Name: Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Découvrez l'expression transitoire de gènes chez la souris par livraison hydrodynamique de gènes. Cette méthode utilise de l'ADN nu pour minimiser la réponse inflammatoire et analyser la fonction des protéines in vivo.

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Nous remercions Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) pour d&#39;abord nous enseigner la technique HGD et le Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) pour son orientation permanente dans divers aspects de la technologie. Ce travail a été financé par Hunter College, CUNY fonds de démarrage et d&#39;attribution NSF pain IOS-1249166. Nous remercions la subvention d&#39;appui NYULMC histopathologie base NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 pour l&#39;histologie sur des foies de souris.

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de Hunter College, City University de New York. Une. Préparation d&#39;ADN plasmidique sans endotoxine <ol><li> Choisir une colonie unique de bactéries contenant le gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression de mammifère à partir d&#39;une plaque sélective fraîchement striée. </li><li> Suivez les recommandations contenues dans le manuel d&#39;un kit de purification de plasmide disponible dans le commerce sans endotoxine des bactéries croissance et la récolte. </li><li> Purifier le plasmide ADN libre à l&#39;endotoxine à partir de cellules bactériennes en suivant le protocole du kit de purification de plasmide exempt d&#39;endotoxine disponibles dans le commerce. </li><li> Utilisez les articles en plastique sans endotoxine et manipuler l&#39;ADN avec soin pour s&#39;assurer que l&#39;endotoxine n&#39;est pas réintroduite dans l&#39;échantillon d&#39;ADN après l&#39;étape d&#39;élimination. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN plasmidique exempt d&#39;endotoxine par la détermination de son absorbance à 260 nm en utilisant un micro volume spectrophotomètre UV telle que décrite ci-dessous ou à une norme, spectrophotomètre base cuvette. <ol><li> Nettoyer les surfaces optiques inférieures et supérieures du système de retenue d&#39;échantillon du spectrophotomètre micro comme suit. 1 ul d&#39;eau désionisée propre sur le système optique inférieur. Fermez le bras de levier et appuyez dessus à quelques reprises pour baigner le système optique supérieure, alors levier d&#39;ouverture et essuyer avec un tissu. </li><li> Ouvrez le logiciel de micro spectrophotomètre et sélectionner le module d&#39;acides nucléiques. </li><li> Placez 1 pi d&#39;eau déminéralisée propre sur le système optique inférieur, le bras de levier et sélectionnez &quot;initialiser&quot; à partir du logiciel de programme. Une fois l&#39;initialisation surfaces complètes, propres à la fois optiques avec un tissu .. </li><li> Effectuer mesure à blanc en chargeant 1 pl de tampon TE exempt d&#39;endotoxine (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) et en sélectionnant &quot;vide&quot; à partir du logiciel de programme. Une fois la mesure vide est fait, nettoyer les surfaces optiques à la fois avec untissu. </li><li> Effectuer une mesure de l&#39;échantillon en chargeant 1 ul de l&#39;échantillon et en sélectionnant l&#39;ADN exempt d&#39;endotoxine &quot;mesure&quot; à partir du logiciel de programme. On enregistre la concentration de l&#39;ADN. Évaluer la pureté de l&#39;ADN par l&#39;enregistrement du rapport d&#39;absorbance 260/280 nm qui apparaît sur l&#39;écran. Etant donné que l&#39;utilisation d&#39;ADN pur (260/280 du rapport de 1,8) pour le MH est hautement souhaitable, éviter d&#39;utiliser un échantillon d&#39;ADN avec un rapport de 260/280 en dessous de 1,7. Une fois la mesure terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un tissu. </li></ol></li></ol> 2. Pesée de souris <ol><li> Mark souris dans un approprié de manière à la souche. Remarque: le marquage de la queue n&#39;est pas recommandé pour cette procédure. <ol><li> Espèces de souris Marquer ayant fourrure blanche (par exemple Swiss Webster) sur le dos avec un marqueur noir. Réappliquer marques au fil du temps si nécessaire. </li><li> Espèces Mark souris qui ont une fourrure noire (par exemple C57BL / 6) à l&#39;oreille poinçonnage plusieurs jours à l&#39;avance. </li></ol></li><li> Peser souris individually en les