Name: In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Apprenez la stimulation optogénétique in vivo du système nerveux central chez les rongeurs éveillés et en mouvement libre. Ce protocole détaillé permet de contrôler en temps réel l'activité neuronale pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le comportement.

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Ces études ont été financées par des subventions reçues des NIH (MH082876, DA023988).

<ol><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+neural+interface%3A+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatry%27s+age+of+enlightenment%3A+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatry+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li>
<li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li>
<li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li>
<li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
<li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004(2012).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li>
<li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.

Les laser décrit set-ups et les stratégies actuelles d&#39;attache sont compatibles avec un large éventail de tests comportementaux de rongeurs. En effet, une variété de tests comportementaux ont été utilisés suivant, ou d&#39;accompagnement, la stimulation optogenetic in vivo qui comprennent tâches émotives comportement, conditionnement comportemental, l&#39;apprentissage et les paradigmes de mémoire, sommeil, l&#39;éveil et les tâches appétitives pour ne en nommer que quelques-uns (voir Nieh et al. 6 pour un examen complet). Optogenetics a changé la façon dont des tests comportementaux traditionnels sont menées en ce que les études de plusieurs jours peut maintenant être condensé en une seule session à laquelle le comportement est comparé, intra-sujets, au cours des époques distinctes de la lumière »sur» contre «off» 5. Compartiments de la note, appareils de comportement qui contiennent des portes, fermées ou d&#39;autres obstacles peuvent être modifiées pour permettre le passage de fibres captifs. Le stratégies d&#39;attache permis si décritstimulation multanée de souris multiples à partir d&#39;un seul laser. Haut débit tests comportementaux optogenetic peut donc être obtenue par l&#39;utilisation de multiples lasers et l&#39;équipement d&#39;essai. Le nombre d&#39;animaux qui peuvent être stimulés simultanément, cependant, sera limitée par la puissance lumineuse maximale qui peut être atteint à chaque extrémité de la fibre. Puissance de sortie maximale à la pointe de la fibre dépend de la 1) une puissance de démarrage du laser; 2) l&#39;efficacité de couplage et 3) nombre de divisions de faisceau. Pour un laser bleu de 100 mW avec ~ 80% d&#39;efficacité de couplage et jusqu&#39;à quatre divisions de faisceau (comme illustré sur la figure 4C), puissance moyenne à la pointe de la fibre peut varier entre 5 à 10 mW lors de l&#39;utilisation de 200 um base, 0,22 NA cordons de raccordement de fibre (nb se attendre à une perte de transmission de joints rotatifs pour être &lt;15%). Sortie de mesure de la lumière à l&#39;extrémité de la fibre est essentiel pour déterminer la puissance de la lumière suffisante pour l&#39;activation de opsin que opsines diffèrent dans leur sensibilité à la lumière et donc la densité de puissance lumineuse (mW/ Mm 2) 11 nécessaire pour l&#39;activation. Par exemple, l&#39;étape consistant à fonction stable opsine (SSFO) agit comme un accumulateur de photons et nécessite donc très peu de densité de puissance lumineuse pour l&#39;activation (&lt;8 mW / mm 2) 8. Comparez cela à la rhodopsine canal traditionnel (ChR2) qui nécessite un minimum de 1 mW / mm 2 de la lumière pour obtenir des potentiels d&#39;action 2. Tableau 1 est fourni en référence rapide pour irradiances lumineuses minimales connues requises pour activer opsines les plus courantes actuellement en utiliser. Enfin, il faut considérer que les disperse la lumière et absorbe à mesure qu&#39;il traverse les tissus du cerveau de telle sorte que plus de puissance lumineuse est nécessaire pour les structures cérébrales profondes 3. Une ressource en ligne utile est disponible à <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> qui va calculer l&#39;intensité de la lumière à différentes profondeurs à travers les tissus du cerveau en tenanttenir compte de la taille de coeur de la fibre, ouverture numérique, longueur d&#39;onde de la lumière utilisée, et la puissance de la lumière à partir de la pointe de la fibre. Pour un excellent aperçu des principes théoriques qui sous-tendent ces calculs, voir Foutz et al. (2012) 12. Des exemples de la façon d&#39;appliquer ces principes et les calculs à la conception expérimentale sont démontrés dans Aravanis et al. (2007) 3 et Tye et al. (2012) 13. L&#39;exécution de ces calculs avant le début d&#39;une expérience est cruciale pour assurer le rayonnement de la lumière suffisante pour l&#39;activation de l&#39;opsine. Compte tenu de ces considérations, il est avantageux d&#39;acheter des lasers de forte puissance pour assurer la puissance de sortie adéquate. Lasers avec une puissance de 100 à 200 mW sont généralement suffisantes pour compenser les petites fibres de l&#39;âme, multiples fractionnement de fibres, couplage inefficacité et la transmission perd 7. Si l&#39;aide de lasers de forte puissance, cependant, des précautions doivent être prises pour éviter les dommages neuronaux ou de la chaleur et de la lumière-associéartefacts d qui peuvent survenir avec prolongée et / ou de haute puissance éclairage en lumière sept. Une gamme sans danger pour les expériences in vivo est jusqu&#39;à 75 mW / mm 2. 