Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

Ce protocole combine l’électrofilage et les microsphères pour développer des échafaudages issus de l’ingénierie tissulaire afin de diriger les neurones. Le facteur de croissance nerveuse a été encapsulé dans des microsphères PLGA et électrofilé dans des échafaudages fibreux d’acide hyaluronique (AH). La bioactivité des protéines a été testée en ensemencant les échafaudages avec des ganglions de la racine dorsale primaires du poussin et en cultivant pendant 4 à 6 jours.

L’objectif global de cette procédure est de créer un environnement à multiples facettes pour favoriser la croissance et la réparation des nerfs. Ceci est accompli en encapsulant d’abord les facteurs de croissance dans des microsphères dégradables. La deuxième étape consiste à préparer le matériau de support pour la majeure partie de l’environnement.

Ensuite, les microsphères et le matériau de support sont combinés et électro-filés en un échafaudage fibreux aligné. La dernière étape consiste à tester l’échafaudage avec les neurones des ganglions de la racine dorsale du poussin. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence est utilisée pour montrer que la croissance et la direction des neurites sont accélérées par rapport aux témoins.

Bien que ce système soit conçu pour les tissus neuraux avec de légères modifications des protéines et des matériaux utilisés, il pourrait également être appliqué à divers types de tissus, notamment les cœurs, les poumons et les os. Avant de commencer cette procédure, préparez les réactifs nécessaires, des solutions de 2 % et 0,5 % en poids par volume d’alcool polyvinylique ou de PVA dans de l’eau désionisée, une solution de 2 % en volume par volume, de l’alcool isopropylique et de l’eau déminéralisée, et une solution aqueuse de la protéine hydrophile souhaitée. Lieu. 40 millilitres de la solution de PVA à 0,5 % dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et mis de côté dans un petit flacon dissous 300 milligrammes d’acide coglycolique polylactique 65 à 35 ou PLGA et trois millilitres de méthane dichloro.

Un mélangeur vortex peut être utilisé pour accélérer la dissolution du PLGA en combinant 200 microlitres de solution protéique et quatre microlitres de solution PVA à 2 %. Versez le mélange de protéines PVA dans la solution PLGA. Les solutions resteront pour la plupart séparées.

Placez le flacon dans un bécher d’eau glacée à l’aide d’un W ator à environ 10 watts, agitez la solution pendant cinq à 10 secondes jusqu’à ce qu’une émulsion blanche crémeuse uniforme soit créée. Versez l’émulsion dans le tube de 50 millilitres préalablement préparé contenant 0,5 % de PVA. Mélangez la solution à grande vitesse sur un mélangeur vortex pendant environ 20 secondes.

La solution développera un aspect trouble. Transférez l’émulsion dans un bécher de 200 millilitres et placez-la sur une plaque d’agitation à 350 tr/min pendant deux minutes. Ajoutez 50 millilitres d’alcool isopropylique à 2 % dans le bécher sur la plaque d’agitation.

Laissez le mélange continuer à remuer pendant au moins une heure pour permettre au chlorométhane de s’évaporer et au PLGA de durcir. Ensuite, transférez la solution de microsphères dans des tubes à centrifuger, centrifugez à 425 fois G pendant trois minutes. Les microsphères s’accumuleront au fond du tube et apparaîtront blanches. Retirez soigneusement le surnageant du tube au-dessus des microsphères et rangez-le dans une bouteille de 500 millilitres.

Rincez les microsphères à l’eau désionisée en remplissant chaque tube aux trois quarts et en le secouant pour redistribuer les microsphères dans le liquide. Répétez la centrifugation, l’élimination du surnageant et le rinçage des microsphères à l’eau désionisée quatre fois après le rinçage final. Retirez le surnageant et placez-le dans le flacon de 500 millilitres avec les autres échantillons.

Congelez les microsphères recueillies dans les tubes à centrifuger à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit, puis lyophilisez-les pendant au moins 24 heures. La solution d’électro-filature suivante doit être préparée au préalable dans de l’eau déminéralisée, 2 % en poids par volume, de l’acide hyaluronique lié à la méthamphétamine ou du miha avec 3 % en poids par volume, 900 kilodaltons d’oxyde de polyéthylène ou PEO et 0,05 % en poids par volume. Solution d’initiateur de photos.

Après avoir préparé le volume souhaité de solution d’électro-filage, ajoutez des microsphères à la concentration souhaitée jusqu’à 400 milligrammes par millilitre. Mélangez la solution sur un mélangeur vortex jusqu’à ce que les microsphères soient uniformément réparties dans la solution. Transférez la solution dans une seringue et fixez-y une aiguille à pointe émoussée de six pouces de calibre 18.

