Name: Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez l'électrofilage de microsphères à libération de facteurs de croissance pour l'ingénierie tissulaire nerveuse. Cette méthode encapsule le NGF dans des microsphères PLGA et teste leur efficacité avec des ganglions rachidiens dorsaux de poulet.

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Ce travail a été partiellement financé par la Fondation Richard Barber et une bourse Thomas Rumble (TJW).

1 Eau / Huile / Eau Double Emulsion production de microsphères <ol><li> Préparer d&#39;abord 2% et 0,5% p / v des solutions d&#39;alcool polyvinylique (PVA) dans l&#39;eau désionisée. Incorporer les solutions à 50 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il dégage, ce qui peut prendre plusieurs heures. Préparer une solution de 2% v / v d&#39;alcool isopropylique dans de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Préparer une solution aqueuse d&#39;une protéine hydrophile souhaitée. Le tableau ci-dessous fournit des exemples de formulations. </li></ol><img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> Tableau 1:. Exemple Protein Solutions Les solutions de protéine suivants ont été encapsulés avec succès électrofilées et en utilisant ce protocole. D&#39;autres solutions de protéines hydrophiles peuvent être utilisés en fonction des besoins. <ol start="3"><li> Placer 40 ml de la solution de PVA à 0,5% dans un tube de 50 ml centrifugeuse et mettre de côté. </li><li> Dans un tube à centrifuger de 15 ml dissoudre 300 mg de 65:35poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans 3 ml de dichlorométhane. Un mélangeur vortex peut être utilisé pour accélérer la dissolution du PLGA. </li><li> Mélanger 200 ul de solution de protéine et 4 ul de solution de PVA à 2%. Verser le mélange de protéines dans la solution de PLGA (étape 1.4). Les solutions restent la plupart du temps séparé. </li><li> Placer le tube dans un bêcher d&#39;eau glacée. L&#39;utilisation d&#39;un appareil à ultrasons baguette à ~ 10 Watts (RMS), agiter la solution pendant quelques secondes (5-10) jusqu&#39;à obtenir une émulsion crémeuse blanc uniforme est créé. </li><li> Verser l&#39;émulsion dans le tube de 50 ml contenant 0,5% de PVA (étape 1.3). Mélanger la solution à haute vitesse sur un vortex pendant environ 20 secondes. La solution sera de développer un aspect trouble. </li><li> Transfert de l&#39;émulsion dans un bécher de 200 ml et placer sur une plaque d&#39;agitation à 350 tours par minute pendant 2 min. Ajouter 50 ml de 2% d&#39;alcool isopropylique dans le bêcher sur la plaque d&#39;agitation. Laisser le mélange sous agitation continue pendant au moins 1 heure pour permettre l&#39;évaporation du DCM et le PLGA à durcir. </li><li> Transfert til microsphère solution dans des tubes de centrifugation. </li><li> Centrifuger à 425 g pendant 3 min. Les microsphères seront recueillir au bas du tube et apparaissent en blanc. Retirez délicatement le surnageant du tube, au-dessus des microsphères, et stocker dans une bouteille de 500 ml. </li><li> Rincer les microsphères avec de l&#39;eau déminéralisée en remplissant le tube aux trois quarts plein et en l&#39;agitant de redistribuer les microsphères dans le liquide. </li><li> Répétez les étapes 1.10 et 1.11 quatre fois. </li><li> Après le rinçage final, éliminer le surnageant de nouveau et le placer dans la bouteille de 500 ml avec les autres échantillons. Geler les microsphères recueillies dans le tube de centrifugeuse, puis lyophiliser pendant au moins 24 heures. </li><li> Visualisez les microsphères sous un microscope optique ou un microscope électronique à balayage. Microsphères ne dépassant pas 60 um sont pour électrofilature efficace. Si les microsphères sont trop grandes, plus sonication ou vortex temps peuvent être nécessaires à l&#39;étape 1.6 ou 1.7. </li> &lt;li&gt; Conserver les microsphères séchées dans un congélateur à -20 ° C. </li><li> Facultatif: utiliser un dosage de protéines, selon les instructions du fabricant, pour tester la quantité de protéine dans le flacon de 500 ml à partir de l&#39;étape 30 1,10. Il est utilisé pour calculer le pour cent de la protéine encapsulée dans des microsphères, en soustrayant la quantité de la solution à partir de ce qui a été utilisé dans le processus de production. </li></ol> Remarque: Afin de visualiser la localisation de la protéine dans la microsphère ajouter Rhodamine 2 ug / ml de la solution de PLGA 31 et encapsuler une protéine conjuguée au FITC La figure 1 montre un exemple.. 2. Électrofilage avec microsphères <ol><li> Avant de préparer la solution de filage électrostatique, créer une solution à 0,5% p / v de photo-initiateur, dans de l&#39;eau désionisée par dissolution à 37 ° C. Ce processus peut prendre plusieurs heures. </li><li> Créez un 2% p / v méthacrylé acide hyaluronique (Meha) (voir Burdick et al. Pour la synthèse) 29, 3%p / v 900 kD poly (oxyde d&#39;éthylène) (PEO) et de 0,05% en poids / solution d&#39;initiateur de photo v dans de l&#39;eau désionisée. <ol><li> Calculer le montant exact de Meha et PEO pour le volume souhaité. Par exemple, 10 ml de solution nécessite électrofilage 200 mg de MEHA et 300 mg de POE. </li><li> Dissoudre le PEO dans de l&#39;eau désionisée à 90% du volume final désiré (9 ml pour cet exemple). Cette opération peut prendre plusieurs heures, une plaque d&#39;agitation chauffée ou un bain d&#39;eau à 37 ° C peuvent être utilisés pour