14 Décider du type de laser à l&#39;achat peut être une affaire compliquée car il ya beaucoup de facteurs à considérer. Par exemple, des lasers à diodes directes fournissent sortie pulsée plus stable et reproductible de faire l&#39;état solide (DPSS) lasers pompés par diode, et sont plus fiables dans le temps dans un environnement de laboratoire. Dans certains cas, cependant, des lasers à diodes directes peut émettre une puissance lumineuse inférieure, ~ 0,1 mW, même lorsque la tension de commande V 0 est dû à un biais constant de courant étant envoyé à la diode par l&#39;électronique de commande du laser. Cette émission «spontanée» a un spectre plus large que ne le fait émission laser de la même laser, donc peut être spécifiquement réduite par l&#39;installation d&#39;un passe-bande étroite (ou «nettoyage») filtre entre le laser et le coupleur (voir liste des pièces). Ce filtre sera égalementréduire la puissance de sortie de ~ 50% lorsque l&#39;effet laser, donc acheter un laser de forte puissance en conséquence. Il convient de noter que les lasers DPSS jaunes sont extrêmement sensibles et peuvent se comporter de façon erratique et ont réduit la durée de vie si rapidement modulé par un générateur d&#39;impulsions. Réglage de la puissance du laser jaune doit être fait par roues à filtres de densité externes placés sur le trajet du faisceau (section 1.7) pendant le fonctionnement du laser dans le mode TTL +. Alternativement, l&#39;achat d&#39;un vert 532 nm DPSS laser est une alternative rentable qui peut activer les deux halorhodopsins et archaerhodopsins. L&#39;ouverture numérique (NA) d&#39;une fibre est important de tenir compte lors de la conception et l&#39;achat de composants en fibre pour l&#39;assemblage laser set-up. Le NA d&#39;une fibre optique détermine les angles de rayons lumineux qui peuvent être acceptées et émis à la pointe d&#39;une fibre. Si une fibre plus-NA est accouplé à une fibre inférieur NA, perte importante se produira à cette interface, il est donc important d&#39;être compatible wi<html> e NA fibres dans une seule configuration (ou de se assurer que NA augmente le long de la trajectoire de la lumière). L&#39;effet des fibres NA sur le volume des tissus du cerveau illuminé est moins important, puisque le tissu du cerveau est très dispersait, et puisque la lumière couplée d&#39;une source laser aura tendance à fibres high-na &#39;&#39; sous-remplissage; cependant fibres optiques avec une ouverture numérique de 0,22 et 0,37 sont couramment utilisés. De même, le couplage d&#39;un plus grand-core à une fibre plus petit noyau sera également entraîner des pertes importantes, il faut donc toujours être sûr d&#39;utiliser de plus en plus ou égales diamètres de base lors de la progression de la source laser à l&#39;implant animale. D&#39;une manière générale, les extrémités des fibres doivent toujours être plafonnés lorsqu&#39;il ne est pas utilisé pour éviter la poussière et l&#39;accumulation de particules. Ce est une bonne idée de régulièrement extrémités et connecteurs (70% d&#39;alcool isopropylique fonctionne bien) pour assurer maximale puissance lumineuse de sortie, et de tester la puissance de sortie la lumière à travers un «implant factice» avant de commencer les expériences de chaque jour fibres propres. &quot;&gt; Lors des tests de comportement, il est impératif que des mesures soient prises pour contrôler les effets de l&#39;infection virale, l&#39;expression de la protéine exogène, la lumière visible, et les effets et les artefacts de chauffage des tissus possibles sur le comportement animal. Par conséquent, le groupe de contrôle approprié devrait être composé d&#39;animaux transduites avec un virus témoin (par exemple, GFP, EYFP, mCherry) qui reçoivent des paramètres de stimulation lumineuse identiques. La vérification expérimentale est une étape finale déterminant que les données de comportement utilisés pour l&#39;analyse dépend entièrement de l&#39;opsine appropriée et le placement de la fibre optique dans la région d&#39;intérêt . En particulier, chez les animaux où aucun signal ne est détecté immunohistochimique, ou lorsque le signal de positionnement ou de la fibre ne est pas dans la région d&#39;intérêt, les données alors que le comportement de l&#39;animal doivent être retirés de l&#39;expérience. En outre, il est essentiel de tester la production de lumière à la pointe de la fibre à la fois avant l&#39;implantation chirurgicale et encore post-mortem pour assurer une alimentation adéquate de la lumière pour l&#39;activation de l&#39;opsine. Dans animals où de graves perte de lumière est produite par la fibre après l&#39;expérimentation (&gt; 30%) 9, les données de cet animal doit être considéré pour l&#39;enlèvement. Les critères de retrait devraient être établies a priori. Enfin, il faut considérer la fréquence des impulsions nécessaires pour moduler cuisson neural, qui dépendra de la structure du cerveau et des sous-types de neurones étant ciblé. Publié paramètres de stimulation lumineuse optogénétiques existent pour plusieurs sous-types de neurones, cependant, la capacité de moduler excitation nerveuse devrait être confirmée indépendamment par in vivo ou tranche de cerveau enregistrements électrophysiologiques. Comme on devient habile avec l&#39;utilisation du laser et la modification de laser set-ups, des combinaisons de différentes longueurs d&#39;onde peuvent être attachés à des fibres multiples sur un seul animal ou livrés sur la même fibre pour optogénétique combinatoire 8. Stimulation multi-longueur d&#39;onde va devenir de plus en plus important, étant donné le développement rapide de décalage vers le rougeed channelrhodopsins 8, l&#39;ingénierie de opsines hyperpolarisants décalée vers le bleu 15, l&#39;utilisation de bistables opsines étape fonctions 8,16,17, et la liste expansion générale de opsines avec les spectres d&#39;activation distincte 11. Cette expansion de la boîte à outils optogenetic permettra le contrôle sans précédent de plusieurs sous-types de neurones à la fois dans et entre les régions du cerveau pour déterminer leur rôle dans le gouvernement états comportementaux complexes.