Placez la seringue dans un tire-seringue et réglez-la pour qu’elle distribue à 1,2 millilitres par heure. Collez une couche de papier d’aluminium sur le mandrin. Cela permet un nettoyage et un stockage faciles de l’échafaudage fini.

Un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées. Connectez le fil de terre d’une source d’alimentation haute tension à l’appareil de collecte. Connectez le fil positif à l’aiguille pour assurer le succès de l’électro-filage.

Il est très important de vérifier que toutes les connexions et tous les paramètres sont corrects. Démarrez le pompage du polymère et lorsque la solution est visible à l’extrémité de la seringue, allumez la source de tension et réglez la tension à 24 kilovolts. Faites fonctionner la solution jusqu’à ce que l’épaisseur d’échafaudage souhaitée soit atteinte.

Une fois terminé, éteignez la source de tension et la pompe à seringue. Pour commencer cette procédure, fixez les lamelles de recouvrement correspondantes à la zone de collecte de l’électro-cône avec du ruban adhésif double face amovible avant l’électro-essorage. La rotation sur les cales de recouvrement facilite la manipulation et la visualisation après l’électro-filage à l’épaisseur souhaitée.

Comme démontré dans le segment vidéo précédent, retirez soigneusement les lamelles du mandrin. Placez les capots revêtus d’échafaudage dans une chambre d’azote transparente et assurez-vous que tout l’oxygène est purgé. Placez la chambre et l’échafaudage sous une lumière de 10 milliwatts centimètre carré de 365 nanomètres pendant 15 minutes.

Après avoir réticulé l’endroit, le couvercle se glisse dans une plaque de puits de taille appropriée. Assurez-vous que le côté de l’échafaudage est orienté vers le haut. Placez 100 à 200 microlitres de média sur chaque échafaudage dans la plaque du puits. Soigneusement.

Placez un ganglion de la racine dorsale ou DRG sur chaque échafaudage dans la gouttelette de média. Pour un échafaudage épais, plus de média peut être nécessaire. Le DRG doit être entièrement immergé et ne pas flotter.

Incuber l’échafaudage et le DRG à 37 degrés Celsius pendant quatre heures pour permettre à la cellule d’adhérer à l’échafaudage. Ensuite, remplissez le média au niveau approprié pour le puits. Remettez la plaque dans l’incubateur et incubez pendant quatre à six jours après la période d’incubation.

Retirez délicatement le support de chaque puits et lavez-le doucement une fois avec du PBS. Fixez les cellules pendant 30 minutes en utilisant 4 % de poids par volume. Le paraformaldéhyde colore ensuite les cellules pour les filaments neuronaux et les noyaux selon un protocole établi.

Pour visualiser les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent, placez la plaque de puits sur la platine du microscope et localisez la masse cellulaire à l’aide du filtre et des paramètres d’excitation pour dpi. Une fois la cellule identifiée, basculez le filtre sur zi. Pour visualiser les neurites étendues, utilisez la fonction de point du microscope pour collecter et combiner autant d’images que nécessaire pour voir la structure entière.

50 micromètres de plus ou moins 14 micromètres de diamètre avec plus de 85 % d’encapsulation de protéines ont été produits de manière cohérente et des électros ont été transformés en échafaudages par ce protocole. Cette image fluorescente montre des microsphères représentatives avec Rod Domine dans la coquille PLGA et des sjustesses BSA encapsulés à l’intérieur.

Pour évaluer l’encapsulation, les microsphères ont été remplies de BSA et testées pour la libération de protéines pendant plus de 60 jours avec un test de protéines Bradford. Le relâchement commence par une première rafale, puis se poursuit au fur et à mesure que les microsphères se décomposent après l’électro-rotation. Les microsphères peuvent être observées tout au long de la structure fibreuse 3D.

Dans cette image MEB de l’échafaudage complet. Les sphères peuvent être vues en plusieurs couches indiquées par des flèches. Cette image à fort grossissement est celle d’une microsphère avec les nanofibres de l’échafaudage au-dessus d’elle.

Les ganglions de la racine dorsale ou DRG ont été utilisés pour tester la viabilité du facteur de croissance nerveuse ou NGF dans les microsphères à l’intérieur de l’échafaudage. Voici des DRG assis sur un échafaudage contenant des microsphères. Chargé de NGF est montré à côté d’une microsphère sans protéine dans le neurite plus long Les extensions s’étendant du DRG sur l’échafaudage NGF indiquent que le NGF est viable et peut favoriser la croissance.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’encapsuler les protéines dans des microsphères et de les incorporer dans des échafaudages fibreux.