Name: Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Découvrez la calorimétrie de titration isotherme pour caractériser les réactions enzymatiques sans marquage. Cette méthode permet de déterminer les paramètres cinétiques kcat et km avec précision.

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Une. Préparation des échantillons <ol><li> Préparer 2 ml de solution d&#39;enzyme et 0,5 ml d&#39;une solution de substrat pour chaque série expérimentale. Diluer les solutions mères concentrées de l&#39;enzyme et du substrat dans des solutions tampons ayant une composition identique à minimiser la chaleur de dilution et de mélange au cours de l&#39;addition du substrat. <ol><li> Choisissez les conditions de tampon qui sont adéquates pour prévenir les changements de pH pendant l&#39;expérience. Par exemple, 20 mM HEPES pH 7 est adéquate pour des mesures à pH neutre. REMARQUE: si l&#39;échange de proton est impliquée, les enthalpies de protonation des tampons utilisés doivent être considérées, car elles affectent l&#39;AH de mesure de la réaction. Effets spécifiques possibles du tampon ou des molécules des additifs sur le système en cours d&#39;analyse doivent être pris en compte. Si des solvants organiques (par exemple le DMSO) sont inclus dans la solution d&#39;enzyme, les ajouter à la même concentration dans la solution de substrat. </li><li> Pour l&#39;expérience M1, commenceravec la concentration d&#39;enzyme dans la plage nM (par exemple de 1 nM) et avec une concentration de substrat d&#39;au moins trois ordres de grandeur plus élevée que la concentration en enzyme et au-dessus de la K M. </li><li> Pour l&#39;expérience M2, commencer avec la concentration de l&#39;enzyme dans la gamme pM-nM (par exemple 15 heures). concentration du substrat dans la seringue est dans la gamme mM (par exemple, 400 mM). NOTE: Dans l&#39;expérience unique d&#39;injection M1, les concentrations devraient être suffisants pour obtenir la conversion de substrat totale dans le produit au cours de la durée de l&#39;essai. Par conséquent, la concentration de l&#39;enzyme dépend de la vitesse de l&#39;enzyme: si les enzymes ayant un faible k cat sont à l&#39;étude, les concentrations d&#39;enzymes élevés (jusqu&#39;à 10 uM) doivent être utilisés. D&#39;autre part, les concentrations enzymatiques utilisées dans l&#39;expérience M2 doivent assurer que le substrat est injecté seulement marginalement (moins de 5%) consommée et que la réaction enzymatique se déroule à l&#39;état d&#39;équilibre. Pour cette raison, plus lal&#39;efficacité de l&#39;enzyme, plus faible est la concentration de l&#39;enzyme nécessaire. A la fin de l&#39;expérience, la concentration du substrat dans la cellule d&#39;échantillonnage doit être supérieure à K M. </li></ol></li><li> Vérifiez soigneusement enzyme et des concentrations de substrat avec une méthode d&#39;analyse appropriée (par exemple l&#39;absorption à 280 nm, colorimétriques, les dosages de BCA 11. Cela est nécessaire pour obtenir un calcul précis et fiable des paramètres thermodynamiques et cinétiques. </li><li> Mesurer le pH des solutions et vérifier que le décalage de pH à la fois l&#39;enzyme et les solutions de substrat est minimale dans les conditions expérimentales (± 0,05 unité de pH). </li></ol> 2. Exécution de l&#39;expérience REMARQUE: La même procédure doit être appliquée à la fois pour le M1 et M2 de l&#39;expérience, qui sont réalisées l&#39;une après l&#39;autre. <ol><li> Vérifier que la cellule d&#39;échantillonnage et de la seringue d&#39;injection sont nettoyés après le fabricant deinstructions. Remplir la seringue de chargement fournie avec l&#39;instrument à l&#39;eau distillée, insérez délicatement l&#39;aiguille dans la cellule de l&#39;échantillon, remplir la cellule et enlever le liquide en utilisant la même seringue. En utilisant cette méthode, laver la cellule d&#39;échantillonnage deux fois avec de l&#39;eau distillée et deux fois avec le tampon. </li><li> Charger la cellule d&#39;échantillonnage avec 2 ml de solution d&#39;enzyme à l&#39;aide de la seringue de chargement, en évitant soigneusement formation de bulles d&#39;air. Injecter lentement la solution dans la cellule jusqu&#39;à ce qu&#39;il se déverse sur la partie supérieure de la tige de la cellule. Produire une poussée de ca. 0,25 ml de solution dans la cellule. Répéter deux fois. Cette étape élimine les bulles d&#39;air piégées dans la cellule d&#39;échantillon. </li><li> Placer l&#39;aiguille de la