Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide

L’objectif global de cette procédure est de générer des neutrophilies des voies respiratoires cohérentes et reproductibles par exposition à des LPS en aérosol. Pour ce faire, on charge d’abord du LPS en suspension dans une solution saline dans un nébuliseur relié à une chambre d’exposition. Ensuite, les souris sont exposées au LPS aérosolisé, puis le lavage broncho-alvéolaire est collecté et les cellules inflammatoires du lavage sont énumérées.

Enfin, le tissu pulmonaire est fixé, formellement pour l’enrobage, la section et l’analyse immunohistochimique. En fin de compte, le nombre total et différentiel de cellules du lavage broncho-alvéolaire peut être utilisé pour évaluer le recrutement des neutrophiles dans les poumons. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’administration intratrachéale de LPS sont la répartition uniforme du LPS en aérosol dans les poumons, la facilité de performance et la formation minimale requise pour une application réussie. Pour générer un aérosol de LPS à l’aide d’un EPI approprié et à l’intérieur d’une cagoule ventilée de niveau deux, commencez par insérer une entrée rouge dans un nébuliseur, puis connectez le nébuliseur à l’air ambiant sous pression par la tubulure fournie par le fabricant.

Ensuite, utilisez un filtre à air pour connecter la sortie du nébuliseur à un débitmètre massique, puis connectez le débitmètre massique à une alimentation électrique. Ajustez le débit d’air à cinq litres par minute, en maintenant la pression à une à deux bars, puis retirez le débitmètre massique et déconnectez le flux d’air. Ensuite, connectez la sortie du nébuliseur à un tube de bifurcation de 15,9 millimètres connecté à 2 boîtes en plexiglas de 1 50 x 1 63 par 2 0 de 5 millimètres équipées de couvercles amovibles.

Chaque boîte doit avoir un trou de cinq millimètres sur le côté opposé à l’entrée pour éviter l’accumulation de pression. Placez maintenant jusqu’à cinq souris dans chaque boîte et fermez les couvercles. Ouvrez ensuite le nébuliseur.

Remplissez l’insert avec quatre à huit millilitres de LPS dissous dans une solution saline ou un véhicule salin seul, et reconnectez l’entrée à l’alimentation en air. Laissez l’aérosol s’écouler dans les boîtes en plexiglas fermées en surveillant en permanence les animaux et en vous assurant que l’alimentation en air reste bien fixée à l’entrée du nébuliseur pendant l’aérosolisation. Après 10 minutes, débranchez l’alimentation en air et laissez les animaux dans les boîtes en plexiglas pendant encore deux minutes.

Ouvrez ensuite les couvercles. Laissez l’aérosol se disperser et renvoyez les souris dans leurs cages au point final de l’expérience. Pour chaque animal, à tour de rôle, utilisez d’abord des ciseaux pour faire une seule incision antérieure postérieure afin d’exposer le thorax. Ensuite, soulevez la cage thoracique par l’extrémité antérieure du sternum et percez le diaphragme au point le plus ventral sans couper le tissu pulmonaire.

Ouvrez ensuite la cage thoracique avec deux coupes qui se rejoignent sous la mâchoire dans la direction antérieure postérieure. Une fois la cage thoracique ouverte, utilisez une pince pour l’écarter doucement et coupez la trachée sous le larynx. Maintenant, soulevez la trachée et coupez les ligaments reliant les lobes pulmonaires à la cavité thoracique.

Ensuite, tirez doucement les poumons et la trachée vers le haut et éloignez-les du tissu adipeux et cardiaque, et placez-les sur un morceau de papier d’emballage de seringue. Ensuite, insérez un tube en polyéthylène de 0,965 millimètre dans la trachée et fixez-le avec une ficelle de fil de soie. Attachez également le multi-lobes avec du fil de soie, puis insérez une aiguille de calibre 23 dans le tube en polyéthylène.

Ensuite, pour recueillir le lavage broncho-alvéolaire, utilisez une seringue d’un millilitre pour injecter lentement 250 microlitres de glace appelée PBS stérile dans le lobe unique, et pour tapoter soigneusement les poumons et contre la surface de la paillasse 30 fois, ramenez lentement le liquide dans la seringue et recueillez-le dans un tube après avoir répété la procédure avec 200 microlitres de PBS frais, Placez le lavage broncho-alvéolaire sur de la glace pour une analyse ultérieure. Pour fixer le tissu pulmonaire pour l’analyse histologique, retirez le multi-lobes et enclenchez-le. Congelez-le sur de la glace sèche.

Stockez le lobe à moins 80 degrés Celsius. Pour fixer le tissu pour l’analyse histologique, montez une seringue de 60 millilitres sans piston sur un support métallique et insufflez le lobe unique avec du formol pendant cinq minutes. Débranchez ensuite l’aiguille et tirez sur le fil de soie pour le retirer avec le tube en polyéthylène de la trachée.

Fermer simultanément la trachée et maintenir la pression dans le poumon. Ensuite, immergez le lobe dans Formin pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez le tissu fixé trois fois pendant au moins 20 minutes, à chaque fois avec de l’éthanol à 70 %.

Après avoir intégré le tissu déshydraté dans le film para, coupez le lobe en sections de quatre à cinq microns et colorez les sections avec de l’hématine et de l’eoin pour une évaluation histologique. Le nombre total de cellules dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire des souris exposées à un aérosol généré avec le véhicule seul est généralement d’environ ou moins de 200 000 cellules. Les cellules sont constituées de 95 à 100 % de cellules mononucléées avec seulement quelques lymphocytes et aucun neutrophile.

Des souris ont été confrontées à un milligramme par millilitre d’aérosol. LPS. Cependant, ils présentent une augmentation du nombre total de cellules dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire, généralement supérieur à 500 000 cellules après six heures, les infiltrats cellulaires restant élevés après 24 heures, et avec un profil cellulaire décalé vers une prédominance de neutrophiles. Un profil cellulaire inflammatoire et une neutrophilie pulmonaire similaires sont observés avec une nébulisation de cinq milligrammes par millilitre de LPS.

Des neutrophiles ont été observés dans la sous-muqueuse épithéliale ainsi que dans les espaces entourant les voies respiratoires conductrices et les vaisseaux sanguins après six et 24 heures de provocation LPS, mais ils n’étaient pas contrôlés. Souris traitées à une solution saline. La teneur totale en protéines dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire des souris exposées au LPS est augmentée par rapport aux souris exposées à une solution saline et l’expression des chimiokines c, XCL un et C XCL deux est également augmentée chez les souris exposées au LPS.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’inflammation pulmonaire induite par les LP. Il peut également être appliqué à d’autres modèles de maladies telles que les infections bactériennes ou virales, car la vapeur aérosolisée peut être adaptée pour relever de nombreux défis différents.