plaçant dans un plateau de pesée des animaux ou seau doucement placé sur une balance de laboratoire numérique. Noter le poids de chaque souris utilisée dans l&#39;expérience, le jour de l&#39;expérience. </li></ol> 3. Préparation des seringues <ol><li> Préparation du mélange d&#39;injection <ol><li> Calcul de la quantité d&#39;ADN nécessaire en supposant 5-50 ug d&#39;ADN plasmidique exempt d&#39;endotoxine pour l&#39;injection de chaque souris. <ol><li> Déterminer la quantité optimale d&#39;ADN de plasmide expérimentalement. </li><li> Lors de la détermination de la quantité d&#39;ADN nécessaire, assumer injection d&#39;une souris supplémentaire par groupe, comme le chargement correct des seringues, il faudra un certain mélange d&#39;injection supplémentaire. Pour aider les calculs, prenons l&#39;exemple suivant: injecter 4 souris expérimentales et 4 contrôle, chaque 25 g pesage, avec 50 ug d&#39;ADN plasmidique par la souris. Pour déterminer la quantité d&#39;ADN nécessaire dans ce cas, calculer avec 5 souris par groupe: 5 x 50 pg = 250 pg d&#39;ADN nécessaires pour chaque groupe. </li></ol></li><li> Déterminer la quantité de solution saline (chlorure de sodium à 0,9%) nécessaire en supposant 10% de poids de corps pour l&#39;injection de chaque souris. <ol><li> Selon l&#39;exemple ci-dessus, chaque injection de 25 g de souris avec 50 ug d&#39;ADN plasmidique dans 2,5 ml de solution saline (2,5 g de liquide). </li><li> Pour déterminer la quantité de solution saline nécessaire pour tout un groupe de souris, supposons injection d&#39;une souris supplémentaire par groupe pour permettre le chargement correct des seringues. Compte tenu de l&#39;expérience donnée, calculer la quantité de solution saline nécessaire pour 5 souris dans chaque groupe: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solution saline pour chaque groupe (ou 25 ml au total). Remarque: si des souris d&#39;un même groupe ne sont pas le même poids (différence de plus de 10% du poids corporel), à préparer l&#39;injection se mélange séparément. </li></ol></li><li> Utiliser, une solution saline stérile sans conservateur et sans endotoxine qui a été approuvé pour l&#39;usage humain, en 10 ml, des flacons à usage multiple. </li><li> En utilisant une aiguille de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) fixé à un embout de type luer-lock d&#39;une seringue de 20 ml,retirer le liquide à partir de flacons de sérum physiologique et de vider la seringue dans un tube conique de 50 ml. Pour aider pipetage précise de solution saline au cours de la préparation des mélanges d&#39;injection ADN-solution saline, une solution saline recueillir plus que nécessaire pour l&#39;injection de toutes les souris dans l&#39;expérience. Pour l&#39;expérience ci-dessus, retirer saline de 3, flacons de 10 ml (soit un total d&#39;environ 30 ml), même si le montant calculé de solution saline nécessaire pour l&#39;expérience est à seulement 25 ml. </li><li> Introduire à la pipette la quantité calculée d&#39;ADN dans un tube conique de 50 ml différente. Prenez soin de ne pas toucher le côté du tube avec le corps de la pipette pour éviter l&#39;introduction de l&#39;endotoxine. Selon l&#39;exemple, pipeter 250 ug de contrôle et 250 pg d&#39;ADN de plasmide expérimentale dans des tubes coniques distinctes. </li><li> Ajouter la quantité nécessaire de solution saline à l&#39;ADN en utilisant une pipette sérologique. Compte tenu de l&#39;expérience de l&#39;échantillon, la pipette 12,5 ml de sérum physiologique à chacun des mélanges maîtres (expérimental et de contrôle). </li><li> Autoriser toutes les solutions pour atteindrela température ambiante avant l&#39;injection. </li></ol></li><li> Préparation des seringues <ol><li> Pour chaque souris, remplir un, 3 ml, de Luer-Lok seringue stérile avec la composition de l&#39;ADN en utilisant une solution saline, une aiguille stérile de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm). Prenez soin d&#39;éviter les bulles d&#39;air. Évitez d&#39;utiliser des seringues de volume plus élevé que le taux d&#39;injection de flux ne peut pas être contrôlée très bien, et il est difficile de manipuler les grandes seringues dans une main. Éjecter tout ADN-saline mélange en excès dans le tube conique, comme cela peut être réutilisé. </li><li> Mettez l&#39;aiguille, une aiguille stérile de calibre 27. Remplissez l&#39;aiguille