seringue de chargement sur le rebord entre la tige de la cellule et l&#39;orifice de la cellule et retirer tout excès de solution. </li><li> Démarrez le programme VP-Viewer et, à partir de l&#39;interface de l&#39;ordinateur, équilibrer l&#39;instrument ITC à une température de 3 ° C en dessous de la température expérimentale souhaitée. Cela est nécessaire pour éviter les longues équilibrationles périodes antérieures à l&#39;expérience, à cause de l&#39;appareil de refroidissement passif instrumentale. </li><li> Remplir la cellule de référence avec de l&#39;eau distillée avec le même mode opératoire ci-dessus. Lorsque les tampons ayant une force ionique élevée ou élevée sont osmolalité dans la solution d&#39;échantillon, le même tampon doit être utilisé en tant que solution de référence. </li><li> Relier une seringue en plastique à l&#39;orifice de remplissage de la seringue d&#39;injection, à l&#39;aide d&#39;un tube mince de silicium. Remplir la seringue d&#39;injection de placer la pointe de l&#39;aiguille dans l&#39;eau et en tirant vers le haut, jusqu&#39;à ce que l&#39;eau qui sort de l&#39;orifice de remplissage par le haut, ce qui indique que la seringue d&#39;injection est remplie. Déplacez ensuite le bout de la seringue de l&#39;eau et dresser l&#39;air, pour vider la seringue d&#39;injection. Avec cette procédure, laver la seringue d&#39;injection avec un tampon, et aspirer l&#39;air à travers le système. Par la suite, placer l&#39;aiguille d&#39;injection dans un tube étroit contenant 0,5 ml de solution de substrat, soigneusement élaborer et de remplir complètement la seringue d&#39;injection, ce qui laisse peu de solution au fond du tube. </li><li> De l&#39;interface de l&#39;ordinateur, appuyez sur &quot;Fermer remplissage port&quot;. Retirer le tube de chargement de silicium. Appuyez sur &quot;Purge et recharge&quot; pour permettre à la seringue d&#39;injection pour déloger les bulles d&#39;air et de les expulser de nouveau dans la solution globale. Répéter deux fois. </li><li> Déplacer la seringue d&#39;injection, essuyer sur les côtés pour enlever les gouttes et placer l&#39;aiguille de la seringue d&#39;injection dans la cellule d&#39;échantillon. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, définissez les paramètres de fonctionnement appropriés. L&#39;enzyme expérimental et des concentrations en substrat peuvent être indiquées. <ol><li> Dans l&#39;expérience M1, mettre au moins deux ajouts (5-30 pi) de substrat pour vérifier la reproductibilité. Réglez l&#39;heure de l&#39;espacement entre chaque injection (par exemple 1000 sec) suffisamment large pour assurer que les retours de signaux de chaleur à la ligne de base avant la prochaine addition. </li><li> Dans l&#39;expérience M2, mis multiple (par exemple 15 x 5-10 pi) injections. Définissez l&#39;intervalle entre les injections (par exemple 180 sec) permettant au système de stabilize la puissance thermique à la nouvelle ligne de base après chaque injection. NOTE: Le temps d&#39;espacement entre les injections dans l&#39;expérience M2 doit être suffisamment courte pour éviter la conversion d&#39;une quantité importante de substrat, ce qui permet les mesures soient effectuées dans des conditions de régime permanent. </li><li> Dans l&#39;expérience M2, utiliser de petits volumes (par exemple 2 pi) pour la première injection, dont la valeur correspondante est éliminée au cours de l&#39;analyse ultérieure des données. En effet, il présente souvent des artefacts dus à la diffusion initiale de substrat à travers l&#39;embout de la seringue, et pour la présence de bulles d&#39;air emprisonnées dans l&#39;aiguille de la seringue. </li><li> Réglez la puissance de référence, le niveau approximatif dans lequel la ligne de base sera placé avant la réaction commence, à une valeur de 20. Définissez ensuite l&#39;enzyme expérimental et des concentrations de substrat et choisir un nom pour l&#39;expérience. </li><li> Définir la température expérimentale, typiquement à 25 ° C. ITC permet des températures de travail entre 2<html> ° C et 80 ° C. L&#39;expérience est prêt pour l&#39;exécution. Appuyez sur le bouton &quot;Démarrer&quot; pour lancer l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Une fois l&#39;expérience terminée, nettoyer la cellule d&#39;échantillonnage et la seringue selon les instructions du fabricant. </li><li> Répétez l&#39;expérience au moins une ou deux fois de plus pour vérifier la reproductibilité des données. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Dans le programme d&#39;analyse, cliquez sur le bouton &quot;Lecture des données&quot;, et naviguez vers le dossier où le fichier de l&#39;expérience réalisée M2. Itc est situé. Cliquez sur la flèche déroulante de la &quot;Type de fichiers&quot; et sélectionnez &quot;Enzyme Assay (il?)&quot;. Par la suite, cliquez sur et ouvrez le fichier de l&#39;expérience M2. Itc. </li><li> Obtenir l&#39;AH de la réaction à partir de l&#39;intégration de la courbe de l&#39;expérience M1 conformément à l&#39;équation 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Cliquez sur le bouton &quot;Lecture des données&quot;, et sélectionnez le fichier. CCI de l&#39;expérience M1 effectué. Utilisation origine, diviser la trace dans différentes parties contenant un pic pièce et économisez chaque pic en tant que fichier OPJ.. Ouvrir le fichier correspondant au premier pic, résultant de la déviation de référence dans le thermogramme de l&#39;expérience unique M1 d&#39;injection, intégrer et diviser la valeur de la surface obtenue, exprimée en μcal, par la concentration finale en substrat dans la cellule de l&#39;échantillon, exprimée en uM, et par le volume de cellule exprimé en litres, la détermination, conformément à l&#39;équation 5, l&#39;AH de la réaction. </li><li> Répétez la même procédure pour le deuxième pic de l&#39;expérience M1 et obtenir une valeur moyenne pour les deux mesures de AH. </li></ol></li><li> Déterminer dQ / dt à partir de l&#39;expérience M2 mesurer la différence entre la valeur de référence initiale et la nouvelle ligne de base après chaque injection. Convertir le eXperimental données à des vitesses de réaction en fonction de l&#39;équation 4, en utilisant la valeur de l&#39;enthalpie obtenue dans l&#39;expérience M1 et accrocher les données à l&#39;équation de Michaelis-Menten. <ol><li> Dans le programme d&#39;analyse, cliquez sur le bouton &quot;Lecture des données&quot;, et sélectionnez le fichier. CCI de l&#39;expérience réalisée M2. Cliquez sur la flèche déroulante de la &quot;Type de fichiers&quot; et sélectionnez &quot;Enzyme Assay (il?)&quot;. </li><li> La boîte de dialogue Enzyme Assay s&#39;ouvre, permettant la sélection de l&#39;un des quatre modèles. Sélectionnez &quot;Méthode 2 - Substrat seulement&quot; de la fenêtre. </li><li> Dans la fenêtre AH, indiquer la valeur de AH obtenu à l&#39;étape 4.2. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Concentration&quot; pour vérifier les valeurs de concentration pour être utilisé dans la procédure d&#39;ajustement. Cliquez sur le bouton &quot;Temps moyen (P)&quot;. La boîte de dialogue s&#39;ouvre donnant la possibilité de changer ou accepter la valeur par défaut. Cette valeur représente le temps avant chaque injectionion, dans lequel les moyennes de l&#39;appareil le signal de puissance pour déterminer le niveau de puissance à chaque concentration de substrat. Cliquez sur OK pour confirmer la valeur par défaut. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;zéro Axe Y&quot;. Le curseur se transforme en une croix permettant de double-cliquer sur un point, de mettre à y = 0. Double-cliquez juste avant le premier point d&#39;injection. </li><li> Cliquez sur le bouton Calculer Taux d&#39;. Rate est tracée en fonction de la concentration du substrat, obtenu en divisant le substrat ajouté au cours du titrage pour le volume de la cellule de l&#39;échantillon (en tenant compte des effets de dilution). Cette opération donne un terrain typique de Michaelis-Menten qui peut être monté pour obtenir K M et k cat. </li><li> Si certains points doivent être supprimés, cliquez sur le bouton &quot;Tronquer données&quot;. Déplacez les marqueurs de données pour exclure les points de données mauvaises et double-cliquez sur un des marqueurs ou appuyez sur Entrée. </li><li> Utilisez la fonction &quot;Ajuster à modéliser&quot; pour s&#39;adapter à la courbe et àobtenir les constantes cinétiques. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;importance de l&#39;ITC pour étudier l&#39;activité enzymatique par rapport aux méthodes existantes En plus de ses applications classiques pour étudier les équilibres de liaison, calorimétrie de titration isotherme offre une méthode fiable et rapide pour caractériser les réactions enzymatiques en solution en utilisant la chaleur de réaction comme une sonde, sans nécessiter de modification ou l&#39;étiquetage système. Les paramètres cinétiques kcat et</sub...