accélérer le processus. </li><li> Ensuite, ajoutez la meha et utiliser un vortex de remuer jusqu&#39;à ce que la solution claire. Cela ne prendra que quelques minutes. </li><li> Enfin ajouter la solution d&#39;initiateur photo 0,5% pour remplir le volume restant de 10% (1 ml pour cet exemple). </li></ol></li><li> Ajouter microsphères à la concentration souhaitée allant jusqu&#39;à 400 mg / ml. Mélanger la solution sur un agitateur vortex jusqu&#39;à ce que les microsphères sont distribuées uniformément dans la solution. </li><li> Transférer la solution dans une seringue et fixer un calibre 18 bl 6 poucesaiguille de pointe unt. </li><li> Placez la seringue dans une pompe à seringue et mis à distribuer à 1,2 ml / h. </li><li> Collez une feuille de papier d&#39;aluminium sur la plaque de collection ou mandrin. Cela permet de faciliter le nettoyage et le stockage de l&#39;échafaud fini. Un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées. Un plateau ou mandrin fixe se traduira par des fibres disposées au hasard. </li><li> Connectez le fil de terre à partir d&#39;une source d&#39;alimentation haute tension de l&#39;appareil de collecte. Connecter le fil positif à l&#39;aiguille. </li><li> Ajuster la surface de la pompe à seringue et la collecte de sorte qu&#39;il n&#39;y a 15 cm entre la pointe de l&#39;aiguille et la surface de collecte. </li><li> Lancer le pompage de polymère, lorsque la solution est visible à l&#39;extrémité de la seringue, tourner sur la source de tension et régler la tension de 24 kV. ATTENTION: Une fois que la tension est allumé ne pas toucher une partie métallique du système. Charge peut également sauter sur de courtes distances à partir de pièces électrifiées pour la peau. </li><li> Exécutez la solution jusqu&#39;à ce que dépaisseur d&#39;échafaudage esired est atteint. Lorsque vous avez terminé désactiver source de tension et la pompe à seringue. </li><li> Retirer la feuille avec échafaudage fixé. Échafaudages remplis contenant des protéines sont stockées dans un congélateur à -20 ° C. </li></ol> 3. Protein Test bioactivité <ol><li> Préparation des milieux de culture cellulaire. Ajouter 10% v / v de sérum bovin fœtal, 1% v / v de L-glutamine et 1% v / v de pénicilline-streptomycine à milieu de Eagle modifié par Dulbecco. </li><li> Sélectionnez des lamelles de verre qui correspondent complètement dans une plaque de puits. </li><li> Utilisation de 3 (triméthoxysilyl) propyl méthacrylate de traiter les lamelles de la manière décrite par le fabricant. Méthacrylation améliore échafaud respect des lamelles. </li><li> Fixez lamelles méthacrylés à la zone de collecte de la ElectroSpinner avec du ruban adhésif double face amovible avant électrofilature. Spinning sur les lamelles facilite la manipulation et la visualisation. </li><li> Electrospin à l&#39;épaisseur désirée, comme décrit ci-dessus. </li><li> Après avoir Électrofilage retirer délicatement les lamelles de mandrin. Placez l&#39;échafaud lamelles enrobées dans une chambre d&#39;azote claire et veiller à ce que tout l&#39;oxygène est purgé. </li><li> Placer la chambre sous un échafaudage et 10 mW / cm 2 la lumière à 365 nm pendant 15 min. Après réticulation lieu dans la plaque et de taille appropriée. Assurez-vous que le côté de l&#39;échafaudage vers le haut. </li><li> La place des échafaudages sous une lampe germicide pendant 30 min à stériliser. Si la fibronectine ou tout autre protéine désirée est utilisé comme un revêtement pour améliorer l&#39;adhérence cellulaire. Suivez les instructions du fabricant pour les échafaudages de manteau. </li><li> Récolte les ganglions rachidiens (DRG) comme décrit précédemment par Hollenbeck 32. Un DRG sera nécessaire pour chaque lamelle d&#39;échafaudage recouvert testé. </li><li> Passer 100-200 ul de milieu sur chaque échafaudage dans la plaque de puits. Placez délicatement un DRG sur chaque échafaudage dans la gouttelette de médias. Pour échafaud épaisseur plus de médias peuvent être nécessaires; DRG doivent être entièrement immergé et non Floating. </li><li> Incuber l&#39;échafaud et DRG à 37 ° C pendant 4 heures pour permettre à la cellule de se conformer à l&#39;échafaud. </li><li> Remplissez les médias au niveau approprié pour le bien et remettez-le dans l&#39;incubateur. Continuer incubation pendant 4-6 jours. </li><li> Après la période d&#39;incubation retirer soigneusement les médias de chaque puits et laver délicatement une fois avec PBS. Fixer les cellules pendant 30 min à l&#39;aide de 4% en poids / volume de paraformaldéhyde. </li><li> Cellules tache avec une tache d&#39;anticorps pour neurofilaments. Cela permettra la visualisation de la croissance des neurites, pour la quantification. DAPI peut également être utilisé pour visualiser les noyaux des cellules. Un exemple de protocole de coloration a été décrit par Sundararaghavan et ses collègues 14. </li><li> Visualisez les cellules en utilisant un microscope à fluorescence. <ol><li> Placez plaque bien sur la scène du microscope. </li><li> Localisez la masse cellulaire en utilisant les filtres et d&#39;excitation paramètres de DAPI. </li><li> Une fois que la cellule est passer le filtre à FITC pour visualiser les neurites prolongées. Uchanter la fonction de point sur le microscope collecter et combiner autant d&#39;images que nécessaire pour voir l&#39;ensemble de la structure. Répétez l&#39;opération pour DAPI, FITC et le champ lumineux. </li></ol></li></ol>

