérosol LPS <ol><li> Dissoudre 0,5 g purifiée P. aeruginosa LPS dans 50 ml de solution saline stérile avec agitation douce et vérifier dissolution. Diluer 1 ml de LPS en solution dans 9 ml de solution saline stérile, à une concentration finale de 1 mg / ml. Protéger de la lumière avec une feuille d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C. </li><li> Décongeler LPS solubilisées dans l&#39;obscurité à la température ambiante et bien mélanger immédiatement avant utilisation. </li><li> Dans un ventilé niveau II Biohazard capot, insérer une entrée rouge dans un nébuliseur, et connectez le nébuliseur à l&#39;air ambiant sous pression via la tubulure fournie par le (régime d&#39;examen présentant les dispositifs expérimentaux dans la figure 1) du fabricant. ATTENTION: l&#39;équipement de protection individuelle approprié, y compris une demi-pièce faciale respirat réutilisableou de filtres à particules, lunettes, gants et vêtements de protection doit être utilisé au cours de l&#39;exposition. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Présentation schématique des dispositifs expérimentaux utilisés pour générer un aérosol de l&#39;entrée du nébuliseur est relié à une alimentation en air. La sortie du nébuliseur est relié à un premier compteur de débit par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube de 15,9 mm et un filtre à air, et l&#39;alimentation en air est ajusté à 5,0 L / m à une pression de 2 kbar. La sortie est à côté connecté à une boîte en plexiglas équipée avec des couvercles amovibles et 5 trous de mm pour éviter l&#39;accumulation de pression. <ol start="4"><li> Raccorder la sortie du nébuliseur pour un débitmètre de masse par l&#39;intermédiaire d&#39;un filtre à air. Connectez le débitmètre massique à une alimentation électrique. </li><li> Réglez l&#39;alimentation en air à 5 L / min, avec une pression en restant à 1,0-2,0 bar. </li><li> Retirez le débitmètre massique etdébrancher l&#39;alimentation en air. </li><li> Raccorder la sortie du nébuliseur pour un tube de 15,9 mm, ce qui bifurque et se connecte à deux boîtes en plexiglas de dimensions: 150 x 163 x 205 mm, munis de couvercles amovibles. Chaque boîte doit avoir un trou de 5 mm dans le côté opposé de l&#39;entrée, pour éviter l&#39;accumulation de pression. </li><li> Placez jusqu&#39;à 5 souris dans chaque boîte de plexiglas et fermer les couvercles. </li><li> Ouvrir le nébuliseur et remplir l&#39;insert avec au moins 4 ml de LPS en solution dans du sérum physiologique stérile ou le véhicule seul (solution saline stérile, le volume ne doit pas dépasser 8 ml). Re-connecter l&#39;entrée de l&#39;alimentation en air. </li><li> Laisser l&#39;aérosol se écouler dans les boîtes en plexiglas fermées pendant 10 min. Surveiller en continu les animaux. Assurez-vous que l&#39;alimentation en air reste solidement attaché à l&#39;entrée du nébuliseur. </li><li> Débranchez l&#39;alimentation en air. Avec les couvercles fermés, laisser les animaux restent dans les boîtes en plexiglas pendant 2 min. </li><li> Ouvrez les couvercles et permettre l&#39;aérosol de se disperser, et de renvoyer les animaux à tes cages. Si les animaux semblent humide, placer les cages sur un coussin chauffant à basse température, pour éviter l&#39;hypothermie. </li><li> Surveiller les animaux en continu pendant les 30 premières minutes, et ensuite tous les 2 h pour le 6 premières heures. Les animaux doivent présenter motif respiratoire normale et l&#39;activité pendant et après la procédure de nébulisation. </li></ol> 2. lavage broncho-alvéolaire (LBA) <ol><li> Au point de fin expérimentale, profondément anesthésier les animaux avec de l&#39;isoflurane à effet tel que recommandé par le personnel vétérinaire de votre institution. Pincez la patte arrière pour vérifier un réflexe de retrait pour assurer une profondeur suffisante de l&#39;anesthésie pour mener une intervention chirurgicale majeure. Arroser la fourrure des animaux avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Ouvrez l&#39;abdomen avec des ciseaux, et de rompre l&#39;aorte pour être exsangue l&#39;animal. Placez un morceau de tissu sur l&#39;abdomen pour absorber le sang. </li><li> Follwing l&#39;euthanasie, utiliser une seule coupe des ciseaux antéro-postérieur àexposer le thorax. Soulevez la cage thoracique par l&#39;extrémité antérieure du sternum et utiliser les ciseaux pour percer la membrane au point ventrale plus, sans couper dans toute lobe pulmonaire. Ouvrez la cage thoracique en faisant deux entailles dans le sens antéro-postérieur (réunion en dessous de la mâchoire). </li><li> Tirez doucement en dehors de la cage thoracique en utilisant une pince, et couper la trachée sous le larynx. </li><li> Soulevez la trachée avec la pince et retirer les poumons en coupant les ligaments reliant les lobes de la cavité thoracique, et en tirant doucement par le tissu adipeux et cardiaque. </li><li> Insérez