Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier la capacité de déformation de différents types de cellules à l’aide d’un simple test basé sur la microfluidique. Ceci est réalisé en fabriquant un dispositif microfluidique poly diméthyl suboxane ou PDMS pour sonder l’échelle de temps du transit cellulaire à travers une séquence de constrictions à l’échelle du micron. Ensuite, le programme d’analyse d’images automatisé est exécuté afin de traiter les vidéos et d’obtenir un histogramme des données de temps de transit.

Les résultats montrent que différents types de cellules présentent des différences dans la capacité de déformation cellulaire en fonction de leur temps de transit à travers une série de constrictions. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que la microscopie à force atomique ou l’aspiration par micro-pipette est que les dispositifs microfluidiques peuvent fonctionner avec succès avec des capacités de débit élevées. D’autres dispositifs microfluidiques peuvent également être utilisés pour tester la déformabilité des cellules.

Nous concevons notre dispositif de manière à ce que les cellules passent par des constrictions séquentielles, une géométrie courante dans des contextes physiologiques tels que le lit capillaire pulmonaire. Pour commencer, concevez le dispositif microfluidique en sélectionnant la largeur des canaux du réseau de constriction à environ 30 à 50 % du diamètre moyen de la cellule et la hauteur du canal à au moins 50 % du diamètre de la cellule. Inclure un filtre aux ports d’entrée pour éliminer les débris et désagréger les grappes de cellules.

Avant de commencer l’expérience, fabriquez le master de l’appareil en utilisant des techniques standard de micro-usinage lithographique. Vérifiez la hauteur des entités du motif à l’aide d’un profilomètre. Ensuite, réparez la source d’air pour un écoulement sous pression à l’aide d’un réservoir d’air comprimé et d’une séquence de régulateurs d’air et de raccords.

Installez d’abord un réservoir d’alimentation en air et un régulateur manuel. Ensuite, installez un régulateur de pression à commande électronique en ligne avec le régulateur manuel. Utilisez le code simple écrit dans LabVIEW pour saisir la pression souhaitée.

Le convertisseur électropneumatique utilise une boucle de rétroaction interne pour ajuster la pression de sortie de la vanne afin qu’elle corresponde à la pression spécifiée à travers le dispositif microfluidique. Installez une chambre pressurisée pour piloter l’écoulement de la suspension cellulaire en assemblant une chambre de suspension cellulaire à partir d’un tube de cytomètre en flux standard et d’un capuchon usiné qui crée un joint étanche à la pression sur le tube. Le capuchon de la chambre de pression contient deux orifices, une entrée qui se connecte au réservoir d’air comprimé et une sortie par laquelle les cellules s’écoulent de la chambre pressurisée dans l’appareil.

Ensuite, installez un microscope inversé équipé d’une caméra qui a un taux d’acquisition d’au moins 100 images par seconde. Pour capturer des images des cellules circulant à travers le réseau de constriction, préparez une solution mère de tensioactif dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS, car l’ajout d’une petite quantité de tensioactif à la solution de milieu cellulaire aidera à minimiser l’adhésion cellulaire aux parois du PDMS. Pour fabriquer le bloc PDMS avec des canaux microfluidiques, ajoutez un gramme d’agent de durcissement à 10 grammes de base PDMS et mélangez soigneusement.

Versez le mélange sur l’appareil. Maîtrisez Degas dans une cloche avec le vide appliqué jusqu’à ce que les bulles piégées disparaissent, ou pendant environ 10 à 20 minutes. Passé ce délai, il peut encore y avoir des bulles au niveau de l’interface PDMS AIR, ce qui est normal.

Ceux-ci se dissipent généralement pendant la cuisson. Faites ensuite cuire l’appareil Degas à 65 degrés Celsius pendant quatre heures après le refroidissement de l’appareil. Retirez les dispositifs microfluidiques du moule maître.

Commencez par soulever doucement un coin de l’appareil. Pelage lent et doux par opposition au soulèvement Le bloc DMS vers le haut réduit les contraintes sur le PDMS et le maître Coupez des dispositifs microfluidiques individuels dans le bloc PDMS avec une lame de rasoir et retirez l’appareil du maître Perforez des trous dans le dispositif PDMS pour créer des ports de connexion pour l’accès entre le tube et les microcanaux. Créez des trous du côté du canal jusqu’à l’extérieur de l’appareil à l’aide d’un poinçon de biopsie.

