Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

L’expérience suivante décrit une méthode fiable, rapide et sans marquage qui utilise la calorimétrie de titrage isotherme pour déterminer quantitativement la thermodynamique et la cinétique des réactions enzymatiques en solution en utilisant la chaleur libérée et absorbée au fil du temps comme sonde interne. Ceci est réalisé en permettant à la réaction enzymatique de se produire dans la cellule d’échantillonnage de l’instrument à une température constante et en surveillant l’écart de la trace de chaleur par rapport à la ligne de base initiale. Dans une première expérience appelée Méthode 1 ou M1, le substrat est injecté dans la solution enzymatique et la chaleur pour la conversion complète du substrat est mesurée, ce qui permet de déterminer l’enthalpie molaire totale de la réaction.

Dans une deuxième expérience appelée méthode deux ou M deux, plusieurs injections du substrat sont effectuées, permettant de mesurer le taux de production de chaleur dans le temps à différentes concentrations de substrat. Les résultats obtenus à partir des deux expériences calor métriques ont permis de déterminer les paramètres cinétiques, kcat et km, en supposant une catalyse enzymatique meismenton. Le principal avantage de l’utilisation de la calorimétrie d’attrition isotherme par rapport à d’autres méthodes telles que les tests pétrophotométriques qui surveillent la formation du produit au fil du temps est que l’ITC ne nécessite aucune modification et étiquetage du système analysé et nécessite très peu de matériau car il utilise la chaleur intrinsèque de réaction comme une sonde interne démontrant la procédure sera lusai.

Un doctorant de notre laboratoire a d’abord dilué une solution concentrée de l’enzyme avec deux millilitres de tampon pour obtenir une concentration finale de l’enzyme dans la gamme des nanomolaires pour l’expérience M1. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de tampon à une solution concentrée du substrat pour obtenir une concentration de substrat d’au moins trois ordres de grandeur supérieure à la concentration enzymatique et supérieure au km. Pour l’expérience M deux, préparer une solution enzymatique de deux millilitres avec une concentration finale dans la gamme picaMolaire à nanomolaire.

Diluez le substrat avec 0,5 millilitre de tampon pour obtenir une concentration de substrat de l’ordre du millimolaire. Après avoir vérifié que la cellule d’échantillonnage et la seringue d’injection sont nettoyées conformément aux instructions du fabricant, remplissez la seringue de chargement avec de l’eau distillée. Ensuite, insérez doucement l’aiguille dans la cellule d’échantillonnage, remplissez la cellule et retirez le liquide en utilisant la méthode décrite précédemment, lavez la cellule d’échantillon deux fois avec de l’eau distillée et deux fois avec un tampon.

Injectez lentement la solution enzymatique dans la cellule jusqu’à ce qu’elle se répande par le haut de la tige cellulaire. Pour éliminer les bulles d’air piégées dans la cellule d’échantillon, produisez une giclée d’environ 0,25 millilitre de solution dans la cellule. Après avoir produit la poussée deux fois de plus.

Placez l’aiguille de la seringue de chargement sur le rebord entre la tige cellulaire et l’orifice cellulaire, et retirez tout excès de solution. Démarrez le programme VP viewer et équilibrez l’instrument ITC à une température inférieure de trois degrés Celsius à la température expérimentale souhaitée. Après avoir rempli la cellule de référence avec de l’eau distillée de la même manière que précédemment, reliez une seringue en plastique à l’orifice de remplissage de la seringue d’injection à l’aide d’un tube mince en silicone, placez l’embout de la seringue d’injection dans l’eau et remplissez la seringue jusqu’à ce que l’eau sorte de l’orifice de remplissage supérieur indiquant que la seringue d’injection est pleine.

Retirez ensuite l’embout de la seringue de l’eau et aspirez de l’air pour vider la seringue d’injection. En utilisant la même procédure, lavez la seringue d’injection avec un tampon et aspirez de l’air à travers le système. Ensuite, lavez la solution de substrat dans un tube propre et étroit.

Placez-le sous la seringue et insérez-y complètement l’aiguille de la seringue d’injection. Remplissez la seringue d’injection en laissant une petite quantité de solution au fond du tube à partir de l’interface informatique. Appuyez sur le port de remplissage pour fermer.

Une fois le tube de chargement en silicone retiré, appuyez sur purge et remplissez pour déloger les bulles d’air de la seringue d’injection et les expulser dans la solution en vrac. Ensuite, essuyez les côtés de la seringue d’injection avec une serviette en papier pour éliminer toute solution résiduelle et placez-la dans la cellule d’échantillonnage. Dans l’expérience M1, placez au moins deux additions de cinq à 30 microlitres de substrat pour vérifier la reproductibilité.

Réglez ensuite le temps d’espacement entre chaque injection suffisamment grand pour garantir que le signal thermique revient à la ligne de base avant l’ajout suivant. Dans l’expérience M deux, réglez plusieurs injections de cinq à 10 microlitres. Réglez l’intervalle entre les injections, ce qui permet au système de stabiliser la puissance thermique à la nouvelle ligne de base après chaque injection.