Optogenetics a révolutionné les neurosciences au niveau des systèmes dans sa recherche pour les éléments de circuit neuronal de conduite états comportementaux normaux et pathologiques pertinentes. La découverte que opsines microbiennes sensibles à la lumière 1 pourraient être exprimés dans des cellules de mammifères fonctionnellement fourni la plate-forme pour l&#39;utilisation de la lumière pour obtenir un contrôle sans précédent de l&#39;activité neuronale avec une grande précision spatiale et temporelle 2. Contrairement aux approches traditionnelles électrophysiologiques ou pharmacologiques à la manipulation de l&#39;activité neuronale, optogénétique permet le contrôle de types de cellules spécifiques (sur la base génétique identifier ou projection spatiale) à l&#39;intérieur des populations hétérogènes à des échelles de temps et physiologiquement pertinents. L&#39;introduction ultérieure d&#39;une interface neurale-optique a fourni un outil pratique pour la livraison de la lumière pour se comporter trois animaux. Cela a permis pour la modulation en temps réel des circuits neuronaux définis chez les rongeurs de se comporter éveillés afin de tester le lien de causalitérôle de ces circuits neuronaux dans la gouvernance des états comportementaux concernant les maladies neurologiques et psychiatriques 4-6. Optogenetics, représente donc un outil puissant pour l&#39;introduction dans ne importe quel laboratoire intéressé à étudier la relation fonctionnelle entre l&#39;activité cérébrale et les mesures comportementales ou physiologiques dans des modèles animaux. La conception et la réalisation de une expérience optogenetic implique différentes étapes et considérations (voir Figure 1). Le but du protocole actuel est de fournir aux individus les outils et composants, avec la connaissance théorique et pratique, nécessaire pour effectuer une stimulation optogenetic chez les rongeurs de se comporter éveillés. Actuellement, il ya deux plages de longueur d&#39;onde prédominante utilisées pour activer les canaux opsin microbiennes: dans le spectre bleu (473 nm couramment) et spectres vert-jaune (couramment 532 ou 591 nm). Les deux lasers et de diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être utilisés comme sources de lumière à dEliver longueurs d&#39;onde spécifiques de la lumière aux tissus du cerveau. La lumière non cohérente émise par des LED, cependant, rend la transmission efficace de la lumière difficile lors de l&#39;accouplement dans les petites fibres de base nécessaires à la stimulation in vivo de rongeurs. Décider sur l&#39;ensemble de laser approprié est une première étape cruciale et dépendra de l&#39;utilisation prévue de l&#39;optogénétique dans le laboratoire. Le protocole actuel décrit deux configurations de base qui diffèrent dans leur facilité de montage et de l&#39;utilisation des lasers: pré-couplé simples et les systèmes à double laser (voir figure 2). Systèmes laser simples qui sont pré-couplés par le fabricant sont essentiellement prêt-à-go à l&#39;arrivée avec peu ou pas de set-up nécessaire mais présentent l&#39;inconvénient de personnalisation minimale de l&#39;utilisateur final. Système de laser à double permet la livraison de deux longueurs d&#39;onde différentes sur la même fibre. Cela va devenir de plus en plus importante avec l&#39;avènement de l&#39;optogénétique combinatoire lequel différentes longueurs d&#39;onde peuvent être utilisés pour activer / inhiber la distinctiont types cellulaires qui sont co-localisé spatialement. Ce est également essentiel pour une utilisation avec bi-stables opsines de fonction de l&#39;étape où sont photocourants début et la fin par la lumière bleue et jaune, respectivement 7,8. Systèmes laser double sont également personnalisables que l&#39;utilisateur peut ajouter ou supprimer des composants (par exemple, volets extérieurs, des filtres de faisceau, compteurs de puissance en ligne) de la trajectoire du faisceau selon les besoins. Grâce à sa polyvalence, le laser double set-up est recommandé si optogénétique va être un outil continué utilisé dans le laboratoire. Le couplage des lasers, cependant, peut présenter un défi et donc un mécanisme de couplage rapide, simple et fiable est prévue dans ce protocole. Remarque, ce protocole détaille l&#39;assemblage de composants optiques et utilise les cordons de brassage et de composants qui sont optimisés pour les fibres multimodes à saut d&#39;indice avec un noyau de 200 um et une ouverture numérique (NA) de 0,22. Tailles de base différentes et NA sont disponibles à l&#39;achat, mais tous les composants devraient idéalement correspondre en termes de coeurtaille et NA pour éviter la perte de lumière aux points de connexion de la fibre. En variante, à une connexion de fibre, la lumière peut passer à partir d&#39;une plus petite à une taille de noyau plus grand; et / ou d&#39;un faible NA-NA à une fibre plus élevé sans perte supplémentaire. stratégies d&#39;attache sont prévus qui permettent une stimulation simultanée de plusieurs tests comportementaux pour les souris à haut débit. Les protocoles fournis supposent l&#39;utilisation de fibres implantables chroniques pour les tests de comportement mais peuvent être modifiés pour les protocoles de stimulation aiguë. Fibres aiguë implantés sont avantageux pour combiner la stimulation optogenetic avec la manipulation pharmacologique, puisque le même canule peut être utilisé pour délivrer des médicaments et la pointe d&#39;une fibre optique au même endroit. L&#39;utilisation de fibres implantées chronique est cependant fortement recommandé pour les tests comportementaux plusieurs jours, car elle réduit les lésions tissulaires associées à l&#39;insertion et le retrait répétés de fibres et augmente la précision en termes de placement cohérent de fibres pourillumination de tissu 3. Lorsqu&#39;il est combiné avec les configurations d&#39;attache décrits ici, le comportement peut être enregistrée de manière fiable sur plusieurs jours. Mois En effet, la transmission de lumière fiable n&#39;a été signalée après l&#39;implantation de la fibre 9 telles que la stimulation chronique et des modèles de tests comportementaux peuvent, en théorie, être effectuées sur plusieurs jours et semaines. Notes supplémentaires sur les composants matériels ont été ajoutés au protocole pour permettre le choix de lecteur dans le meilleur produit qui répondra à leurs besoins individuels, y compris des solutions de rechange rentables et les produits qui peuvent être faites en interne. Conseils importants qui sont utiles lors de l&#39;installation et de mise en œuvre sont également fournis.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Configuration laser Système</td></tr> laser <tr><td>100 mW 473nm ou 488nm , < 2 % Stabilité (quantité : 1)</td><td>Omicron</td><td>Luxx/Phoxx 473/488-100</td><td>L’accessoire en option comprend une télécommande
