Caractérisation des récepteurs de protéines G couplées par une mobilisation de calcium dosage à base de fluorescence

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier les ligands activant fonctionnellement les récepteurs orphelins couplés aux protéines G ou G PCR. Ceci est réalisé en transectant transitoirement, A-G-P-C-R d’intérêt et en transectant une construction G alpha 16 de promiscuité dans un système d’expression cellulaire pour obtenir une expression hétérologue temporaire des deux protéines. Dans un deuxième temps, les cellules transfectées sont chargées avec le colorant sensible au calcium grippe oh quatre, qui détecte la libération de calcium des réserves intracellulaires grâce à une augmentation du signal fluorescent lors de l’interaction du calcium.

Ensuite, le test de mobilisation du calcium basé sur la fluorescence est effectué en mettant au défi le récepteur exprimé hétérologue avec une bibliothèque de composés de ligands candidats pour déterminer les composés qui activent le récepteur et provoquent une cascade de signalisation intracellulaire entraînant la libération de calcium du réticulum endoplasmique, qui peut être mesuré comme un signal fluorescent. On obtient des résultats qui montrent une courbe de réponse de concentration avec la concentration effective demi-maximale d’un ligand activateur, qui est basée sur la détection de différents signaux fluorescents en fonction des concentrations de ligands administrés au système d’expression cellulaire. Le principal avantage de la réalisation d’un transfect transitoire pour obtenir l’expression temporaire de votre RCPG par rapport à l’utilisation de lignées cellulaires clonales stables est qu’il ne nécessite pas l’établissement fastidieux de lignées cellulaires transfectées de manière stable.

La transfection de la sous-unité G alpha 16 de promiscuité peut rediriger la voie de signalisation intracellulaire de la plupart des RCPG vers la libération de calcium, quelle que soit la voie de signalisation native dans les milieux endogènes. En tant que tel, ce dispositif permet le criblage à moyen débit de centaines de composés sur les RCPG d’intérêt dans un court laps de temps, démontrant que la procédure sera un gaz jaune, un doctorant et Nick Su, un technicien de notre laboratoire Cultivez les cellules T 2 93 dans des flacons T 75 trois jours avant que le test de mobilisation du calcium n’ait lieu, passage des cellules lorsqu’une confluence de 80 % est atteinte. Préparez une fiole T 75 pour la transfection avec la construction réceptrice et une autre pour la transfection avec un vecteur d’expression vide comme témoin négatif.

Incuber les flacons à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 20 à 24 heures jusqu’à ce que les cultures cellulaires approchent de 50 à 70 % de confluence, comme indiqué ici. Ensuite, ajoutez 3,9 microgrammes du récepteur Construct ou vecteur vide et 3,9 microgrammes de l’expression G alpha 16 Construct dans un tube de micro-fuge de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de tampon d’amorçage de jet.

Mélangez bien en faisant tourbillonner le tube suivi d’un court essorage. Ajoutez ensuite 37,5 microlitres de vortex de réactif d’amorçage de jet et tournez pendant une minute à vitesse maximale. Incuber le mélange de transfection pendant 10 minutes.

À température ambiante, étiqueter une population de cellules comme transfectée avec le vecteur d’expression, codant le RCPG d’intérêt et la construction G alpha 16 et la deuxième fiole avec le vecteur vide et la construction G alpha 16. Après l’incubation, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte dans le milieu de culture cellulaire, en veillant à pipeter directement dans le milieu et à éviter tout contact avec les parois du flacon de culture. Incuber les flacons à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 20 à 24 heures pour le test de mobilisation du calcium.

Les cellules transfectées sont collectées et ensemencées en 96. Plaques inférieures transparentes à parois noires. Enduisez d’abord les plaques de 60 microlitres par puits à température ambiante.

Solution saline tamponnée au phosphate avec fibronectine. Incuber les plaques à température ambiante pendant une heure avec le couvercle. Retirez la solution des puits et incubez à nouveau les plaques pendant une heure sans le couvercle à température ambiante.

Pendant ce temps, retirez l’ancien milieu de croissance des cellules. Rincez les cellules mortes avec trois millilitres de PBS et retirez le PBS. Ajoutez ensuite trois millilitres de PBS tryin EDTA à température ambiante pendant une minute avant de retirer la solution.

À ce stade, la morphologie des cellules passe de la forme d’une étoile à une forme de sphère. Détachez les cellules du fond du ballon en tapotant doucement et récupérez-les en les rinçant plusieurs fois avec 10 millilitres à température ambiante. Support de transfert DM em.

Transférez les cellules dans un tube de faucon de 50 millilitres. Pour compter le nombre de cellules par millilitre, ajoutez 100 microlitres de culture cellulaire dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon de lyse et mélangez en tapotant le tube.

Enfin, ajoutez 100 microlitres de tampon stabilisateur et mélangez en tapotant Remplissez une cassette de nucléos avec la suspension cellulaire et comptez les cellules avec le compteur. Le logiciel nucleo view multiplie automatiquement le nombre de cellules par trois, car les cellules ont été diluées par un facteur de trois.