un tube de polyéthylène (diamètre intérieur: 0,58 mm; diamètre extérieur: 0,965 mm) dans la trachée et fixer le tube avec une chaîne de fil de soie. </li><li> Nouez le multilobe (les quatre lobes du poumon droit) avec du fil de soie. </li><li> Insérer une aiguille de calibre 23 dans le tube de polyéthylène et injecter lentement 250 ul de glacé PBS stérile dans le lobe unique avec une seringue de 1 ml. </li><li> Enfoncer délicatement les poumons30 heures et recueillir le liquide à travers la seringue. Répéter la procédure avec 200 ul de PBS (environ 300 ul de PBS doit être récupéré à partir du lobe unique à partir du volume injecté de total de 450 ul). </li><li> Gardez le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) sur la glace, ou énumérer les cellules BAL immédiatement. Compter les cellules avec un heamocytometer, en utilisant une solution Turk pour colorer les cellules 11. Calculer le nombre total de cellules en multipliant le nombre de cellules avec le facteur de dilution de la solution de coloration et le volume dans le domaine de la heamocytometer compté. </li><li> Préparer numérations cellulaires différentielles à partir de cellules cytocentrifuged comme décrit par ailleurs 11. </li></ol> 3. La fixation au formol des tissus pulmonaires pour l&#39;évaluation histologique <ol><li> Retirez le multilobe et enclenchez-gel sur glace sèche. Stocker à -80 ° C. </li><li> Monter une seringue de 60 ml avec le piston retiré sur un stand de support métallique. Remplir la seringue avec 10% de formol àla hauteur de 20 cm au-dessus du banc de laboratoire, soit 20 cm de pression constante. </li><li> Connecter l&#39;aiguille de calibre 23 fixée à la trachée de la seringue de 60 ml par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube en plastique avec une vanne pour commander l&#39;écoulement de la formaline. </li><li> Insuffler le lobe du poumon avec de la formaline pendant 5 min. Déconnecter l&#39;aiguille et la retirer avec le tube de polyéthylène à partir de la trachée tout en tirant sur le fil de soie pour fermer la trachée et de conserver la pression dans le poumon. </li><li> Immerger le lobe du poumon dans le formol et fixer pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Laver le tissu fixé à trois reprises pendant au moins 20 min avec 70% d&#39;éthanol, et déshydrater au xylène par le schéma suivant (1 h chacun): <ul><li> 3x éthanol à 70% </li><li> 3x éthanol à 95% </li><li> 3x éthanol à 100% </li><li> 3x xylène </li><li> 1x (liquide) de paraffine </li></ul></li><li> Incluez tissus déshydratés dans de la paraffine, coupés en sections 4-5 pm, et les taches avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine pour permettre une évaluation histologique.</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li>
<li>Hoogerwerf, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li>
<li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+humoral+responses+to+Escherichia+coli+and+sheep+red+blood+cell+antigens+introduced+via+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract.</a> Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).</li>
<li>Asti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.+I.+Concomitant+evaluation+of+inflammatory+cells+and+haemorrhagic+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage.</a> Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+deposition+of+therapeutic+particles+during+spontaneous+and+controlled+inhalations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmaceutical+sciences%22%5BJournal%5D)">Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations.</a> Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li>
<li>Roos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial-C%2FEBPbeta+contributes+to+LPS-induced+inflammation+and+its+suppression+by+formoterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).</li>
<li>Didon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein-beta+is+necessary+for+the+integrity+of+inflammatory+responses+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).</li>
<li>Silverpil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+on+IL-23+exerted+by+IL-17A+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation.</a> Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).</li>
<li>Mercer, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-Activated+Receptor-1%2C+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li>
<li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li>
<li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Exacerbations+of+COPD%3A+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li>
<li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHurst%2C+JR+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22">Am. J. Respir. Crit. Care Med</a>. 173, 71-78 (2006).</li>
<li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%3A+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
</ol>