boîte avec interrupteur à clé et affichage LED</td></tr><tr><td>100 mW 594nm DPSS laser (quantité : 1)</td><td>Colbolt</td><td>0594-04-01-0100-300</td><td>04-01 série laser jaune ; sensible à la réflexion arrière
à partir de fibres</td></tr><tr><td>200 mW 532 nm DPSS laser ; 5 % de stabilité de puissance (quantité : 1)</td><td>Shanghai Lasers</td><td>GL532T3-200</td><td>Alternative économique au laser DPSS jaune
pour l’activation des halorhodopsines et
archaerhodopsines</td></tr><tr><td>Coupleur laser à fibre multimode sans contact (quantité : 1)</td><td>OZ Optics</td><td>HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td><td>Pour une utilisation avec une configuration laser double ; Spécifications : 33 mm
OD pour 400 - 700 nm ; Prise FC, f = objectif 20 mm
avec adaptateur de tête laser post-mount #11</td></tr><tr><td>Planche d’essai en aluminium, 12 » x 18 » x 1/2 », 1/4 »-20 fileté (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1213</td><td>Pour système laser double</td></tr><tr><td>Plaque d’essai en aluminium, 10 » x 12 » x 1/2 ». 1/4 »-20 Fileté (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1012</td><td>Pour système laser unique</td></tr><tr><td>Planche d’essai en aluminium, 4 » x 6 » x 1/2 », 1/4 »-20 Fileté (quantité : 2)</td><td>Thorlabs</td><td>MB4</td><td>Pour laser bleu ; système laser double</td></tr><tr><td>Pince compacte à hauteur variable, 1/4 »-20 Taraudée (quantité : 4)</td><td>Thorlabs</td><td>CL3</td><td></td></tr><tr><td>3/4 » en acier inoxydable (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>TR075</td><td></td></tr><tr><td>Poteau en acier inoxydable 1 » (quantité : 4)</td><td>Thorlabs</td><td>TR1</td><td></td></tr><tr><td>Support de poteau avec verrouillage hexagonal à ressort vis à oreilles (quantité : 2)</td><td>Thorlabs</td><td>PH1</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de base de piédestal (quantité : 3)</td><td>Thorlabs</td><td>BE1</td><td></td></tr><tr><td>Petite fourche de serrage (quantité : 3)</td><td>Thorlabs</td><td>CF1253</td><td></td></tr><tr><td>Monture cinématique pour optique 1" avec miroir de qualité laser visible (quantité : 3)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100-E02</td><td></td></tr><tr><td>Roue de densité de filtre neutre (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-2M</td><td></td></tr><tr><td>1 » Longpass miroir dichroïque 50 % (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td></td></tr><tr><td>Monture cinématique pour optique 1 » (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>Pour miroir dichroïque</td></tr><tr><td>Kit de clés hexagonales 20 pièces avec support (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>TC2</td><td></td></tr><tr><td>1/4 »-20 Kit de vis d’assemblage et de quincaillerie (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2</td><td></td></tr><tr><td>Base de montage 1 » x 2,3 » x 3/8 » (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC à FC/PC L-Bracket manchon d’accouplement (quantité : 2)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFCB1</td><td>Dual FC/PC L-support également disponible</td></tr><tr><td>Poignées de levage de planche à pain (quantité : 3)</td><td>Thorlabs</td><td>BBH1</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash ; Filtre passe-bande 1", CWL = 450 &plusmn ; 2 nm, FWHM = 10 &plusmn ; 2 nm (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>FB450-10</td><td>Pour une utilisation avec des lasers à diodes qui
emit</td></tr><tr><td colspan="4">2. Couplage laser</td></tr><tr><td> ! Lunettes de protection laser (quantité : 1 pour chaque utilisateur à chaque longueur d’onde)</td><td>Divers</td><td></td> <td>! Consultez le fournisseur de laser pour vous assurer que la traduction
sélection de lunettes qui offriront un
atténuation de la lumière pour le laser acheté</td></tr><tr><td>Testeur de câble à fibre optique (quantité : 1)</td><td>Eclipse</td><td>902-186N</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de connecteur de fibre en une étape (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>FBC1</td><td></td></tr><tr><td>Cordon de raccordement coupleur (0.75 mètre) (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>0.75 m 200 &mu ; m core, 0,22 NA, connecteurs FC/PC fibres multimodes ; pour système laser double</td></tr><tr><td>Cordon de raccordement coupleur (0,5 mètre) (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>0,5 m 200 &mu ; noyau m, 0,22 NA, connecteurs FC/PC, multimode ; pour système laser unique</td></tr><tr><td>Doric mini cube (quantité : 2)</td><td>DORIC</td><td>DMC_1x2_FC-2FC</td><td></td></tr><tr><td>Console compacte de mesure de puissance et d’énergie (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Capteur de puissance mince LCD 4"</td></tr> série <tr><td>C 5 - 500 mW (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>Plusieurs types de détecteurs sont disponibles ; vérifier
avec le fournisseur</td></tr><tr><td colspan="4">3. In vivo Stimulation optogénétique</td></tr><tr><td>Répartiteurs de fibre multimode (quantité : 2)</td><td>FONT Canada</td><td></td><td>Fibre optique à grand noyau 1 x 2 répartiteur, rapport 50/50, connecteurs FC, robustes. La longueur, la taille du noyau et l’ouverture numérique peuvent être spécifiées lors de la commande ; rentable
Générateur</td></tr> de <tr><td>fonctions de forme d’onde arbitraire (2 canaux) (quantité : 1)</td><td>Rigol</td><td>DG1022</td><td>Peut contrôler jusqu’à 2 lasers à la fois</td></tr><tr><td>Joint rotatif à fibre optique (commutateur) (quantité : 6 - 8)</td><td>DORIC*</td><td>FRJ_1X1_FC-FC</td><td>*Également disponible via Thorlabs et Prizmatix</td></tr><tr><td>Cordons de raccordement Animal (canule à fibre optique mono personnalisée avec embouts de 10 mm, connecteur FC/PC) (quantité : 8)</td><td>DORIC</td><td>MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td><td>La longueur, la taille du noyau et l’ouverture numérique peuvent