Lors de l’ajout du tampon de lyse et de stabilisation, diluez les cellules à une concentration finale de 600 000 cellules par millilitre et ensemencez 150 microlitres de cellules par puits dans les plaques enrobées. Pour obtenir une densité cellulaire d’environ 90 000 cellules par puits, évitez les bulles d’air et tapotez la plaque pour répartir uniformément les cellules. Afin d’obtenir une couche cellulaire contiguë, incubez les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 16 à 24 heures.

Jetez le milieu des cellules. Lavez les cellules avec 200 microlitres de PBS par puits et retirez le PBS. Notez que toutes les étapes suivantes qui impliquent des opérations avec les cellules doivent être effectuées dans l’obscurité car à partir de ce moment, les cellules seront chargées avec le fluoro four.

Ajoutez 55 microlitres de tampon de chargement par puits, enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium pour éviter l’exposition de la plaque à la lumière et incubez pendant une heure à température ambiante. Ensuite, utilisez un tampon de lavage pour solubiliser les peptides séchés dans des microtubes à centrifuger siliconés de 1,5 millilitre. Préparez une série de dilutions pour effectuer une analyse concentration-réponse et déterminer la valeur EC 50 d’un ligand.

Gardez à l’esprit que 50 microlitres d’un ligand de la plaque composée seront transférés dans un puits avec 100 microlitres de tampon de lavage sur la plaque cellulaire pendant le test, alors préparez les composés à trois fois leur concentration finale souhaitée. Ensuite, ajoutez 70 microlitres du ligand dans le puits correspondant de la plaque composée en trois exemplaires. Incluez des commandes positives et négatives sur chaque plaque.

Jetez le tampon de chargement de la plaque cellulaire et ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage dans chaque puits pour éviter l’exposition à la lumière. Incuber la plaque pendant 15 minutes à température ambiante. Jetez le tampon de lavage de la plaque cellulaire et ajoutez 100 microlitres de nouveau tampon de lavage à chacune.

Bien incuber la plaque cellulaire, la plaque composée et un support d’embouts pendant 15 minutes. À 37 degrés Celsius, créez et chargez le fichier de protocole souhaité avec le logiciel et activez ici l’unité de contrôle de la température pour la chambre de lecture. Les réponses calciques sont mesurées à 37 degrés Celsius pendant deux minutes, une rangée à la fois avec un intervalle de 1,52 seconde entre les lectures successives à 525 nanomètres.

Réglez l’excitation de la grippe oh quatre à 488 nanomètres et transférez un volume total de 50 microlitres de composé sur la plaque cellulaire. 18 secondes après la lecture. Commencez avec une vitesse de distribution réglée sur 26 microlitres par seconde et une hauteur de pipette de 135 microlitres.

Placez la plaque composée et cellulaire ainsi que le support de pointes dans les tiroirs appropriés de l’appareil de station. Effectuez une seule lecture de la plaque cellulaire à la même longueur d’onde d’excitation et d’émission en mode point final avant de démarrer l’écran réel en mode flexible. Démarrez le test et procédez à l’analyse des données à l’aide du logiciel décrit.

Voici des graphiques correspondant à l’une des trois répliques de la série de concentration NPF courte. La commande négative n’a pas induit de signal fluorescent. Alors que le contrôle positif a provoqué une forte activation de la protéase endogène activée, le récepteur un, conduisant à un signal fluorescent élevé.

Le logiciel permet la saisie de formules pour déterminer le pourcentage d’activation ou les erreurs-types des différentes concentrations, entre autres. Les données obtenues sont utilisées pour composer des courbes de réponse de concentration préliminaires afin d’estimer les valeurs de la CE-50, comme le montrent les quatre peptides NPF courts de l’œsophage. Les courbes incluent également les données du témoin négatif, où la série de concentrations des peptides NPF courts de la drosophile a été testée sur des cellules transfectées avec un vecteur vide.

Les résultats indiquent que l’ajout de peptides à ces cellules n’a aucun effet sur les récepteurs endogènes, mais active en effet le récepteur d’intérêt. Des courbes de réponse de concentration préliminaires de l’essai de mobilisation du calcium basé sur la fluorescence ont été effectuées et les concentrations testées ont été adaptées pour couvrir la plage dynamique de la courbe. Les valeurs EC 50 de la drosophile short npf 1, 2, 3 et quatre sont similaires, indiquant qu’elles sont tout aussi puissantes pour activer le récepteur Après cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’activité de la structure, les études de relation peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les acides aminés du peptide qui sont cruciaux pour l’activation du récepteur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une mobilisation du calcium basée sur le sens du fluer afin d’identifier les ligands activant fonctionnellement les récepteurs couplés aux protéines G. Cela inclut le maintien des systèmes d’expression solaire suivi de la transfection transgenre du système cellulaire par le récepteur d’intérêt.

Après une mobilisation du calcium rigide, un test peut avoir lieu.