Mesure vertébrale présynaptique inhibition chez la souris par la racine dorsale enregistrement potentiel

L'inhibition présynaptique est l'un des mécanismes inhibiteurs les plus puissants dans la moelle épinière. Des modifications pathologiques de l'inhibition présynaptique interviennent dans plusieurs mécanismes de maladies, par exemple la douleur neuropathique et inflammatoire, ainsi que le traitement anormal de la douleur centrale.

Il revêt une importance capitale dans les lésions de la moelle épinière et les troubles du système nerveux central associés à une hyperexcitabilité motrice. Ainsi, lorsqu'on étudie des modèles animaux de ces affections, connaître l'intensité de l'inhibition présynaptique fournit des informations significatives. Nous présentons ici une méthode permettant d'évaluer l'inhibition présynaptique dans un modèle murin.

L'inhibition présynaptique in vivo est médiée par une dépolarisation des afférences primaires, induite par des synapses axo-axoniques GABAergiques sur les fibres sensorielles présynaptiques. L'activation du récepteur GABAA entraîne une augmentation de la conductance au chlorure, provoquant ainsi une dépolarisation des afférences primaires en raison de la distribution ionique locale. Cette dépolarisation bloque la propagation des potentiels d'action vers les terminaisons axonales et réduit leur amplitude, entraînant une diminution de l'entrée de calcium et une réduction de la libération du neurotransmetteur.

Ainsi, les potentiels postsynaptiques excitateurs dans les neurones monosynaptiques peuvent être inhibés sans modification du potentiel de membrane postsynaptique ni de l'excitabilité des neurones, et le potentiel conduit par volume de cette dépolarisation primaire de l'ENT fournit une mesure directe de l'inhibition présynaptique dans la moelle épinière. Ces potentiels peuvent être enregistrés à partir des racines dorsales de la moelle épinière après stimulation, et sont appelés potentiels des racines dorsales. La mesure des potentiels des racines dorsales est bien établie et a été largement utilisée chez les chats, les rats et les grenouilles, mais chez la souris, les enregistrements ont été presque exclusivement réalisés sur des préparations de moelle épinière isolée ex vivo. Nous décrivons ici une méthode permettant d'enregistrer ces potentiels racinaires chez des souris anesthésiées in vivo, offrant ainsi une mesure directe de l'inhibition présynaptique dans l'organisme intact.

Pour l'enregistrement des DRP chez la souris in vivo, le matériel suivant est nécessaire. Des instruments standard pour le sucre, un microscope stéréo, trois manipulateurs manuels pour positionner respectivement l'électrode de stimulation, l'électrode d'enregistrement et l'électrode de référence. En outre, un cadre pour souris et un système de chauffage permettant de contrôler la température corporelle de la souris pendant la stimulation et l'enregistrement, seuls ou simultanés, ou un stimulateur.

Un amplificateur standard et une collecte de données sont nécessaires pour améliorer le rapport signal sur bruit. Lors de l'enregistrement du DRP, des électrodes à section fabriquées sur mesure sont nécessaires pour leur fabrication. Tirer un tube en verre conventionnel à l’aide d’un tireur de micropipettes standard.

Cassez l'extrémité de l'électrode à l'aide d'un lime en diamant pour élargir l'ouverture de l'embout. Polissez l'extrémité avec une torche standard de laboratoire afin de lisser l'embout. Avant de commencer la préparation, anesthésiez l'animal par injection intrapéritonéale de kétales et fixez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique.

Ensuite, vérifiez la profondeur de l'anesthésie en pinçant le membre postérieur de la souris. Commencez la préparation uniquement lorsqu'aucun retrait du membre n'est visible ; la profondeur de l'anesthésie doit être vérifiée de façon répétée pendant l'intervention. Effectuez des injections répétées de kéamine dans le muscle quadriceps postérieur.

Prologer l'anesthésie, surveiller la température corporelle de l'animal à l'aide de la sonde rectale. Pour la préparation de la colonne dorsale. Ouvrir la peau le long de la ligne médiane dorsale.