Rincez l’appareil PDMS avec de l’isopropanol pour enlever la poussière et loger les morceaux de PDMS. Assurez-vous que les trous perforés sont exempts de débris en dirigeant un flux constant d’isopropanol pur à partir d’une bouteille compressible à travers les trous. Séchez au sèche-cheveux à l’air filtré.

Nettoyez le support en verre en le rinçant au méthanol. Ensuite, séchez-le à l’air filtré et placez-le sur une plaque chauffante à 200 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes pour vous assurer que le verre est complètement propre et sec avant le traitement au plasma. Comme détaillé dans le protocole textuel, inspectez le dispositif microfluidique au microscope.

Assurez-vous que les canaux ne sont pas repliés ou cassés, et que les trous d’entrée et de sortie se connectent directement aux canaux de l’appareil à l’aide d’un objectif à faible puissance. Placez la suspension cellulaire dans un tube de cytomètre en flux et connectez-vous au capuchon de pression avant de connecter le tube au dispositif microfluidique, ajustez la pression à environ 14 à 21 kilopascals et rincez jusqu’à ce que la suspension cellulaire sorte de l’extrémité du tube. Ensuite, placez l’appareil sur une surface plane pour insérer le tube dans l’entrée de l’appareil.

Comme la lamelle de protection en verre collée à la face inférieure du dispositif PDMS est fragile. Insérez l’extrémité du tube contenant la suspension cellulaire dans l’entrée de l’appareil. Insérez ensuite un morceau de tube dans l’orifice de sortie et acheminez-le dans un tube vide pour la collecte des déchets, tel qu’un tube Falcon vide collé sur le côté de la platine du microscope.

Augmentez doucement la pression jusqu’à environ 28 kilopascals ou jusqu’à ce que les cellules s’écoulent dans les canaux. Positionnez l’appareil de manière à ce que plusieurs canaux soient dans le champ de vision et perpendiculaires au bas de l’écran. Pour commencer l’analyse des données, ouvrez le fichier du script maître m et exécutez le programme.

Sélectionnez la première vidéo à analyser dans la fenêtre de l’Explorateur Windows qui s’affiche. Spécifiez la fréquence d’images de la vidéo sélectionnée et appuyez sur Entrée. Une figure s’affiche pour inviter l’utilisateur à sélectionner une fenêtre de recadrage rectangulaire.

Pour la première vidéo, sélectionnez une fenêtre qui englobe tous les canaux de gauche à droite et qui coupe les canaux juste au-dessus de la première bulle du réseau de canaux. En haut et en bas, sélectionnez les régions de constriction de l’image recadrée. L’algorithme affiche la segmentation des cellules pour les 50 premières images de chaque vidéo.

Surveillez de près l’image en haut à gauche pour déterminer si l’algorithme localise avec précision les cellules. Une image agrandie est superposée à la vidéo source. Pour montrer l’emplacement des cellules identifiées, sélectionnez la vidéo suivante à traiter dans la fenêtre de l’Explorateur Windows.

L’algorithme se répète. Pour chaque vidéo sélectionnée, sélectionnez Annuler. Une fois que toutes les vidéos souhaitées ont été ajoutées via la fenêtre de l’Explorateur Windows pour indiquer que la fonction que la liste des vidéos est complète, les résultats représentatifs pour le temps de transit des cellules HL 60 et de type neutrophile HL 60 montrent l’échelle de temps pour qu’une seule cellule transite à travers une série de transits de constrictions.

Le temps est mesuré pour une population de cellules individuelles à chaque constriction de sept micromètres dans une série de sept constrictions. À une pression motrice de 28 kilopascals, HL 60 cellules obstruent temporairement la première constriction pendant un temps médian de 9,3 millisecondes avant de passer par les constrictions suivantes. En revanche, les cellules HL 60 de type neutrophile n’obstruent la première constriction que pendant 4,3 millisecondes avant l’emballage.

Une fois traversées, les premières cellules de constriction transitent plus rapidement à travers les constrictions restantes de deux à sept, avec un temps de transit médian de 4,0 millisecondes pour les cellules HL 60 et de 3,3 millisecondes pour les cellules de type neutrophile. En comparant le temps de transit entre les populations cellulaires, les différences d’informabilité cellulaire peuvent être révélées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la capacité de déformation de différents types de cellules à l’aide du test microfluidique simple.

Ici, l’écoulement entraîné par la pression est utilisé pour entraîner les cellules à travers des canaux microfluidiques, ce qui permet de tester la déformation et la relaxation des cellules individuelles.