Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

L’objectif global de cette procédure est d’assurer une section complète de la moelle épinière chez les larves de poisson-zèbre via une méthode relativement élevée et reproductible tout en maximisant la survie. Pour ce faire, il faut d’abord accoupler des adultes du génotype approprié et effectuer un dépistage au besoin. La deuxième étape consiste à élever les embryons jusqu’à cinq jours après la fécondation.

Ensuite, effectuez la transsection avec une pipette de micro-injection biseautée. Enfin, les poissons blessés sont laissés se rétablir dans un milieu traité aux antibiotiques jusqu’à la fin de l’expérience. En fin de compte, la microscopie à immunofluorescence est utilisée pour montrer la réponse des progéniteurs neuraux aux blessures.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme celles mises au point par les laboratoires Becker et Fetcher comprennent un plus grand nombre d’animaux à étudier, un temps de récupération plus court et l’utilisation d’outils génétiques qui ne sont pas disponibles chez le poisson-zèbre adulte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération, telles que la réponse du progéniteur neural aux blessures. Commencez les préparatifs en fabriquant des plaques chirurgicales à l’aide de boîtes de Pétri de 60 millimètres et d’un kit d’élastomère de silicone 180 4.

En suivant les instructions du fabricant. Remplissez les plats, pas plus qu’à moitié pleins et laissez-les polymériser. Conservez ensuite la vaisselle couverte à température ambiante.

Ensuite, fabriquez des micro-pipettes en chauffant et en tirant un tube capillaire en bisilicate à paroi mince dans une micro-pipette polaire, en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour la fabrication d’aiguilles de micro-injection sous un microscope de dissection. À l’aide d’une pince, on peut détacher l’extrémité de la micropipette à environ 200 microns de diamètre. Ensuite, biseautez le bord cassé avec un micro-broyeur initialement à 35 degrés, suivi d’un second biseautage à 25 degrés lorsque le bruit de meulage cesse.

Vérifiez sous une lunette de dissection pour vous assurer que la pointe est tranchante et lisse. L’utilisation d’une pointe trop large a tendance à entraîner un nombre plus élevé de décès en raison de la probabilité accrue d’entailler l’aorte dorsale. Alors qu’une pointe trop étroite a tendance à dévier de la peau plutôt que de couper le tissu, conservez les micro-pipettes correctement biseautées dans une boîte de Pétri sur une petite quantité d’argile sept jours avant l’opération.

Mettez en place des bassins d’accouplement de mâles et de femelles spr. Les poissons collectent les embryons fécondés le lendemain matin, trois heures après l’allumage des lumières. Pour assurer un rendement maximal.

Si vous utilisez une lignée déclarante transgénique avec des génotypes mixtes, placez 100 embryons par plaque, incubez les plaques à 28,5 degrés Celsius. Si vous utilisez une ligne rapporteure, dépister l’expression fluorescente des embryons à 48 heures. Après la fertilisation.

Laissez les embryons fluorescents mûrir à 28,5 degrés Celsius lorsque les larves ou cinq jours après la fécondation. Préparez la plaque chirurgicale en couvrant le garde cellulaire avec E deux et 10 milligrammes par litre, du sulfate de gentamicine et du trica. De plus, préparez une boîte de récupération en ajoutant 25 millilitres de E deux et de sulfate de gentamycine dans une boîte de Pétri de 100 millimètres.

L’étape suivante consiste à préparer un manche de scalpel en collant ensemble trois écouvillons. Cela forme un outil triangulaire à trois rainures. Ensuite, montez la micro-pipette préparée sur les écouvillons en la collant dans l’une des rainures pour compléter le scalpel, placez la micro-pipette de côté jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Commencez la chirurgie en anesthésiant une plaque de 25 larves à la fois. Avec le trica, les poissons sont suffisamment anesthésiés lorsqu’ils ne présentent plus de réponse tactile. Transférez les larves sur une plaque chirurgicale et placez la plaque sous un microscope à dissection.

Sous le grossissement maximal, faites pivoter une larve de manière à ce qu’elle soit couchée sur le côté, le dos le plus proche de la main qui tient le scalpel. Positionnez les pinces de manière à ce qu’elles reposent sur le gardien de cellule. Incliné sur la largeur des larves, calant le scalpel de verre contre l’un des bras de la pince.

Coupez la face latérale dorsale des larves au niveau du pore anal. Veiller à ne pas couper au-delà du bord ventral du cordon d’enfilage. Tournez ensuite le scalpel pour sectionner la moelle épinière.

La torsion requise est généralement bien inférieure à 90 degrés. Répétez la section de la moelle épinière avec les larves restantes. Une fois l’opération sur le lot de larves terminée, utilisez une pipette postérieure et une pompe à pipette pour transférer les animaux blessés sur la plaque de récupération.

Pour éliminer l’anesthésie, assurez-vous de recueillir la tête ou la queue de la larve en premier pendant le transfert. Ne stressez pas le site de la blessure en pliant les larves une fois l’anesthésie dissipée. Transférez les larves blessées de la plaque de récupération vers les plaques de 100 millimètres remplies de 25 millilitres de E deux et de sulfate de gentamycine à une densité de 25 larves par plaque.

Ensuite, placez-les dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pendant que la plaie guérit. Vérifiez les plaques tous les jours. Enlever tous les animaux malades ou morts.

Ne changez pas de média tant que les poulaillers de protozoaires d’eau douce ne sont pas visibles dans le média. Lors du changement de support, ne transférez pas le poisson dans une nouvelle assiette. Au lieu de cela, retirez autant de support que possible et inondez la même plaque avec de nouveaux supports.

Répétez le changement de milieu si nécessaire pour réduire la population des poulaillers. Nourrissez les larves quotidiennement avec une petite quantité de nourriture pour alevins en poudre. Un poisson zèbre avec une moelle épinière complètement transectée est montré ici à un jour.

Après la lésion, la GFP est exprimée dans tous les neurones, et la flèche jaune identifie le site de la lésion. Un poisson zèbre avec une moelle épinière complètement transectée est montré ici trois jours après la blessure et trois jours après la blessure. Ce poisson zèbre fixe marqué UCD montre une moelle épinière complètement transectée.

La flèche jaune identifie à nouveau le site de la blessure. En revanche, la région contiguë de marquage des neurones le long du bord ventral de la moelle épinière. Dans les trois jours suivant la blessure, le poisson zèbre fixe indique une transition incomplète.

Une fois maîtrisées, 300 larves par heure peuvent être traitées à l’aide de cette technique.