Détacher la peau du tissu sous-jacent afin de séparer la vertèbre du tissu conjonctif environnant. Effectuer deux incisions sur les deux côtés de la colonne vertébrale et élargir les incisions en écartant les tissus à l’aide du scalpel. Ensuite, retirer les apophyses épineuses S à l’aide d’un petit ciseau à os.

Commencer au niveau lombaire. Passer ensuite au niveau thoracique moyen afin d'éviter le dessèchement de cette plaie opératoire. Placer de petits morceaux de gaze autour de la plaie et les humidifier avec du chlorure de sodium à 0,9 %.

Ensuite, commencez la préparation de la moelle épinière en partant de la région lombaire. Insérez délicatement la pointe du curet osseux dans l'espace situé entre deux vertèbres adjacentes. Prenez particulièrement soin de réduire au maximum la pression appliquée sur la moelle épinière.

Passez aux niveaux thoraciques en maintenant l'humidité de la moelle épinière avec du liquide céphalorachidien artificiel. Répétez cette opération de manière répétitive au cours de toutes les étapes ultérieures. Ouvrez délicatement le duromètre à l’aide d’une aiguille de calibre 30.

Ensuite, desserrer et séparer deux racines adjacentes homolatérales de la colonne vertébrale. Puis couper les racines aussi distalement que possible. Pendant la procédure.

Évitez de tirer excessivement sur les racines, car cela entraverait finalement un enregistrement réussi du PRD. Après avoir positionné l'électrode de référence près de la moelle épinière, approchez la pointe d'une électrode sectionnée à proximité de l'extrémité proximale d'une racine dorsale. Ensuite, placez la racine dorsale au-dessus de l'ouverture de l'électrode de succion.

Ensuite, aspirez la racine dorsale dans l'électrode en appliquant une courte pression négative à l’aide d’une seringue reliée à l’électrode. Puis, remplissez l’électrode avec du LCR tout en appliquant une pression négative continue faible, jusqu’à ce que la solution entoure à la fois la racine dorsale et le fil d’argent chloruré à l’intérieur de l’électrode. Ensuite, relevez la pointe de l’électrode par rapport à la moelle épinière afin qu’aucun pont liquide ne crée de court-circuit dans l’électrode.

Répétez les étapes pour la deuxième racine adjacente ipsilatérale. Une fois les deux électrodes positionnées, commencez l'enregistrement des potentiels de la racine dorsale en stimulant une voie tout en enregistrant depuis l'autre ; augmentez la tension du stimulus jusqu'à des niveaux supramaximaux. Les enregistrements typiques des potentiels de la racine dorsale ressemblent à celui illustré dans le panneau de gauche.

Un court artefact de stimulation est suivi d'une brève déflexion positive et d'une déflexion négative prolongée. La dernière déflexion correspond au potentiel réel de la racine dorsale. Son amplitude peut être calculée par rapport à la ligne de base enregistrée directement avant l'enregistrement du stimulus.

Plusieurs traces provenant d'une paire de racines peuvent présenter des artefacts dus aux mouvements respiratoires et/ou à des interférences de type ECG qui risquent de perturber le PRD enregistré. Après un enregistrement réussi, il est possible d'intervertir le site de stimulation et celui d'enregistrement afin de réaliser un second enregistrement. La méthode d'enregistrement présentée.

Les potentiels racinaires in vivo permettent l'évaluation de l'activité primaire, de l'antipolarisation et de l'animal intact, notamment en combinaison avec des souris génétiquement modifiées. Cette approche peut constituer un outil puissant pour étudier les mécanismes sous-jacents à l'inhibition spinale. L'intégration spinale est essentielle pour la fonction motrice et la perception sensorielle multimodale.

Cette méthode est utile dans les recherches portant sur la douleur, les lésions de la moelle épinière, les lésions des nerfs périphériques et l'inflammation. L'enregistrement du PDR in vivo permet d'analyser les interactions entre l'activité supramédullaire et le PDR. Ceci n'est pas possible avec les préparations de moelle épinière isolée habituellement utilisées pour mesurer le PDR chez la souris.

En principe, l'application d'un médicament à la moelle épinière est possible pendant l'enregistrement. Une application locale par l'intermédiaire de pipettes supplémentaires pourrait améliorer et accélérer le contrôle de la concentration locale du médicament.