avec le liquide complètement sans introduire de bulles d&#39;air. Ajuster le volume du mélange d&#39;ADN-une solution saline telle que calculée sur la base du poids de la souris. </li><li> Ne pas laisser l&#39;aiguille non plafonné de toucher n&#39;importe quelle surface non stérile. Si nécessaire, les aiguilles peuvent être re-plafonnés en utilisant la technique d&#39;une seule main: placer le bouchon sur une surface plane, insérer l&#39;aiguille sans avoir à tenir le cap avec l&#39;autre main et appuyez sur l&#39;aiguille plafonnéecontre un objet dur pour fixer le capuchon sur l&#39;aiguille. Les seringues sont maintenant prêts pour les injections de queue veineuse. </li></ol></li></ol> 4. Livraison d&#39;ADN hydrodynamique <ol><li> A noter que les souris anesthésiants peuvent réduire la viabilité. Évitez d&#39;effectuer des DHG dans une salle qui est trop froid, car cela permettra également de réduire la viabilité. Si la pièce a une température ambiante de 20 ° C ou si vous utilisez l&#39;anesthésie, placez la souris sur un coussin chauffant à 37 ° C procédure de poste pour éviter la perte de tous les animaux. Si vous utilisez l&#39;anesthésie, veiller à ce que la bouche et le nez de la souris sont alors dégagée sur la garniture de la chaleur et d&#39;observer la souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère entièrement. Ne pas retenir la nourriture ou de l&#39;eau de la souris avant HGD. </li><li> Réchauffer les souris à dilater les vaisseaux sanguins. <ol><li> Placer la cage de la souris (avec literie incluse) sur un tapis de chaleur pendant 5 minutes pour que la température de la litière est d&#39;environ 38 à 39 ° C. La température doit être suffisamment bas pour maintenir les souris sur le tapis de la chaleur pour unpériode prolongée. </li><li> Sinon, placez la souris dans un dispositif de retenue d&#39;accès dorsal avec retenue minimale. Réchauffez la queue de la souris pendant 1 min en maintenant doucement avec un morceau de gaze humidifiée à l&#39;eau tiède. Laisser la souris pour repositionner, si nécessaire. Essuyez la queue avec un mouchoir pour sécher. </li><li> En variante, souris chaude en plaçant la cage sous une lampe chauffante pendant pas plus de 2 min. Si vous utilisez une lampe de chaleur, faire preuve de prudence pour éviter la surchauffe de la souris. </li></ol></li><li> Injection veine de la queue de grand volume <ol><li> Immobiliser un accès de contention dorsale sur une surface plane par un ruban de laboratoire. </li><li> Tenant par la queue, placez la souris doucement dans le dispositif de retenue et insérer la fiche. Utilisez le moins de retenue que nécessaire pour que la queue immobilisée. Assurez-vous que la souris respire librement. </li><li> Si la souris est en détresse à tout moment de la procédure, retirez la souris du dispositif de retenue immédiatement et laisser reposer. </li><li> Placez la souris pourl&#39;une des veines caudales latérale est visible. Repérez les veines caudales latérales par la recherche vers le bas à l&#39;arrière de la souris: la ligne rouge qui dans le milieu de la queue est une artère, tandis que les lignes bleues de chaque côté de la queue sont les veines caudales latérales. </li><li> Essuyez la queue de la souris à fond avec un tampon imbibé d&#39;alcool. </li><li> Avec la main non injectables, tenir la queue bien entre l&#39;index et le majeur ainsi que la queue passe sous l&#39;index, sur le milieu et troisième doigts et sous le petit doigt. Laisser le pouce reste libre de se déplacer. (Figure 1A) </li><li> De l&#39;autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Laisser la surface de sécher. </li><li> Prenez la seringue chargé de l&#39;injection à la main et en le tenant par le canon entre le pouce et les quatre autres chiffres. Ne tenez pas sur le piston. </li><li> Placer la seringue parallèlement à la queue avec le pointage de l&#39;aiguille en direction du corps de la souris etle biseau (arête oblique) de l&#39;aiguille vers le haut. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans la veine de la queue. Procéder à l&#39;injection que si la veine est correctement placé, ce qui est évident à partir de l&#39;aiguille coulissant dans aucune résistance. Notez que la profondeur d&#39;insertion de l&#39;aiguille est une question de préférence personnelle cependant, l&#39;insertion complète n&#39;est pas recommandée en raison du risque accru de cisaillement de la veine. Évitez de déplacer l&#39;aiguille. </li><li> Avec le pouce de la main de la queue-tenant, fermer sur le moyeu de l&#39;aiguille et appuyez sur moyeu contre la queue pour maintenir l&#39;aiguille en position. Ne pas appliquer de pression extrême et ne tient pas sur l&#39;arbre de l&#39;aiguille, car ceux-ci entraver l&#39;écoulement du liquide dans la veine. Tenez la queue avec l&#39;index de façon lâche à ce point afin de ne pas entraver l&#39;injection (figure 1A). </li><li> Re-positionner la main une seringue de telle façon que l&#39;index et le majeur tiennent sur ​​la bride et le pouce est à l&#39;extrémité du piston (Figure 1A). </li><li> Appuyez sur le piston en un, un mouvement continu et injecter la totalité du volume de liquide dans 6-8 sec. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la veine et arrêter le saignement en appliquant une légère pression sur la queue avec un mouchoir. </li><li> Retirez la souris de la contention et le lieu souris dans une cage de récupération placé sur le dessus d&#39;un coussin chauffant (literie devrait être 37-38 ° C). Si la chambre d&#39;injection est froid, cette étape est essentielle pour la survie de la souris. Tenez la queue de la souris jusqu&#39;à ce que le saignement s&#39;arrête complètement. </li><li> Observez la souris pendant 1 heure après la livraison de l&#39;ADN hydrodynamique. Une période initiale de halètement et l&#39;immobilité est normal en raison de l&#39;arythmie temporaire causée par HGD mais assurez-vous que la souris montre des signes de reprise dans environ 5 min. Si la respiration de la souris devient extrêmement faible, masser doucement l&#39;abdomen de la souris pour faciliter la respiration. A noter que le taux de recouvrement peut être légèrement influencée par la souche de souris utilisée. </li><li> la souris de retourau logement cage et veiller à ce que la souris a une offre abondante de nourriture et d&#39;eau. </li></ol></li><li> Injection veine de la queue de grand volume en utilisant une position de la main de remplacement <ol><li> Placer la souris dans le dispositif de retenue et se préparer pour injection en suivant les étapes 4.3.1 4.3.5 à travers, comme décrit précédemment. </li><li> Reste la main non-injection sur une surface plane avec quatre doigts pliés à un angle de quatre-vingt-degré. Les doigts (tous sauf le pouce) devraient reposer sur le dessus de l&#39;autre, la création d&#39;une plate-forme. Tenez la queue de la souris entre le pouce et le doigt de pointage (figure 1B). </li><li> De l&#39;autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Laisser la surface de sécher. </li><li> Prenez la seringue avec l&#39;injection à la main et la tenir par la bride et l&#39;extrémité du piston, prête pour l&#39;injection. </li><li> Terminez la procédure en suivant ce protocole de l&#39;étape 4.3.9 à l&#39;étape 4.3.17, comme décrit précédemment. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Quand elle est réalisée correctement, HGD est un moyen remarquablement efficace et sans danger de la livraison du transgène. Les étapes essentielles à la réussite de HGD sont: 1) fournir la bonne quantité d&#39;ADN dans un grand volume d&#39;eau salée véhicule 2) dans la veine de la queue de la souris 3) en moins de 8 secondes. Bien que le processus d&#39;injection elle-même exige indéniablement une certaine dextérité manuelle, le succès de cette deuxième procédure de six réside souvent dans...

Depuis sa première description par Liu et al. Et Zhang et al., La livraison de gène hydrodynamique (DHG) est devenu un outil précieux pour étudier la fonction des gènes dans des systèmes modèles de rongeurs 1, 2. La technique implique l&#39;injection rapide (7.5 sec) d&#39;un volume important (12.8% de poids corporel) de la solution dans la veine caudale de souris afin de faciliter l&#39;absorption de l&#39;ADN plasmidique par des cellules d&#39;organes cibles 1, 2. Ces conditions conduisent à l&#39;expression des gènes dans le foie robuste et moins l&#39;expression du gène dans le rein, la rate, les poumons et le cœur. Injection de 10 pg pCMV-LacZ plasmide peut transfecter autant que 40% des hépatocytes, ce qui HGD non-virale, la méthode la plus efficace, in vivo livraison de gène à la date 1. Contrairement transporteurs virales, pDNA est facile à préparer, ne