être précisé lors de la commande ; Alternativement, ces
peut être fabriqué sur mesure en interne (voir
Sparta et al. 2012)9.</td></tr><tr><td>Manchon fendu en céramique PFP, 2,5 mm de diamètre intérieur, longueur de 11,40 mm (25/pqt) (quantité : 1)</td><td>Fibre de précision Produits</td><td>SM-CS1140S1</td><td>Utilisé pour la fixation de fibre optique implantée sur
animal à un cordon de raccordement en fibre optique avec
extrémité plate (FC)</td></tr><tr><td>Capuchons anti-poussière transparents pour & Oslash ; Embouts de 2,5 mm (25/paquet) (quantité : 1)</td><td>Thorlabs</td><td>CAPF</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon métallique pour manchons d’accouplement FC/PC et FC/APC (quantité : 1)</td>Cordons de raccordement <td>Thorlabs</td><td>CAPF1</td><td></td></tr><tr><td>à gaine épaisse (commande personnalisée) (quantité : 4)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>200 &mu ; m core, 0,22 NA, connecteurs FC/PC fibres multimodes ; La longueur, la taille du noyau et l’ouverture numérique peuvent être spécifiées lors de la commande</td></tr></tbody></table>

in vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

La capacité de sonder des circuits neuronaux définis chez des animaux éveillés et en mouvement libre avec une spécificité de type cellulaire, une précision spatiale et une résolution temporelle élevée a été un outil recherché depuis longtemps par les neuroscientifiques dans la recherche au niveau des systèmes pour les circuits neuronaux régissant les états comportementaux complexes. L’optogénétique est un outil de pointe qui révolutionne le domaine des neurosciences et représente l’une des premières approches systématiques permettant des tests causaux concernant la relation entre les événements de signalisation neuronale et le comportement. En combinant des approches optiques et génétiques, la signalisation neuronale peut être contrôlée de manière bidirectionnelle par l’expression de canaux ioniques sensibles à la lumière (opsines) dans des cellules de mammifères. Le protocole actuel décrit l’administration de longueurs d’onde spécifiques de lumière aux cellules exprimant l’opsine dans les structures cérébrales profondes de rongeurs éveillés et se déplaçant librement pour la modulation des circuits neuronaux. Les principes théoriques de la transmission de la lumière en tant que considération expérimentale sont discutés dans le contexte de la réalisation d’une stimulation optogénétique in vivo. Le protocole détaille la conception et la construction de configurations laser simples et complexes et décrit les stratégies d’attache pour permettre la stimulation simultanée de plusieurs animaux pour des tests comportementaux à haut débit.

Les résultats comportementaux obtenus avec la stimulation in vivo de optogenetic dépendent entièrement sur ​​le circuit neuronal étant ciblée, le modèle animal utilisé, et les paramètres de modulation. Pour fins de démonstration actuelles, les neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale, ou VTA, de la tyrosine hydroxylase :: souris Cre ont été transduites avec une étape-fonction stable opsine (SSFO) 8, ou le virus de commande (EYFP), et un implant de fibres était chroniquement implanté. L&#39;utilisation de souris transgéniques TH :: Cre assure que opsine expression est restreinte aux cellules TH + (dopamine) dans l&#39;aire tegmentale ventrale. La figure 7 représente les résultats obtenus en utilisant représentatifs du comportement du laser mise en place décrit en cours pour la stimulation simultanée de plusieurs souris. Ici, les souris ont été stimulées relié et en même temps en utilisant des lasers séparés (3 souris / Laser selon la figure 4C) et le comportement locomotrice a été enregistrée pendant 1 heure. Stimulation répétée des neurones dopaminergiques dans le VTA a entraîné unehyperactif phénotype qui a persisté pendant toute la durée de la stimulation. Aucun changement dans le comportement locomoteur a été observée chez les souris EYFP (voir vidéo 1). Après les tests de comportement, immunohistochimie a été effectué pour vérifier ciblage virale exact de neurones dopaminergiques VTA et placement de fibres a été confirmée visuellement (voir Figure 7). <img alt="Figure 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figure 1. étapes expérimentales pour la stimulation optogenetic in vivo. Il ya quatre étapes générales impliquées dans la conception et la réalisation in vivo la stimulation optogenetic. Ce protocole détaille notamment les étapes impliquées dans la livraison de la lumière provenant d&#39;une source de lumière laser à des structures profondes du cerveau chez le rongeur de se comporter et comprend 1) l&#39;assemblage du système de couplage de la lumière laser et; 2) stratégies d&#39;attache pour connexion plusieurs animaux à une source de lumière pour les tests de comportement à haut débit et 3) fournit des lignes directrices pour confirmer la stratégie de ciblage pour la livraison la lumière - une étape qui est essentielle pour l&#39;interprétation des données. Note: bien que ce protocole ne est pas exclusive aux fibres implantables chroniques à des fins d&#39;attache, il est recommandé et pris en charge lors de la combinaison avec la stimulation optogenetic tests comportementaux. Voir tant Ung &amp; Arenkiel, 2012 18 et Sparte et al., 2012 9 pour la production et l&#39;implantation de fibres optiques chroniques en interne. Les lignes continues = étapes couvertes par ce protocole. <img alt="Figure 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figure 2. Systèmes laser utilisés pour la stimulation optogenetic in vivo. (A) de système laser unique pour la stimulation in vivo. Ce laser est ph<html> ysically pré-couplés par fabricant et nécessite peu d&#39;utilisateur final set-up. (B) système laser double. Deux lasers sont couplées dans une fibre unique par l&#39;utilisation de miroirs qui agissent pour diriger chaque trajet de faisceau en un coupleur de type sans contact. Ce est le plus polyvalent