La détermination quantitative de réactions biochimiques permet de mieux comprendre les processus biologiques à la base de la vie. Calorimétrie propose une méthodologie sans étiquette pour caractériser quantitativement pratiquement toutes les réactions chimiques en solution. Cette technique mesure la chaleur dégagée ou absorbée au fil du temps, et est donc un système de détection universel et une méthodologie très pratique pour quantifier la quantité de molécules réagissant (c.-à-thermodynamique de liaison), ainsi que pour mesurer la vitesse de réaction (c.-à-cinétique). En particulier, calorimétrie de titration isotherme (ITC) a été adopté comme méthode de choix pour caractériser la thermodynamique des équilibres biomoléculaires, impliquant la protéine-ligand, protéine-protéine, protéine-ions métalliques et des interactions protéine-ADN 1-6. En outre, la capacité de l&#39;ITC de fournir des informations cinétique en fait un système très puissant pour mesurer la catalyse enzymatique, bien que le potentiel de cette application est encoresous-estimé 7-9. L&#39;équation de Michaelis-Menten 10 est une description quantitative des réactions enzymatiques, car il fournit une relation entre la vitesse de réaction et la concentration du substrat, en fonction de deux paramètres cinétiques: la constante de Michaelis (K M) et la constante de vitesse catalytique (k cat) . Le k cat / rapport K M est mentionné comme l&#39;efficacité catalytique d&#39;une enzyme. Dans la pratique, la détermination de K et M k cat pour une réaction spécifique fournit une description complète de la catalyse. Dans une réaction enzymatique typique (figure 1), un substrat (S) interagit avec l&#39;enzyme (E) la formation du complexe enzyme-substrat (ES), qui est ensuite activé dans l&#39;état de transition (ES *). Celui-ci est converti en le complexe enzyme-produit (EP) qui se dissocie éventuellement. Ces étapes sont décrits par la réaction suivante. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) où k 1 est la constante de vitesse pour la formation du complexe ES, k-1 est la constante de vitesse de la dissociation du complexe ES, tandis que k cat est la constante de vitesse catalytique ou le numéro de chiffre d&#39;affaires. Selon l&#39;équation de Michaelis-Menten 10, la vitesse de la réaction peut être calculé comme suit: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) dans laquelle K = M (k-1 + k cat) / k 1 et k cat = v max / [E], avec v max étant la vitesse maximale atteinte lorsque tous enzyme est lié au substrat. La titration calorimétrique isotherme est l&#39;instrument utilisé dans cette étude pour caractériser l&#39;hydrolyse enzymatique de l&#39;urée. Cet instrument est constitué d&#39;un écran adiabatique contenant deux cellules en forme frappées (figure 1). Ceux-ci sont connectés à l&#39;extérieur par des tubes d&#39;accès étroits. La cellule de l&#39;échantillon (environ 1,4 ml) est chargé avec la solution d&#39;enzyme, tandis que la cellule de référence est généralement remplie avec de l&#39;eau ou avec le solvant utilisé pour l&#39;analyse. Une seringue en rotation avec une longue aiguille et une palette d&#39;agitation attaché, contenant habituellement ca. 0,3 ml de solution de substrat, est monté sur la cellule d&#39;échantillon. Un dispositif thermoélectrique mesure la différence de température entre l&#39;échantillon et la cellule de référence et, à l&#39;aide d&#39;un &quot;réseau de contre-réaction de la cellule&quot;, il maintient cette différence à zéro par addition ou soustraction de chaleur. Pendant l&#39;expérience, le substrat est injecté dans la solution d&#39;enzyme à une température constante choisie. Lorsque la sallezymatic réaction a lieu, la quantité de chaleur libérée ou absorbée est proportionnelle au nombre de molécules de substrat qui sont converties en molécules de produit. En outre, le taux de flux de chaleur est directement liée à la vitesse de la réaction. Les données mesurées, apparaissant comme un écart de la trace de la chaleur à partir de la ligne de base initiale (figure 1), représentent la puissance thermique (μcal / sec) fournie par l&#39;instrument de la cellule d&#39;échantillon, qui est proportionnel au flux de chaleur se produisant dans la cellule d&#39;échantillonnage au fil du temps. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Représentation schématique de titration calorimétrique isotherme d&#39;étudier les réactions enzymatiques. Une réaction enzymatique se produisant lors de la titration de substrat (dans la seringue d&#39;injection) dans la solution d&#39;enzyme (dans la cellule d&#39;échantillon) a pour résultat un changement de la therpuissance mal dégagée par le calorimètre, nécessaire pour maintenir la différence de température entre la cellule de l&#39;échantillon et la constante de la cellule de référence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Dans l&#39;ensemble, le changement de chaleur (Q) est proportionnelle à l&#39;enthalpie molaire de la réaction (AH) et le nombre de moles de produit généré (n), qui à son tour est donné par le temps de volume total de la concentration: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) La formation de produit avec le temps (dP / dt), qui correspond à la vitesse de la réaction, peut ainsi être liée à la quantité de chaleur engendrée pendant la même période (dQ / dt) par la relation: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Selon cette équation, afin d&#39;obtenir un Michaelis-Menten Parcelle il est nécessaire de mesurer i) l&#39;enthalpie molaire totale AH, et ii) l&#39;écoulement dQ / dt de la chaleur à différentes concentrations de substrat. Habituellement, ceci est effectué dans deux expériences différentes: dans la première expérience (méthode 1, M1), le substrat est injecté dans la solution d&#39;enzyme et de la chaleur pour la conversion complète du substrat est mesurée; dans la seconde expérience (méthode 2, M2), de multiples injections de substrat sont effectuées et le taux de production de chaleur est mesuré à différentes concentrations de substrat. Ces deux ensembles de données sont suffisantes pour calculer les paramètres cinétiques K M et k cat. Dans le présent article, un protocole général pour déterminer les paramètres cinétiques pour les réactions enzymatiques réalisées à l&#39;aide ITC est décrite. Nous avons appliqué la méthode à hydrolyse de l&#39;urée par Canavalia de l&#39;uréesoi, comme un système de référence. Le bon accord entre les résultats obtenus en utilisant cette méthode et les données rapportées dans la littérature démontre la fiabilité de cette approche.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>se dissout dans l’eau et ajuste le pH avec le NaOH</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>se dissout dans l’eau et ajuste le pH avec le HCl</td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>se dissout dans l’eau</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>se dissout dans l’eau</td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma</td><td>U4128</td><td>se dissolvant dans l’eau à 40 &deg ; C</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis uréase (type C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td><td>se dissolvant dans 20 mM HEPES pH 7 et stocké à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>VP-ITC sur</td> <td>l’instrument</td><td></td> Origin 7.0 <td>MicroCal (GE Healthcare)</td>SYS13901</tr><tr><td>VPViewer2000 1.30.00 sur Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td><td>logiciel d’acquisition de données fourni avec l’instrument</td></tr></tbody></table>

hot catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques réactions

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Calorimétrie de titration isotherme (ITC) est une technique bien décrite qui mesure la chaleur dégagée ou absorbée au cours d&#39;une réaction chimique, en l&#39;utilisant comme une sonde intrinsèque de caractériser pratiquement tous les processus chimiques. De nos jours, cette technique est largement utilisée pour déterminer des paramètres thermodynamiques des équilibres de liaison biomoléculaires. En outre, le CCI a été démontré pour être en mesure de mesurer directement la cinétique et les paramètres thermodynamiques (k chat, K M, AH) de réactions enzymatiques, même si cette application est encore sous-exploité. Comme les changements thermiques se produisent spontanément au cours de la catalyse enzymatique, le CCI ne nécessite aucune modification ou l&#39;étiquetage du système en cours d&#39;analyse et peut être réalisée en solution. En outre, le procédé a besoin de peu de quantité de matière. Ces propriétés font de l&#39;ITC un outil précieux, unique et puissant pour étudier la cinétique enzymatique dans plusieurs applications, telles que, par exemple, la découverte de médicaments. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Dans ce travail, une méthode basée sur ITC expérimentale pour quantifier la cinétique et la thermodynamique des réactions enzymatiques est décrit en détail. Cette méthode est appliquée pour déterminer k cat M et K de l&#39;hydrolyse enzymatique de l&#39;urée par Canavalia ensiformis (jack bean) uréase. Calcul de l&#39;enthalpie molaire intrinsèque (AH int) de la réaction est effectuée. Les valeurs ainsi obtenues sont en accord avec les données précédentes rapportés dans la littérature, ce qui démontre la fiabilité de la méthode.

Uréase (CE 3.5.1.5; urée amidohydrolase) est une enzyme contenant du nickel unités multiples trouvée dans archées, les bactéries, eucaryotes unicellulaires et les plantes. Ceci agit de protéines dans la dernière étape de minéralisation de l&#39;azote organique, catalysant l&#39;hydrolyse de l&#39;urée en ammoniac et de carbamate, qui se décompose spontanément pour donner une deuxième molécule d&#39;ammoniac et de bicarbonate (Equation 6) 12. <img fo:content-width="...

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d&#39;exécution, et l&#39;analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l&#39;urée par l&#39;uréase jack bean.

Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

L'expérience suivante décrit une méthode fiable, rapide et sans étiquette qui utilise la calorimétrie de titrage isotherme pour déterminer de façon quantitative la thermodynamique et la cinétique des réactions enzymatiques en solution, en exploitant la chaleur dégagée et absorbée au cours du temps comme sonde interne. Ceci est réalisé en permettant à la réaction enzymatique de se produire dans la cellule d'échantillonnage de l'appareil à température constante et en surveillant l'écart de la courbe thermique par rapport à la ligne de base initiale. Dans une première expérience appelée méthode un ou M1, le substrat est injecté dans la solution d'enzyme et la chaleur correspondant à la conversion complète du substrat est mesurée, ce qui permet de déterminer l'enthalpie molaire totale de la réaction.Dans une deuxième expérience appelée méthode deux ou M deux, plusieurs injections du substrat sont effectuées, permettant ainsi la mesure du taux de production de chaleur en fonction du temps à différentes concentrations de substrat. Les résultats obtenus à partir des deux expériences calorimétriques ont permis de déterminer les paramètres cinétiques, kcat et km, en supposant une catalyse enzymatique de type Michaelis-Menten. Le principal avantage de l'utilisation de la calorimétrie d'adsorption isotherme par rapport à d'autres méthodes telles que les dosages spectrophoto­métriques, qui suivent la formation du produit en fonction du temps, réside dans le fait que la calorimétrie à transfert d'ions (ITC) ne nécessite aucune modification ni marquage du système analysé et requiert une très faible quantité de matériau, car elle utilise la chaleur intrinsèque de la réaction comme sonde interne. La procédure sera illustrée par Lusai.Un étudiant en doctorat de notre laboratoire dilue d'abord une solution concentrée de l'enzyme avec deux millilitres de tampon afin d'obtenir une concentration finale d'enzyme dans la gamme du nanomolaire pour l'expérience M1. Ensuite, ajouter 0,5 millilitre de tampon à une solution concentrée de substrat pour obtenir une concentration de substrat supérieure d'au moins trois ordres de grandeur à la concentration d'enzyme et au-dessus du km. Pour l'expérience M2, préparer une solution d'enzyme de deux millilitres avec une concentration finale dans la gamme du picomolaire au nanomolaire.Diluez le substrat avec 0,5 millilitre de tampon afin d'obtenir une concentration de substrat dans la gamme