provoque pas une réponse immunitaire chez l&#39;hôte rongeur 3 et ne pose pas de risque pour la santé par se recombiner avec finvirus exogène. En outre, puisque les molécules d&#39;ADN fournis par HGD n&#39;ont pas besoin de l&#39;emballage, cette méthode est adaptée pour la livraison de chromosomes artificiels de bactéries (BAC) aussi grandes que 150 ko 4. D&#39;autres types de molécules qui ont été délivrés par un procédé hydrodynamique comprennent l&#39;ARN de 5 à 10, 11 morpholinos, des protéines de 12, 13 et d&#39;autres petites molécules 12, 14. Les avantages et les inconvénients de HGD sur les autres méthodes de livraison ont été abordés dans d&#39;excellentes critiques dans la littérature 15-20 et un certain nombre d&#39;auteurs ont fourni une description détaillée de la procédure 21-23. L&#39;introduction de transgènes dans des souris par le MH est sûr et efficace 1-3, 24 et le procédé a été utilisé avec succès chez des rats comparable 25. Avec certaines modifications, des expériences de validation de concept ont été réalisées chez les poulets, 26 rables bits 27 et 28 porcs, bien que, l&#39;application in vivo de cette technique dans les plus grands animaux reste un défi. Lorsqu&#39;on utilise ce procédé, une autre limitation commune est que la plupart des vecteurs d&#39;expression mammaliens disponibles ne disposent pas des composants pour atteindre une persistante, le niveau élevé de l&#39;expression génique. L&#39;utilisation d&#39;un plasmide, l&#39;expression du gène pCMV-Luc dans les organes cibles est évident dès dix minutes après HGD, toutefois, le niveau d&#39;expression initial, haute diminue fortement dans la première semaine après l&#39;injection 1. L&#39;expression du transgène à long terme est possible selon le promoteur et l&#39;intron utilisés dans la conception de plasmide 3, 24 injections Toutefois, le maintien de l&#39;expression du gène de haut niveau nécessite souvent répété. Pour cette raison, HGD peut-être moins approprié pour étudier les maladies chroniques qui sont le résultat de l&#39;exposition à long terme à des protéines nuisibles ou des produits protéiques. Avec ces limitations, HGD est un outil extrêmement puissant pour étudier la potiel rôle d&#39;un gène et l&#39;effet de celle des mutants in vivo, ainsi que les effets thérapeutiques et la régulation des protéines et pour établir des modèles animaux de la maladie (pour revue, voir 15). Par exemple, HGD peut être utilisée pour affecter la fonction des domaines et des acides aminés des protéines en introduisant individuellement différentes constructions de gènes dans les souris qui ont les gènes respectifs assommé. En outre, cette technique peut être utilisée dans n&#39;importe quelle souche de souris. Ce protocole décrit HGD chez la souris avec un accent sur les aspects techniques nécessaires à la réalisation transfection réussie: insertion correcte de l&#39;aiguille dans la veine, le volume d&#39;injection et la rapidité de livraison. L&#39;application de cette méthode est démontrée dans un modèle de souris de la trypanosomiase africaine, une maladie mortelle de l&#39;homme et de l&#39;élevage 29, 30. Bien que plusieurs espèces de trypanosomes causent la maladie chez le bétail, la plupart ne peuvent pas provoquer la maladie chez l&#39;homme due à des complexes immuns innés en blood appelées facteurs lytiques des trypanosomes (TLF) 29, 31, 32. Ces, lipoprotéines de haute densité formation de pores (HDL) contiennent deux protéines, les primates spécifique uniques:. HPR, le ligand de, ce qui facilite l&#39;absorption de TLF dans les trypanosomes, et PALO-I, le composant lytique 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense est capable d&#39;infecter les êtres humains en raison de l&#39;expression d&#39;une protéine associée à la résistance de sérum (SRA) qui se lie à et neutralise apoL-I humain 34, 39. Baboon TLF n&#39;est pas neutralisé par SRA en raison de sa divergent protéine PALO-I 40. Comme indiqué précédemment, en utilisant un vecteur d&#39;expression de mammifère (pRG977), l&#39;expression transgénique de babouin composants TLF chez la souris confère une protection contre les trypanosomes humains-infectieux 40. Les données représentatives présentées ici montrent comment la délivrance de gènes hydrodynamique peut être appliquée pour étudier les effets thérapeutiques d&#39;une protéine.