set-up en tant que composants optiques peuvent être retirées ou ajoutées, au besoin, mais présente un plus grand défi en termes de couplage laser efficace. (C) Schéma du système à double laser montré en (B) de placement indiquant des lasers et miroirs avec le trajet du faisceau de lumière laser correspondant (flèches) représenté. Ici, le miroir dichroïque &quot;D&quot; est utilisé pour dévier les longueurs d&#39;onde bleues de la lumière tout en transmettant les longueurs d&#39;onde jaunes à travers le coupleur de &quot;C&quot; et dans le cordon de raccordement de coupleur joint. B = laser bleu; C = coupleur de style non-contact; D = miroir dichroïque; FW = roue de filtre; M = Miroir; Y = laser jaune.obtenir = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Bottom Figure 3. testeur (A) de câble utilisé dans le protocole de couplage non physique:. Testeur de câble directement relié à un cordon de raccordement. Insérer dépeint point de testeur au câble de connexion cordons (B) de Patch référence tout au long de protocole De extérieur vers l&#39;intérieur:.. Multimode séparateur de fibres, noir-chemise animale cordon de raccordement avec le blanc manchon zircone split attaché au-cleave plat (FC) fin, Cordon de raccordement à double paroi épaisse (également dénommé une «corde de coupleur&quot;). Cordons épais enveloppe sont recouvertes avec du chlorure de polyvinyle (PVC) tube pour une protection supplémentaire. Pour ces câbles, les codes de couleurs standard de l&#39;industrie sont utilisés pour distinguer entre les différents types de fibres, où Orange = fibre multimode. cordons de brassage sont des animaux<html> mince à double enveloppe pour permettre la flexibilité pour les mouvements d&#39;animaux au cours des essais de comportement. Notez que la poussière bouchons sont placés sur FC / PC se termine lorsque les câbles ne sont pas en cours d&#39;utilisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figure 4. Stratégies d&#39;attache pour la stimulation optogenetic in vivo de (A) un seul animal, (B) deux animaux; . (C) trois ou quatre animaux configurations possibles ne sont pas limités à ceux ci-dessus - de multiples configurations sont possibles grâce à la combinaison unique d&#39;adaptateurs, séparateurs de fibres, et de branchement des cordons de brassage qui sont disponibles dans le commerce ou en commande spéciale. Remarque: les cordons de raccordement et répartiteurs de fibres contiennent FC / PC connecteurs sur les deux extrémités (une seule extrémité est représenté).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figure 5. (Rouge x) raccordement correct et incorrect d&#39;un cordon de raccordement à une fibre optique implantable en utilisant une fraction de manches. (Panneau de gauche) A zircone split-manchon est utilisé pour connecter un cordon de raccordement à la virole d&#39;une fibre optique implantable (ici pas apposé à un animal). Flèche pointe vers le point de connexion entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique. Comparer à (panneau de droite) où il existe un écart entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique, tels que révélés par la fente du manchon de raccordement. Notez la fuite de lumière qui peut se produire avec une mauvaise connexion (en bas à droite). Culot sur upper panneau de gauche représente composants individuels utilisés. De haut en bas de l&#39;insert: Doric implantable fibre optique canule, zircone blanc split-manche, cleeve-plat (FC) fin d&#39;un patch animale cordon noir à double enveloppe (cordon de raccordement complète représentée sur la figure 3B). Dans tous les panneaux, noter que le manchon de raccordement ne est pas de niveau avec la fin de la FC cordon de raccordement. Laissez ~ 0,5 cm d&#39;une plus-accrocher pour la connexion à la fibre optique implantable apposée sur l&#39;animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figure 6. Side (à gauche) et frontale (à droite) vue d&#39;une souris avec une fibre optique implanté relié à un cordon de raccordement. Utilisez la scission sur le manchon de raccordement pour aider à visualiser une connexion correcte du cordon de raccordement to la virole de la fibre optique implanté. Le point de connexion est mise en évidence par une boîte en pointillé rouge et également représenté dans l&#39;insert supérieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figure 7. Les résultats représentatifs. (Gauche) lecture comportementale de la stimulation optogenetic in vivo. Exemple de comportement qui peut être obtenu en utilisant le laser décrit set-up et le protocole d&#39;attache. L&#39;activité locomotrice a été enregistrée pendant la stimulation optogenetic de l&#39;aire tegmentale ventrale (VTA) dans la tyrosine hydroxylase (TH) :: souris Cre (n = 7-8 / groupe) transduites avec soit une étape-fonction opsine (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) ou le virus de commande (AAV5-DIO-EYFP) dans le VTA. Des groupes de trois souris ont été simultanément attachés à un seullaser comme représenté sur la figure 4C et stimulé par une impulsion de 5 sec de 447 ou 473 nm lumière livré une fois toutes les 15 min. Mesures répétées Two-Way ANOVA ont révélé une interaction significative groupe x temps (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001) et un effet principal significatif de temps (F 3,39 = 4,67, p = 0,007) selon laquelle la stimulation optogenetic augmentation de l&#39;activité locomotrice seulement chez les souris SSFO (Bonferroni post-hoc p &lt;0,0001, par rapport à t = 0-15 bin de temps), résultant en une augmentation globale de l&#39;activité locomotrice par rapport aux souris EYFP (effet principal de groupe: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p &lt;0,01 à t = 15-30 et p &lt;0,001 à t = 30 à 45 et t = 45 à 60). Fiche d&#39;Fibre: 200 um base, 0,22 NA. Lumière irradiance = 6-66 mW / mm 2, correspondant à la fibre pointe distance de 0,1 à 0,6 mm de virale site d&#39;injection avec la puissance de la lumière de 5 mW émise au bout de la fibre avant tethering. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard de la moyenne. EYFPvs SSFO: ** p &lt;0,01; *** P &lt;0,001; effet du temps: #### p &lt;0,0001 (droite) La confirmation histologique du placement virale et fibre optique.. Image de fluorescence confocale acquise sur un Leica TCS microscope à balayage laser SP5 a été utilisé pour visualiser placement de fibres (en pointillés) et d&#39;expression à médiation virale (vert) dans l&#39;aire tegmentale ventrale de souris après la stimulation in vivo dans optogenetic. Les neurones dopaminergiques (TH +) sont considérés en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Vidéo 1. In vivo la stimulation optogenetic:. Hyperactivité pendant la stimulation VTA utilisant SSFO chez les souris TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsstimulation = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> La densité de puissance (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Propriétés </td></tr><tr><td> ON / OFF Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitation optique: channelrhodopsins action rapide </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1,21 / 12 msec </td><td> Feux jusqu&#39;à 40 Hz </td></tr><tr><td> CHETA 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 msec </td><td> Incendies jusqu&#39;à 200 Hz </td></tr><tr><td> ChEF 20 </td><td> 450 </td><td> 1,65 mW </td><td> 1,62 / 12 msec </td><td> Forme non-désensibilisation des ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm) </td><td> 5/34 msec à 540nm </td><td rowspan="2"> Décalée vers le rouge </td></tr><tr><td> 3,2 mW (630nm) </td><td> 67 ms (sur) à 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitation optique: action lente rhodopsines de canal </td></tr><tr><td> Stable fonction échelon opsine (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 mW (470nm) </td><td> 20 msec / 29 min </td><td> La nouvelle version OFS; état plus ouvert. Ouverte par 470 nm, fermé par 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Inhibition optique </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2,5 ms / &lt;10 msec </td><td> Inhibition soutenue pendant 30 min 22 avec la lumière constante * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msec </td><td> Plus sensible avec de plus grandes photocourants que eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Ce tableau est fourni qu&#39;à titre indicatif; irradiances de lumière spécifiques requises pour la modulation de neurones doivent être confirmées de façon indépendante. </td></tr><tr><td colspan="5"> Validation expérimentale est important de vérifier que l&#39;opsine, la stratégie de ciblage, et des paramètres de stimulation neurale lumière modulent cuisson de la manière prévue 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> La densité de puissance (mW / mm 2) se réfère à la puissance de la lumière lumineux sur une zone donnée des tissus du cerveau et ne se réfère pas à la puissance lumineuse émise par la pointe de la fibre. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Toujours utiliser l&#39;intensité de la lumière le plus bas possible, surtout avec la stimulation lumineuse prolongée. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés. Abréviations AAV = virus adéno-associé DPSS = état solide pompé par diode <br/&gt; EYFP = amélioré la protéine fluorescente jaune FC / PC = cleave plat / contact physique GFP = protéine fluorescente verte PBS = solution saline tamponnée au phosphate PVC = polychlorure de vinyle mW = milliwatt NA = ouverture numérique SSFO = stable étape fonction opsin TH = tyrosine hydroxylase Logique TTL = transistor-transistor V = tension VTA = aire tegmentale ventrale

L’optogénétique est devenue un outil puissant pour les expériences de neurosciences comportementales. Ce protocole offre un guide étape par étape pour la conception et l’installation de systèmes laser, et fournit un protocole complet pour la réalisation de stimulations optogénétiques in vivo multiples et simultanées compatibles avec la plupart des paradigmes de tests comportementaux de rongeurs.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser avec succès une stimulation optogénétique in vivo du système nerveux central de rongeurs chez un animal éveillé et en libre mouvement. Cet objectif est atteint en configurant tout d'abord le système laser approprié pour effectuer la stimulation optogénétique. Ensuite, des fibres optiques compatibles avec les tests comportementaux sont mises en place afin de diriger la lumière laser vers une fibre optique implantée et vers la région cérébrale d'intérêt exprimant l'opsine.Ensuite, l'animal est fixé au système laser pour la stimulation optogénétique et placé dans un appareil de test comportemental. Enfin, des paramètres de stimulation lumineuse définis par l'expérimentateur sont appliqués afin d'activer ou d'inactiver des neurones pendant que l'animal effectue une tâche comportementale. En définitive, la stimulation optogénétique in vivo est utilisée pour permettre un contrôle en temps réel de populations neuronales ou de circuits neuronaux spécifiques chez des animaux éveillés et en activité, afin d'en déterminer le rôle fonctionnel dans un comportement donné d'intérêt.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à contrôler en temps réel des populations de neurones définies génétiquement et spatialement chez des animaux éveillés et en activité, avec une résolution temporelle suffisante pour établir un lien entre les schémas d'activité neuronale et des états comportementaux complexes. Ce protocole implique l'utilisation de lasers de classe trois B et exige que la formation appropriée soit suivie et que les consignes de sécurité soient respectées. Des lunettes de protection doivent être portées en tout temps lors de l'utilisation des lasers, les procédures d'alignement présentant un risque particulièrement élevé. Après avoir configuré l'appareil laser conformément au protocole décrit, effectuez un couplage laser sans contact du laser bleu interne en positionnant d'abord les commutateurs situés à l'arrière du laser sur « cur » pour le courant et « TTL » pour le mode logique transistor-transistor, afin d'assurer une illumination constante à l'avant du pilote, puis vérifiez que le bouton de puissance est réglé sur zéro.Ensuite, allumez le laser en commençant par activer l'alimentation, puis en tournant la clé du laser. Pour garantir la sécurité oculaire, réglez lentement le bouton de puissance afin qu'environ un milliwatt de lumière laser soit