millimolaire. Après avoir vérifié que la cellule d'échantillon et la seringue d'injection ont été nettoyées conformément aux instructions du fabricant, remplissez la seringue de chargement avec de l'eau distillée. Insérez ensuite délicatement l'aiguille dans la cellule d'échantillon, remplissez la cellule et retirez le liquide en utilisant la méthode décrite précédemment, puis rincez la cellule d'échantillon deux fois avec de l'eau distillée et deux fois avec du tampon.Injectez lentement la solution enzymatique dans la cellule jusqu'à ce qu'elle déborde par le haut de la tige de la cellule. Pour éliminer les bulles d'air piégées dans la cellule, provoquez un jet d'environ 0,25 millilitre de solution dans la cellule. Répétez ce jet deux fois supplémentaires.Placez l'aiguille de la seringue de chargement sur le rebord situé entre la tige de la cellule et le port de la cellule, puis retirez tout excès de solution. Lancez le programme VP Viewer et équilibrez l'appareil ITC à une température inférieure de trois degrés Celsius à la température expérimentale souhaitée. Après avoir rempli la cellule de référence avec de l'eau distillée de la même manière qu'auparavant, reliez une seringue en plastique au port de remplissage de la seringue d'injection à l'aide d'un tube en silicone fin, placez l'extrémité de la seringue d'injection dans l'eau et remplissez la seringue jusqu'à ce que l'eau sorte par le port supérieur de remplissage, indiquant ainsi que la seringue d'injection est pleine.Ensuite, retirez l'extrémité de la seringue de l'eau et aspirez de l'air pour vider la seringue d'injection. À l'aide de la même procédure, rincez la seringue d'injection avec du tampon et faites passer de l'air dans le système. Ensuite, introduisez la solution de substrat dans un tube propre et étroit.Placez-le sous la seringue et insérez complètement l'aiguille de la seringue d'injection. Remplissez la seringue d'injection, en laissant une petite quantité de solution au fond du tube provenant de l'interface informatique. Appuyez sur fermer le port de remplissage.Une fois le tube de chargement en silicium retiré, appuyez sur les fonctions de purge et de remplissage pour déloger les bulles d'air présentes dans la seringue d'injection et les expulser dans la solution principale. Ensuite, essuyez les parois de la seringue d'injection avec un papier absorbant afin d'éliminer toute solution résiduelle, puis placez-la dans la cellule d'échantillonnage. Dans l'expérience M1, effectuez au moins deux ajouts de cinq à trente microlitres de substrat afin de vérifier la reproductibilité.Ensuite, régler l'intervalle de temps entre chaque injection suffisamment long pour garantir que le signal thermique revienne à la ligne de base avant l'ajout suivant. Dans l'expérience M two, effectuer plusieurs injections de cinq à dix microlitres. Régler l'intervalle entre les injections de manière à permettre au système de stabiliser la puissance thermique à la nouvelle ligne de base après chaque injection.À ce stade, régler la puissance de référence à 20. Ensuite, définir les concentrations expérimentales de l'enzyme et du substrat et choisir un nom pour l'expérience. Régler la température à 25 degrés Celsius et démarrer l'expérience.Une fois l'expérience terminée, nettoyez la cellule d'échantillonnage et la seringue conformément aux instructions du fabricant. Après avoir ouvert le logiciel Origin 7.0, cliquez sur le bouton « ouvrir » et sélectionnez le fichier correspondant à la première injection dans le tracé thermique de l'expérience M1. Pour déterminer le delta H de la réaction, intégrez le premier pic résultant de l'écart par rapport à la ligne de base dans le thermogramme de l'injection unique.Expérience M1. Ensuite, diviser la valeur de surface obtenue, correspondant à la chaleur totale de réaction exprimée en microcalories, par la concentration finale du substrat dans la cellule d'échantillonnage exprimée en micromolaire et par le volume de la cellule d'échantillonnage exprimé en litre. Répéter la même procédure pour le deuxième pic de l'expérience M1 et faire la moyenne des valeurs obtenues pour les deux mesures de ΔH. Déterminer ensuite DQ/DT à partir de