<table><tbody><tr><td>Lingette de préparation à l’alcool</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST kit, Amplite Colorimetric</td><td>AAT Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur de queue de souris</td><td>Braintree Scientific</td><td>MTI RST</td><td>Ou aiguille équivalente</td></tr><tr><td>, 20 Gx 1 (0,9 mm x 25 mm)</td><td>Aiguille</td><td>305175</td><td></td>BD</tr><tr><td>, 27 Gx 1/2 (0,9 mm x 25 mm)</td><td>BD</td><td></td> 305109 <td></td></tr><tr><td>pRG977 (vecteur d’expression de mammifère)</td><td>Accord de transfert de matériel Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td><td>requis</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, 0,9 % INJ USP 10 ml, Hospira&nbsp ;</td>Seringue <td></td><td>Fisher NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>, 3 ml, Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Luer Lock nécessaire pour résister à la pression de HGD</td></tr></tbody></table>

expression transitoire de protéines par hydrodynamique gene livraison chez la souris

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

L&#39;expression efficace de transgènes in vivo est d&#39;une importance critique pour l&#39;étude de la fonction génique et le développement de traitements pour des maladies. Au cours des dernières années, la livraison de gène hydrodynamique (DHG) a émergé comme une méthode simple, rapide, sûr et efficace pour fournir des transgènes dans les rongeurs. Cette technique repose sur la force générée par l&#39;injection rapide d&#39;un grand volume de solution physiologique pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires des organes perfusés et ainsi délivrer de l&#39;ADN dans les cellules. L&#39;un des principaux avantages de HGD est la possibilité d&#39;introduire des transgènes dans des cellules de mammifère en utilisant l&#39;ADN plasmidique nu (ADNp). L&#39;introduction d&#39;un gène exogène en utilisant un plasmide est peu laborieux, très efficace et, contrairement aux transporteurs virales, remarquablement sûr. HGD a été initialement utilisé pour délivrer des gènes dans des souris, il est maintenant utilisé pour délivrer une large gamme de substances, y compris des oligonucleotides, des chromosomes artificiels, des ARN, des protéines et de petites molécules dans des souris, des ratset, à un degré limité, d&#39;autres animaux. Ce protocole décrit HGD chez la souris et se concentre sur trois aspects clés de la méthode qui sont essentiels à l&#39;exécution de la procédure avec succès: une bonne insertion de l&#39;aiguille dans la veine, le volume d&#39;injection et la rapidité de livraison. Des exemples sont donnés pour montrer l&#39;application de cette méthode pour l&#39;expression transitoire de deux gènes qui codent pour des protéines sécrétées, des primates-spécifique, l&#39;apolipoprotéine LI (apoL-I) et la protéine apparentée à l&#39;haptoglobine (HPR).

Le positionnement correct de l&#39;aiguille dans la veine de la queue de la souris (comme illustré à la figure 1) est une condition préalable pour avoir réussi un transgène par transfection à base d&#39;hydrodynamique. Souvent, la partie la plus difficile de la technique, cependant, est le maintien de l&#39;aiguille dans la veine de la queue sans mouvement de sorte que la totalité du volume de l&#39;injection peut être rendu dans un délai de 6-8 s. Les erreurs mineures au cours du processus d&#39;inject...

Dans la transfection in vivo d&#39;ADN nu par la délivrance de gènes hydrodynamique introduit les gènes dans le tissu d&#39;un animal avec une réponse inflammatoire minime. Des quantités suffisantes de produit du gène sont générées de telle sorte que la fonction des gènes et de la réglementation ainsi que la structure et la fonction des protéines peuvent être analysées.

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

L'objectif général de cette procédure est d'exprimer de façon transitoire des gènes chez la souris à l'aide d'une livraison hydrodynamique de gènes, ou HGD. Les souris sont pesées et un volume approprié de solution saline contenant l'ADN plasmidique est préparé, puis chargé dans une seringue.La souris est ensuite réchauffée afin de dilater les vaisseaux sanguins de la queue et placée dans un dispositif de contention en utilisant l'artère dorsale. À titre de repère, les veines caudales latérales sont localisées et le mélange d'ADN en solution saline est injecté dans l'une des veines caudales. Enfin, la souris est retirée du dispositif de contention et placée sur un tapis chauffant pour récupérer.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin de visualiser l'expression de transgènes par le suivi des taux protéiques sanguins au moyen de l'immunotransfert (Western blot). Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes existantes, telles que l'expression par transfusion virale, réside dans le fait que la livraison hydrodynamique de gènes permet d'utiliser de l'ADN plasmidique nu, facile à produire, sûr à manipuler et présentant moins de limitations de taille. Je suis Daniela Kovacic.Je suis postdoctorant dans le laboratoire de la Dre Jane Raper, et je vais démontrer cette méthode. Commencez cette procédure en utilisant un marqueur indélébile pour marquer le dos des souris blanches afin d'indiquer leur groupe expérimental ; renouvelez les marquages au besoin au fil du temps. Le jour de l'expérience, pesez chaque souris individuellement dans un récipient ou un seau de pesée placé sur une balance de laboratoire numérique.Enregistrez le poids de chaque souris en suivant les instructions du document joint. Préparez suffisamment de mélange d'injection pour chaque souris à injecter, plus une supplémentaire, car le chargement adéquat des seringues nécessitera un peu de mélange d'injection en excès. Utilisez une solution saline stérile, sans conservateur ni endotoxine, approuvée pour usage humain.Après avoir laissé toutes les solutions atteindre la température ambiante, fixer une aiguille stérile de calibre 20 à une seringue de trois millilitres munie d’un système de verrouillage inférieur et aspirer le mélange x d’ADN dans une solution saline. Préparer une seringue pour chaque injection. Veiller à ne pas former de bulles d’air.Évitez d'utiliser des seringues de plus grand volume, car le fluide d'injection ne peut pas être contrôlé de manière très précise et il est difficile de manipuler des seringues plus grandes d'une seule main. Ensuite, passez à une aiguille stérile de calibre 27. Réglez le volume du mélange ADN-sérum physiologique selon le calcul effectué.Éjecter toute solution excédentaire dans le tube conique pour une utilisation ultérieure. Cela remplira l'aiguille, sans introduire de bulles d'air.Ne laissez pas l’aiguille non capuchonnée entrer en contact avec une surface non stérile afin de protéger l’aiguille avant les injections. Replacez le capuchon à l’aide d’une technique à une main. Placez le capuchon sur une surface plane, puis, sans le tenir avec l’autre main, insérez l’aiguille et appuyez l’aiguille capuchonnée contre un objet solide.Pour fixer le bouchon, préparez toutes les seringues nécessaires de la même manière. Intervenez avant de commencer les injections. Placez la cage de la souris avec la litière sur un tapis chauffant pendant cinq minutes afin que la température de la litière atteigne environ 38 à 39 degrés Celsius.Cela va dilater les vaisseaux sanguins des souris. Notez que l'anesthésie n'est pas recommandée pour cette procédure pendant que les souris se réchauffent ; utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour immobiliser un dispositif de contention dorsal sur une surface plane. Après cinq minutes, retirez le capuchon de la seringue destinée à la première injection chez la souris.Placer la seringue sur le capuchon afin d'empêcher que l'aiguille non capuchonnée ne touche des surfaces non stériles, pour des raisons de sécurité et d'hygiène. Ne laisser qu'une seule aiguille non capuchonnée à la fois.Ensuite, prenez une souris par la queue. Placez-la délicatement dans le dispositif de contention et insérez le bouchon. Utilisez le minimum de contention nécessaire pour immobiliser la queue.Veillez à ce que la souris respire librement. Ensuite, repérez les veines latérales de la queue en regardant directement le dos de la souris. La ligne rouge qui traverse le milieu de la queue est une artère.Alors que les lignes bleues de chaque côté de la queue correspondent aux veines caudales latérales, positionnez la souris de manière à ce qu'une des veines caudales latérales soit visible. Ensuite, nettoyez soigneusement la queue de la souris avec un coton-tige imbibé d'alcool. À l'aide de la main non dominante, maintenez fermement la queue entre l'index et le majeur, de sorte que la queue passe sous l'index, au-dessus du majeur et du troisième doigt, puis sous l'auriculaire.Laissez le pouce libre de bouger. À l’aide de l’autre main, utilisez un tampon d’alcool pour nettoyer la zone d’injection. Laissez à nouveau sécher la zone.À présent, avec la main d'injection, prenez la seringue chargée et tenez-la par le corps entre le pouce et les quatre autres doigts. N'agrippez pas le piston. Positionnez la seringue parallèlement à la queue, l'aiguille orientée vers le corps de la souris, et le tranchant ou bord incliné de l'aiguille vers le haut.Insérez l'aiguille dans la veine de la queue. Si la veine a été correctement localisée, l'aiguille s'enfoncera sans résistance ; tout en maintenant l'aiguille immobile, utilisez le pouce de la main qui tient la queue pour appuyer sur le raccord de l'aiguille et plaquer celui-ci contre la queue afin de maintenir l'aiguille en place. N'appliquez pas une pression excessive et ne touchez pas le corps de l'aiguille, car cela entraverait l'écoulement du liquide dans la veine.Ensuite, repositionnez la main tenant la seringue de manière à ce que l'index et le majeur tiennent la collerette et que le pouce soit placé à l'extrémité du piston. Appuyez sur le piston d'un mouvement continu et injectez