Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

L'objectif général de cette procédure est de garantir une section complète de la moelle épinière chez le poisson-zèbre larvaire au moyen d'une méthode relativement hautement performante et reproductible, tout en maximisant la survie. Cela est réalisé en accouplant d'abord des adultes de génotype approprié et en effectuant les criblages nécessaires. La deuxième étape consiste à élever les embryons jusqu'à cinq jours après la fécondation.

Ensuite, effectuez la transection à l’aide d’une pipette de micro-injection biseautée. Enfin, les poissons blessés sont laissés en récupération dans un milieu traité aux antibiotiques jusqu’à la fin de l’expérience. En définitive, la microscopie en immunofluorescence est utilisée pour montrer la réponse des progéniteurs neuronaux à la lésion.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles mises au point par les laboratoires Becker et Fetcher, incluent un plus grand nombre d'animaux à étudier, un temps de récupération plus court et l'utilisation d'outils génétiques non disponibles autrement chez le poisson zèbre adulte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération, comme la réponse des progéniteurs neuronaux à une lésion. Commencez les préparatifs en fabriquant des plaques chirurgicales à l'aide de boîtes de Pétri de 60 millimètres et d'un kit d'élastomère de silicone Cell Guard 180 4.

Suivre les instructions du fabricant. Remplir les boîtes, au maximum à moitié, et les laisser polymériser. Ensuite, conserver les boîtes couvertes à température ambiante.

Ensuite, fabriquez des micropipettes en chauffant et tirant un tube capillaire en borosilicate à paroi fine dans un tireur de micropipettes, en utilisant les mêmes paramètres que ceux employés pour la fabrication d'aiguilles de microinjection sous un microscope stéréo. Utilisez une pince pour casser l'extrémité de la micropipette afin d'obtenir un diamètre d'environ 200 microns. Puis, affûtez le bord cassé à l'aide d'un microaffûteur, d'abord à 35 degrés, puis effectuez un second affûtage à 25 degrés lorsque le bruit du meulage cesse.

Examinez au microscope stéréoscopique pour vous assurer que la pointe est fine et lisse. L'utilisation d'une pointe trop large entraîne généralement une mortalité plus élevée en raison de la probabilité accrue de sectionner l'aorte dorsale. Une pointe trop étroite a tendance à glisser sur la peau au lieu de couper le tissu. Conservez les micropipettes correctement biseautées dans une boîte de Pétri sur une petite quantité d'argile sept jours avant la chirurgie.

Préparer des aquariums d'accouplement contenant des mâles et des femelles spr. Les poissons collectent les embryons fécondés le lendemain matin, trois heures après l'allumage des lumières. Pour garantir un rendement maximal.

Si l'on utilise une lignée transgénique rapporteuse présentant des génotypes mixtes, déposer 100 embryons par boîte, puis incuber les boîtes à 28,5 degrés Celsius. Si l'on utilise une lignée rapporteuse, analyser les embryons pour détecter l'expression fluorescente à 48 heures après la fécondation.

Laisser les embryons fluorescents se développer à 28,5 degrés Celsius jusqu'au stade larvaire ou à cinq jours post-fécondation. Préparer la plaque chirurgicale en recouvrant la grille cellulaire avec de l'E2 et du sulfate de gentamicine à 10 milligrammes par litre, ainsi que du trica. En outre, préparer un plat de récupération en ajoutant 25 millilitres d'E2 et de sulfate de gentamicine à une boîte de Pétri de 100 millimètres.

L'étape suivante consiste à préparer un manche de scalpel en fixant ensemble trois cotons-tiges à l'aide de ruban adhésif. Cela forme un outil triangulaire comportant trois rainures. Ensuite, fixez la micropipette préparée sur les cotons-tiges en la plaçant dans l'une des rainures à l'aide de ruban adhésif afin de terminer le scalpel, puis mettez la micropipette de côté jusqu'à ce qu'elle soit nécessaire.

Commencez la chirurgie en anesthésiant une plaque de 25 larves à la fois. Avec la trica, les poissons sont suffisamment anesthésiés lorsqu'ils ne présentent plus de réaction au toucher. Transférez les larves vers une plaque de chirurgie et placez la plaque sous un microscope stéréo.

Avec le grossissement maximal, faites pivoter une larve afin qu'elle repose sur le côté, son dos étant le plus proche de la main tenant le scalpel. Positionnez la pince de manière à ce qu'elle repose sur la garde cellulaire. Inclinez-la sur la largeur de la larve, en appuyant le scalpel en verre contre l'un des bras de la pince.

Couper sur la face latérale dorsale des larves au niveau du pore anal. Veiller à ne pas dépasser le bord ventral de la moelle épinière. Puis tourner le scalpel pour sectionner la moelle épinière.

La torsion requise est généralement bien inférieure à 90 degrés. Répétez la transection de la moelle épinière avec les larves restantes. Une fois la chirurgie terminée pour le lot de larves, utilisez une pipette postérieure et une pompe à pipeter pour transférer les animaux blessés vers la plaque de récupération.

Pour éliminer l'anesthésie, veillez à prélever d'abord la tête ou la queue de la larve lors du transfert. N'irritez pas le site de la lésion en pliant les larves une fois l'anesthésie dissipée. Transférez les larves blessées depuis la plaque de récupération vers des plaques de 100 millimètres remplies de 25 millilitres d'E deux et de sulfate de gentamicine, à une densité de 25 larves par plaque.

Ensuite, les placer dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pendant la cicatrisation de la plaie. Vérifier les boîtes quotidiennement. Retirer les animaux malades ou morts.

Ne changez pas le milieu tant que les cocons de protozoaires d'eau douce ne sont pas visibles dans le milieu. Lors du changement de milieu, n'ajoutez pas le poisson dans une nouvelle plaque. Au lieu de cela, retirez autant de milieu que possible et inondez la même plaque avec du nouveau milieu.

Répétez le changement de milieu selon les besoins pour réduire la population de coops. Nourrissez les larves quotidiennement avec une petite quantité d'aliment en poudre pour alevins. Un poisson zèbre avec une moelle épinière complètement sectionnée est montré ici au jour un.

Après la lésion, la GFP est exprimée dans tous les neurones, et la flèche jaune indique le site de la lésion. Un poisson zèbre présentant une moelle épinière complètement sectionnée est montré ici à trois jours post-lésion. Ce poisson zèbre marqué UCD fixé montre une moelle épinière complètement sectionnée.

La flèche jaune identifie à nouveau le site de la lésion. En revanche, la région contiguë de marquage des neurones le long du bord ventral de la moelle épinière. Ce poisson zèbre fixé, trois jours après la lésion, indique une section incomplète.

Une fois maîtrisée, cette technique permet de traiter 300 larves par heure.