À ce stade, réglez la puissance de référence sur 20. Définissez ensuite les concentrations expérimentales d’enzymes et de substrats et choisissez un nom pour l’expérience. Réglez la température à 25 degrés Celsius et commencez l’expérience.

Une fois l’expérience terminée, nettoyez la cellule d’échantillonnage et la seringue selon les instructions du fabricant. Après avoir ouvert le logiciel origin 7.0, cliquez sur le bouton ouvrir et sélectionnez le fichier correspondant à la première injection dans la trace thermique de l’expérience M1. Pour déterminer le delta H de la réaction, intégrez le premier pic résultant de l’écart de la ligne de base dans le thermogramme de l’injection unique.

Expérience M1. Divisez ensuite la valeur de surface obtenue correspondant à la chaleur totale de réaction exprimée en microcalories par le substrat final, la concentration dans la cellule d’échantillon exprimée en micromolaires et le volume de la cellule d’échantillon exprimé en litre. Répétez la même procédure pour le deuxième pic de l’expérience M1 et faites la moyenne des valeurs obtenues pour les deux mesures delta H, déterminez ensuite DQ sur DT à partir de l’expérience M deux en mesurant la différence entre la ligne de base d’origine et la nouvelle ligne de base après chaque injection.

Cela peut être fait en convertissant les données expérimentales en vitesses de réaction selon l’équation suivante. En utilisant la valeur d’enthalpie obtenue dans l’expérience M1. Ajustez ensuite les données à l’équation de Michalis Menon en particulier à partir du programme d’analyse.

Cliquez sur le bouton Lire les données et accédez au dossier où se trouve l’expérience M deux. Cliquez ensuite sur la flèche de défilement vers le bas des fichiers de type et choisissez dosage enzymatique. Ensuite, cliquez et ouvrez le fichier.

Faites l’ITC de l’expérience M deux. Après l’ouverture de la boîte de dialogue du dosage enzymatique, sélectionnez le substrat de la méthode deux uniquement à partir de la fenêtre de la fenêtre delta H pour indiquer la valeur de delta H obtenue dans l’expérience M1. Ensuite, cliquez sur le bouton de l’axe des y zéro et double-cliquez juste avant le premier point d’injection.

Cliquez sur le bouton Calculer la dose pour tracer la dose en fonction de la concentration du substrat. Enfin, utilisez la fonction ajuster au modèle pour ajuster la courbe et obtenir la constance cinétique. L’activité lytique des URI de cannavale et de CMIS ou de haricot JAK a été choisie comme réaction représentative pour démontrer l’applicabilité de l’ITC dans la détermination quantitative de la catalyse enzymatique.

Une valeur delta H de moins 10,5 kilocalories par mole a été mesurée dans l’expérience M1 en intégrant la puissance thermique résultant de l’injection de substrat d’urée dans la solution d’uréase et en permettant à la réaction de se poursuivre jusqu’à son terme. La puissance thermique enregistrée dans l’expérience M deux a été convertie en vitesse de réaction à l’aide de l’équation suivante. L’ajustement des données obtenues à l’équation de McKayla Cementin a fourni les paramètres cinétiques de l’uréase du haricot JAK en tas de 20 millimolaires.

Le pH de sept comme kcat est égal à 30, 200 par seconde, et le KM est égal à 3,45 millimolaires, en accord avec les données précédemment rapportées. Le changement de chaleur total mesuré dans l’expérience M1 représente la somme de tous les événements survenus au cours de la réaction analysée, et dépend de l’enthalpie molaire de tous les processus impliqués, et pas seulement de la conversion substrat-produit. Dans un processus générique dans lequel le système réactif acquiert des protons dans une solution tamponnée, le tampon libère des protons produisant de la chaleur supplémentaire dans la cellule de réaction.

Par conséquent, le delta H mesuré est apparent et comprend le delta H intrinsèque de la réaction, ainsi que l’enthalpie d’ionisation du tampon et le nombre de protons échangés selon l’équation mise en évidence. En utilisant cette équation dans les expériences M1, le nombre de protons échangeurs et le delta H intrinsèque peuvent être déterminés en effectuant la même expérience dans des tampons avec des enthalpies d’ionisation différentes. La réaction globale d’hydrolyse de l’urée entraîne l’acquisition d’un proton à partir du tampon.

En conséquence, comme décrit ci-dessus, la chaleur de la réaction inclut la contribution de la protonation tampon d. Afin de calculer l’âge delta intrinsèque de la réaction d’hydrolyse, trois expériences M1 ont été réalisées dans différents tampons, caractérisés par trois enthalpies d’ionisation différentes connues. L’enthalpie intrinsèque et le nombre de protons libérés du tampon peuvent être calculés à partir de l’ordonnée à l’origine et de la pente de l’ajustement linéaire des données expérimentales.

Ils étaient respectivement négatifs de 14,7 kilocalories par mole et de 0,98, en plein accord avec les données précédemment rapportées. Les applications de cette procédure s’étendent de la recherche fondamentale à la recherche appliquée et au criblage de médicaments, comme une fois que la cinétique de la réaction enzymatique a été déterminée. L’expérience peut être répétée en présence de différents types et concentrations d’inhibiteurs enzymatiques afin de surveiller l’inhibition, les constantes.