tout le volume de liquide en six à huit secondes. Retirez l'aiguille de la veine et, à l'aide d'un mouchoir, appliquez une pression douce sur la queue pour arrêter tout saignement.Ici, le processus d'injection est montré en temps réel. Notez qu'une insertion complète de l'aiguille n'est pas recommandée en raison du risque accru de rupture de la veine. Après l'injection, retirez la souris du dispositif de contention et placez-la dans une cage de récupération posée sur un tapis chauffant. Si la pièce d'injection est froide, cette étape est cruciale pour la survie de la souris.Retenez la queue de la souris jusqu'à ce que l'hémorragie s'arrête complètement. Observez la souris pendant une heure après la livraison hydrodynamique de l'ADN.Une période initiale de halètement et d'immobilité est normale, mais assurez-vous que la souris présente des signes de récupération. Environ cinq minutes après que la souris ait récupéré, remettez-la dans sa cage d'élevage et assurez-vous qu'elle dispose d'une abondante réserve de nourriture et d'eau. Ensuite, nous démontrerons l'injection par la queue en utilisant une position alternative de la main.Cette méthode est particulièrement utile lorsqu'il est nécessaire d'injecter des souris plus près de la base de la queue. Par exemple, lorsqu'on corrige une injection ratée le même jour ou lorsqu'on injecte des souris ayant une queue plus courte, préparez la souris pour l'injection et placez-la dans un dispositif de contention. Comme précédemment, posez la main non dominante sur une surface plane, avec les quatre doigts fléchis à un angle de 90 degrés, les doigts reposant les uns sur les autres.Pour créer une plateforme, maintenez la queue de la souris entre le pouce et l'index. À l'aide de l'autre main, nettoyez la zone à injecter avec un tampon imbibé d'alcool. Laissez la zone sécher.Saisissez la seringue d'injection avec la main d'injection et tenez-la par la collerette et l'extrémité du piston, prête pour l'injection. Placez ensuite la seringue parallèlement à la queue, avec l'aiguille orientée vers le corps de la souris et le biseau de l'aiguille dirigé vers le haut. Injectez comme précédemment afin d'évaluer si l'ajout d'une étiquette hiss à des emplacements spécifiques de la séquence interfère avec le traitement et la sécrétion corrects de l'APO de babouin.Les souris ont été injectées avec un plasmide portant l'un des trois gènes babouin APO L one différemment marqués par l'histidine, et un autre plasmide portant le HPR babouin. La réussite des injections a été évaluée par analyse sanguine Western des taux circulants de HPR dans le sang des souris deux jours après l'injection. Comme indiqué ici, le HPR babouin a été fortement exprimé dans le plasma de toutes les souris transfectées, sauf une, indiquant que la TGD avait été réussie.De faibles baisses des niveaux d'expression, comme observées chez l'un des deux souris du groupe B APO L un, son groupe étiqueté un, sont généralement attribuables à une réduction très minime de la vitesse d'injection, de un à deux secondes. Ici, la voie d'échantillon plasmatique un montre une absence totale d'expression protéique. Cela indique un échec de HGD, très probablement dû à une injection incomplète du volume total du véhicule de livraison. Pour évaluer l'effet du marquage His sur la sécrétion de l'expression de B APO L un, l'expression du marqueur His a également été évaluée, comme indiqué ici.Il n'y avait aucune présence détectable de protéine marquée par une étiquette hist dans les groupes un et deux. Le seul groupe de souris présentant des niveaux détectables de la protéine dans leur plasma était le groupe trois. Pris ensemble, ces données indiquent que l'absence de protéine marquée par une étiquette his dans les groupes un et deux est due à des différences d'expression génique ou de traitement des protéines, plutôt qu'à un échec des injections.Il souligne également l'importance d'ajouter une protéine traceur dans le mélange d'injection afin de surveiller la réussite de la DGH. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les souris et les seringues, ainsi que comment insérer l'aiguille dans la veine de la queue pour une injection rapide d'ADN plasmidique afin d'exprimer des gènes dans les souris par livraison hydrodynamique de gènes. L'aspect le plus délicat de cette procédure consiste à maintenir l'aiguille en place tout au long de l'injection.L'aiguille correctement insérée peut sortir de sa position en raison d'un mouvement accidentel soit de la personne injectant, soit de la souris non anesthésiée, ce qui réduit les chances de succès. Nous évitons d'injecter les souris dont le poids dépasse 27 grammes, car la manipulation d'une seringue chargée jusqu'à une capacité de 3 ml est plus difficile.Nous constatons que les souris pesant entre 23 et 27 grammes sont les plus pratiques à injecter. Les veines des souris pesant moins de 20 grammes peuvent être trop petites pour l'injection.

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