émis. Attendez ensuite 10 à 15 minutes pour permettre au laser de se stabiliser thermiquement.Ensuite, connectez directement le testeur de câble à fibre optique à l'extrémité libre du cordon de raccordement du coupleur et allumez le testeur de câble. Réglez ensuite l'angle du coupleur de manière à ce que le faisceau rouge revienne droit vers le centre du miroir dichroïque. Le trajet du faisceau de lumière rouge émis par le testeur de câble correspond exactement au trajet que devra suivre la lumière laser entrante pour être couplée dans le laser.Pour effectuer un alignement de faisceau, utilisez les molettes latérales et horizontales des miroirs cinématiques afin de diriger le faisceau laser vers le coupleur. Ne vous inquiétez pas si aucune lumière bleue n'est émise par le cordon de raccordement fixé au coupleur à ce stade. Placez maintenant une seule feuille de papier semi-translucide directement devant le miroir dichroïque, entre le miroir dichroïque et le coupleur.Il y aura un point bleu et un point rouge du même côté de cette feuille, provenant respectivement du laser et du testeur de câble. Effectuez des réglages fins sur le premier miroir orientable en ajustant soigneusement les molettes latérale et horizontale afin d'aligner le centre du point rouge sur le point bleu. Replacez la feuille vers l'arrière, près du coupleur, de sorte qu'elle se trouve directement devant celui-ci, puis ajustez les molettes du second miroir dichroïque pour aligner le faisceau laser avec le faisceau rouge.Continuez à effectuer des réglages fins sur les deux miroirs jusqu'à ce que les centres des faisceaux bleu et rouge soient parfaitement alignés. Coline, retirez le testeur de câble du cordon coupleur. La lumière laser doit maintenant être introduite par l'extrémité du cordon de raccordement coupleur.Pour déterminer l'efficacité du couplage, utilisez un photomètre pour comparer la puissance lumineuse entrant dans le coupleur à la puissance lumineuse émise par l'extrémité de la fibre. Une efficacité de couplage supérieure à 80 % est considérée comme très bonne, tout en maintenant la position du miroir dichroïque. Utilisez les deux miroirs de guidage pour le laser jaune externe et suivez la procédure d'alignement qui vient d'être démontrée afin de coupler le laser jaune et configurer une fibre optique destinée à stimuler une souris unique.Commencez par utiliser l'adaptateur à emboîtement F-C-F-C-L directement fixé sur la platine d'essai afin de relier le cordon de raccordement du coupleur à un cordon de raccordement à gaine épaisse. Fixez un joint rotatif commutateur aux extrémités libres du cordon de raccordement à gaine épaisse. Ensuite, reliez le cordon de raccordement animal au commutateur.Fixer un manchon de raccordement fendu à l'extrémité métallique libre du cordon de l'animal sans enfoncer complètement le manchon. Laisser environ 0,5 centimètre de manchon exposé, car c'est cette partie qui se connecte à la fibre optique fixée à l'animal à l'aide d'un câble BNC. Relier le pilote laser bleu au générateur d'impulsions et allumer le générateur d'impulsions.Mettez maintenant des lunettes de sécurité appropriées. Ensuite, après vous être assuré que le bouton de puissance à l'avant du pilote est réglé sur zéro, allumez le laser en activant d'abord le pilote, puis la clé du laser avec le laser configuré en mode TT L positif. Réglez lentement le bouton à l'avant du laser et utilisez un photomètre pour établir une émission lumineuse de cinq à 10 milliwatts provenant de l'extrémité du cordon de raccordement de l'animal.Se reporter au protocole écrit pour plus de détails concernant ce paramètre. Passer le laser bleu en mode analogique pour la stimulation in vivo et attendre 10 à 15 minutes afin que le laser atteigne sa température de fonctionnement. Ensuite, immobiliser doucement la souris et raccorder le manchon fendu du cordon optique de l'animal à l'implant fibre optique chronique.Veillez à ce que les extrémités des deux fibres entrent en contact physique l'une avec l'autre en utilisant la fente du manchon de connexion comme fenêtre pour visualiser le contact direct entre les deux. Laissez la souris se remettre pendant quelques minutes avant le début des tests comportementaux. Ensuite, placez l'animal dans l'appareil de test comportemental, en veillant à ce que le cordon de connexion soit dégagé de tout accrochage.Utilisez le générateur d'impulsions pour faire clignoter un laser bleu à une fréquence prédéterminée qui activera l'option choisie. Après avoir terminé l'expérience, confirmez histologiquement le positionnement du virus et de la fibre, comme indiqué dans le protocole textuel accompagnant, afin d'interpréter correctement les résultats comportementaux. Sous un microscope, vérifiez le site d'expression de l'opsine et d'implantation de la fibre, et confirmez visuellement le positionnement adéquat de l'injection virale et de l'implant selon les coordonnées choisies.Dans cet exemple de résultats comportementaux obtenus par stimulation optogénétique in vivo, les neurones à dopamine de la zone ventrale, ou VTA, de souris exprimant la tyrosine hydroxylase ont été transduits soit par une opsine à fonction stable, soit par l’EYFP en tant que virus témoin, et un implant de fibre a été mis en place de manière chronique. Des groupes de souris ont été stimulés simultanément et leur comportement locomoteur a été enregistré pendant une heure, comme illustré ici. Une stimulation répétée des opsines chez la souris transduite représentée à gauche a entraîné un phénotype hyperactif qui s'est maintenu tout au long de la stimulation.Alors qu'aucun changement dans le comportement locomoteur n'a été observé chez la souris témoin à droite après les tests comportementaux, une immunohistochimie a été réalisée afin de confirmer le ciblage viral précis des neurones dopaminergiques de la VTA, et le positionnement des fibres a été vérifié visuellement, comme illustré sur cette figure une fois la technique maîtrisée. Cette méthode peut être utilisée pour manipuler l'activité neuronale dans n'importe quelle région cérébrale d'intérêt, en combinaison avec divers tests comportementaux servant de lecture fonctionnelle de la modulation des circuits neuronaux.

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