Abraham Roos a reçu des honoraires de conférencier de Boehringer Ingelheim, bourses de voyage d&#39;AstraZeneca R &amp; D et une subvention d&#39;AstraZeneca R &amp; D recherche. Magnus Nord est un employé à temps plein d&#39;AstraZeneca R &amp; D et a reçu des subventions de recherche d&#39;AstraZeneca R &amp; D. Johan Grunewald et Tove Berg sont co-chercheurs sur un projet de recherche indépendant financé par AstraZeneca R &amp; D.

LPS en aérosol génère une réponse inflammatoire dans les voies respiratoires, caractérisé par des neutrophiles dans la muqueuse epitheliale, les espaces entourant les voies respiratoires conductrices, ainsi que les espaces alvéolaires. Ce est, avec la teneur en protéines totales ont augmenté dans BALF, indicatif de fuite plasmatique, représentant de la pathologie de la lésion pulmonaire aiguë. Comme LPS induit une inflammation stérile, la réaction est indépendante de la réponse immunitaire adaptative, et il existe des l...

Le lipopolysaccharide (LPS) est un composant de la paroi cellulaire de bactéries à Gram négatif 1. Défi au LPS est un modèle bien documenté de lésion pulmonaire aiguë, un syndrome caractérisé par une inflammation neutrophile aiguë et un oedème 2. En outre, neutrophilie pulmonaire est également une caractéristique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) 3, et le défi LPS chez l&#39;homme a été utilisé pour modéliser exacerbations de la MPOC 4. Ainsi, les modèles expérimentaux d&#39;exposition LPS sont des outils pertinents et utiles pour comprendre la pathologie humaine cliniquement. L&#39;objectif de l&#39;administration pulmonaire de LPS aérosol décrits ici est de générer une réponse inflammatoire neutrophile dans la conduite et les voies respiratoires, sans atteinte systémique. Plusieurs techniques de LPS ont été décrits précédemment. L&#39;injection intra-veineuse de LPS est la voie d&#39;administration la plus couramment utilisée. Bien que cette technique est facilement accessible, til dommages primaires est à l&#39;endothélium, la destruction secondaire de l&#39;épithélium pulmonaire après la migration des neutrophiles dans les poumons. L&#39;administration intra-veineuse provoque également une inflammation systémique deux, ce qui peut compliquer le tableau clinique chez des modèles animaux. L&#39;inflammation systémique est en revanche pas observé avec l&#39;administration intra-trachéale. Cette technique, cependant, est beaucoup de travail et nécessite anesthésiques ainsi que la formation considérable 5, 6. En outre, le dépôt pulmonaire par cette voie d&#39;administration dépend de la respiration 7. Ainsi, le dépôt pulmonaire est affectée par la profondeur de l&#39;anesthésie nécessaires pour l&#39;administration intra trachéale et le dépôt dans les voies aériennes variables peuvent être observées. En revanche, l&#39;administration pulmonaire avec du LPS en aérosol nécessite une formation minimale, et peut facilement être réalisée sur un grand nombre d&#39;animaux avec peu ou pas de variation entre les individus 5, 8.Une étude récente confirme que l&#39;administration par aérosol est supérieure à la voie intra-trachéale à l&#39;égard de dépôt, et que des doses plus pertinentes de LPS induit une inflammation neutrophile 8 avec ce modèle. Des études antérieures ont démontré que défi pour aérosol Pseudomonas aeruginosa LPS génère une réponse inflammatoire marquée dans la lumière des voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire, y compris les espaces alvéolaires 9, 10. L&#39;inflammation est caractérisée par une prédominance de neutrophiles et la présence d&#39;un œdème pulmonaire, et peut ainsi être utilisée pour traiter pathogenèse de la lésion pulmonaire aiguë et obtenir en outre la connaissance des mécanismes qui contribuent à la pathologie de la maladie.