l'expérience M2 en mesurant la différence entre la ligne de base initiale et la nouvelle ligne de base après chaque injection.Cela peut être fait en convertissant les données expérimentales en vitesses de réaction selon l'équation suivante. En utilisant la valeur d'enthalpie obtenue dans l'expérience M1. Puis ajuster les données à l'équation de Michalis-Menten, en particulier à l'aide du programme d'analyse.Cliquez sur le bouton lire les données et accédez au dossier où l'expérience M two a été enregistrée. Ensuite, cliquez sur la flèche de défilement vers le bas dans la liste des types de fichiers et sélectionnez enzyme assay. Cliquez ensuite sur le fichier et ouvrez-le.Réalisez la CMI de l'expérience M deux. Une fois la boîte de dialogue du dosage enzymatique ouverte, sélectionnez la méthode deux substrats uniquement dans la fenêtre, puis dans la fenêtre delta H, indiquez la valeur de delta H obtenue lors de l'expérience M1. Ensuite, cliquez sur le bouton d'origine de l'axe des y et double-cliquez juste avant le premier point d'injection.Cliquez sur le bouton calculer le taux pour tracer le taux en fonction de la concentration en substrat. Enfin, utilisez la fonction d'ajustement du modèle pour ajuster la courbe et obtenir la constante cinétique. L'activité lytique de cannavale et de CMIS ou d'URIs de haricot JAK a été choisie comme réaction représentative afin de démontrer l'applicabilité de la CIT pour déterminer quantitativement la catalyse enzymatique.Une valeur ΔH de −10,5 kilocalories par mole a été mesurée dans l'expérience M1 en intégrant la puissance thermique résultant de l'injection du substrat urée dans la solution d'uréase et en laissant la réaction s'achever complètement. La puissance thermique enregistrée dans l'expérience M2 a été convertie en vitesse de réaction à l'aide de l'équation suivante. L'ajustement des données obtenues à l'équation de McKayla Cementin a fourni les paramètres cinétiques de l'uréase JAK bean dans du HEPS 20 millimolaire.pH sept, car kcat est égal à 30 200 par seconde et KM à 3,45 millimolaire, en accord avec les données précédemment rapportées. La variation totale de chaleur mesurée dans l'expérience M1 représente la somme de tous les événements survenant pendant la réaction analysée, et dépend de l'enthalpie molaire de tous les processus impliqués, et non seulement de la conversion du substrat en produit. Dans un processus générique au cours duquel le système réactionnel acquiert des protons dans une solution tamponnée, le tampon libère des protons, produisant ainsi une chaleur supplémentaire dans la cellule de réaction.Par conséquent, le delta H mesuré est apparent et inclut le delta H intrinsèque de la réaction, ainsi que l'enthalpie d'ionisation du tampon et le nombre de protons échangés selon l'équation mise en évidence. En utilisant cette équation dans les expériences M1, le nombre de protons échangés et le delta H intrinsèque peuvent être déterminés en réalisant la même expérience dans des tampons présentant différentes enthalpies d'ionisation. La réaction globale d'hydrolyse de l'urée conduit à l'acquisition d'un proton provenant du tampon.Par conséquent, comme décrit ci-dessus, la chaleur de la réaction comprend la contribution de la protonation du tampon. Afin de calculer l'enthalpie intrinsèque de la réaction d'hydrolyse, trois expériences M1 ont été réalisées dans différents tampons, caractérisés par trois enthalpies d'ionisation connues et distinctes. L'enthalpie intrinsèque et le nombre de protons libérés par le tampon peuvent être calculés à partir de l'ordonnée à l'origine et de la pente de l'ajustement linéaire des données expérimentales.Ils étaient respectivement de -14,7 kilocalories par mole et de 0,98, en parfait accord avec les données rapportées précédemment. Les applications de cette procédure s'étendent de la recherche fondamentale à la recherche appliquée et au criblage de médicaments, une fois que la cinétique de la réaction enzymatique a été déterminée. L'expérience peut être répétée en présence de différents types et concentrations d'inhibiteurs d'enzymes afin de surveiller les constantes d'inhibition.

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