<table><tbody><tr><td>LPS purifiée de &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Nocif. Purification recommandée. Des LPS purifiées à partir d'autres bactéries peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Nébuliseur Pari LC sprint star</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>Débitmètre massique TSI 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>Un produit alternatif du fournisseur peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Tuyau Tygon Saint-Gobain 15,9 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>Marque recommandée.</td></tr><tr><td>Boîtes en plexiglas avec couvercles amovibles</td><td>Construit sur mesure</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm (un trou de 2 mm sur le côté).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Réservoir respiratoire réutilisable demi-masque 3M</td><td>3M</td><td>7503</td><td>Marque recommandée.</td></tr><tr><td>Filtres particulaires avancés 3M (P100)&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>Marque recommandée.</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>Des ciseaux de préférence peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>Des pinces de préférence peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Tuyau en polyéthylène Intramedic PE50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Marque recommandée.</td></tr><tr><td>Fil de soie Ethicon 2-0 Perma-hand</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Marque recommandée.</td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 26 &amp;frac12;</td><td></td><td></td><td>Des fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Seringue BD de 1 ml à embout glissant, non stérile</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>Des fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Seringue BD Luer-Lok de 60 ml, non stérile, en polypropylène</td><td>BD</td><td>301035</td><td>Des fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Hématoxyline-éosine Fluka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>Des fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Solution de &amp;uuml;Türk</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td></td><td></td><td>Des fabricants alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Cytocentrifugeuse Cytospin 4</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Une autre centrifugeuse peut être utilisée.</td></tr><tr><td>Kit de coloration HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>Des kits de coloration alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Solution de formol tamponnée neutre, 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Des fournisseurs alternatifs existent.</td></tr></tbody></table>

une méthode pour générer pulmonaire neutrophilie utilisation aerosolized lipopolysaccharide

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Lésion pulmonaire aiguë (ALI) est une maladie grave caractérisée par neutrophilie alvéolaire, avec des options de traitement limitées et une mortalité élevée. Des modèles expérimentaux de ALI sont clé dans l&#39;amélioration de notre compréhension de la pathogenèse de la maladie. Le lipopolysaccharide (LPS) provenant de bactéries à gram positif induit une inflammation neutrophile dans les voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire de la souris. Délivrance pulmonaire efficace des composés tels que le LPS est toutefois difficile à réaliser. Dans l&#39;approche décrite ici, l&#39;administration pulmonaire chez la souris est réalisé par défi pour aérosol Pseudomonas aeruginosa LPS. LPS a été dissous en aérosol par un nébuliseur relié à air comprimé. Les souris ont été exposées à un flux continu d&#39;aérosol de LPS dans une boîte en plexiglas pendant 10 minutes, puis 2 min après le conditionnement aérosol a été abandonnée. L&#39;intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire subséquente, suivi par une perfusion de formol a été prochain effectuées, ce qui permet la caractérisation de la p stérileulmonary inflammation. LPS en aérosol génère une inflammation pulmonaire alvéolaire caractérisé par neutrophilie, détecté dans le lavage broncho-alvéolaire et par évaluation histologique. Cette technique peut être mis en place à un faible coût avec quelques appareils, et exige une formation et une expertise minimale. Le système d&#39;exposition peut donc être effectuée systématiquement dans tout laboratoire, avec le potentiel d&#39;améliorer notre compréhension de la pathologie pulmonaire.

Défi d&#39;aérosol P. aeruginosa LPS donne généralement une réponse inflammatoire marqué dans la lumière des voies aériennes et de l&#39;espace alvéolaire, caractérisé par une prédominance de neutrophiles aux deux points de temps précoces et tardifs. Aérosol LPS induit neutrophilie pulmonaire Souris C57BL / 6BY et BALB / c ont été exposées à des aérosols P. aeruginosa LPS ou du véhicule et les neutrophiles ont été dénombrées dans BALF. Le nombre to...

Nous décrivons une méthode pour induire une inflammation pulmonaire neutrophile par défi pour lipopolysaccharide aérosol par nébulisation, pour modéliser une lésion pulmonaire aiguë. En outre, des techniques chirurgicales de base pour l&#39;isolement du poumon, l&#39;intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire sont également décrits.

Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

L'objectif général de cette procédure est de générer une neutrophilie des voies respiratoires constante et reproductible par exposition à du LPS aérosolisé. Cela est réalisé en chargeant d'abord du LPS en suspension dans du sérum physiologique dans un nébuliseur relié à une chambre d'exposition. Ensuite, les souris sont exposées au LPS aérosolisé, puis un lavage broncho-alvéolaire est recueilli et les cellules inflammatoires présentes dans le lavage sont dénombrées.Enfin, le tissu pulmonaire est fixé, puis formolé pour l'incorporation, la coupe et l'analyse immunohistochimique. En définitive, les comptages cellulaires totaux et différentiels du lavage bronchoalvéolaire peuvent être utilisés pour évaluer le recrutement des neutrophiles dans les poumons. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'administration intratrachéale de LPS, sont la distribution homogène du LPS aérosolisé dans l'ensemble des poumons, la facilité de mise en œuvre et la formation minimale requise pour une application réussie. Pour générer un aérosol de LPS en utilisant des EPI appropriés et dans une hotte de sécurité biologique de niveau deux ventilée, commencez pa

a-method-for-generating-pulmonary-neutrophilia-using-aerosolized

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Cette vidéo décrit la procédure de génération d’une poche d’air dans le tissu sous-cutané de souris et de collecte des exsudats inflammatoires en réponse à l’administration de lipopolysaccharides in vivo. Cette vidéo couvre également l’analyse de l’infiltration des neutrophiles dans la poche d’air.

Un modèle murin de poche d’air pour la collecte d’exsudat inflammatoire induit par les lipopolysaccharides

La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

Le présent travail illustre la commodité de l’utilisation de l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et conférer une protection contre la pneumonie pneumococcique aiguë chez la souris.

L&#39;immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour la modélisation de la pneumonie bactérienne chez les souris. Nous décrivons ici un peu coûteux, un procédé rapide et non invasif destiné à induire une pneumonie par aspiration ( par exemple, inhalation) , d'un inoculum bactérien pipeté dans l'oropharynx. méthodes en aval pour l'évaluation de la réponse immunitaire innée pulmonaire sont également détaillées.

Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris

Des souris exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent des exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaire qui sont emballés avec les miARN. À l’aide d’un système de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés dans le liquide BAL perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques et augmenter l’expression des cytokines pro-inflammatoires qui accentuent les lésions pulmonaires.

Lavage broncho-alvéolaire Exosomes en lésion induite par le Lipopolysaccharide septique pulmonaire

Présenté ici est une procédure étape par étape pour induire des dommages aigus de poumon chez les souris par l'instillation intratracheal directe de lipopolysaccharide et pour effectuer l'analyse FACS des échantillons de sang, du fluide de lavage bronchoalveolar, et du tissu de poumon. L'invasivité minimale, la manipulation simple, la bonne reproductibilité, et la titration de la sévérité de la maladie sont des avantages de cette approche.

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.

Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

Ici, nous proposons un protocole pour l’administration intratrachéale de lipopolysaccharides (LPS) via une intubation endotrachéale oropharyngée non invasive. Cette méthode minimise le traumatisme de l’intervention chirurgicale pour l’animal et délivre avec précision le LPS à la trachée, puis aux poumons.

Instillation intratrachéale non invasive de lipopolysaccharides chez la souris

Dans cette étude, une technique d’instillation endotrachéale non invasive a démontré le développement d’AL chez les rats à l’aide d’un laryngoscope basique pour garantir une livraison précise de LPS aux poumons. Le LPS est injecté via un tube endotrachéal à l’aide d’un laryngoscope. L’ampleur de la lésion pulmonaire est évaluée à plusieurs moments.

Administration endotrachéale non invasive de lipopolysaccharide pour induire une lésion pulmonaire aiguë chez les rongeurs

Découvrez une méthode pour induire une neutrophilie pulmonaire par nébulisation de LPS aérosolisé chez la souris. Cette technique permet d'évaluer le recrutement des neutrophiles et d'analyser l'inflammation pulmonaire avec une distribution homogène.

Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide

Explorer plus de vidéos