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<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
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<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

De nombreuses études ont montré que les cellules nerveuses peuvent être dirigées par des indices topographiques (alignement de la fibre) et des signaux chimiques (facteurs de croissance) 1,2,10,11,35. Électrofilage est une méthode facile pour créer des fibres alignées. Les facteurs de croissance stimulent la croissance du nerf, mais dans le but de les inclure dans des conduits nerveuses (NC), un procédé de libération prolongée est requise. Pour créer un système plus robuste avec les deux indices, ces deux sig...

Un des défis actuels de l&#39;ingénierie de tissu neural est de créer un conduit de nerf (NC) qui imite la matrice extra-cellulaire, où les nerfs se développent naturellement. La recherche a montré que les cellules répondent à plusieurs facteurs dans leur environnement, y compris mécanique, topographique, adhésif et des signaux chimiques 1-3. L&#39;un des principaux défis dans ce domaine est de déterminer la combinaison appropriée de signaux et la fabrication d&#39;un système qui peut maintenir des repères pour une période prolongée pour soutenir la croissance de la cellule 4. Neurones périphériques sont connus pour préférer un substrat souple, être dirigées par des fibres alignées, et répondent au facteur de croissance des nerfs (NGF) 5-7. CN qui peuvent fournir des indices chimiques pendant des semaines ont été montré pour fournir une meilleure récupération fonctionnelle proche de celle des allogreffes, la norme de référence actuelle pour la réparation nerveuse 8,9. Matériaux et des méthodes de production différentes peuvent être utilisées pour produire mécanique et topographiqueal Queues de 10-13. Indices mécaniques sont inhérentes à la matière choisie, ce qui rend le choix du matériel approprié pour l&#39;application critique 1,13. Les méthodes de production de contrôler indices topographiques comprennent la séparation de phase, l&#39;auto-assemblage et électrofilature 1,13. Pour les applications à micro, microfluidique, photopatterning, gravure, la lixiviation de sel, ou des mousses de gaz peut également être utilisé 14-17. Électrofilage a émergé comme le moyen le plus populaire pour concevoir des substrats fibreux pour la culture de tissus en raison de sa flexibilité et de la facilité de production 13,18-23. nanofibres de électrofilées sont fabriqués en appliquant une tension élevée à une solution de polymère amenant à se repousser et étirer sur un court intervalle de s&#39;acquitter de 24. Un échafaudage aligné peut être créé par la collecte des fibres sur un mandrin en rotation à la terre et échafaudages non alignés sont collectées sur une plaque fixe 25. signalisation d&#39;adhérence peut être obtenue en revêtant l&#39;échafaudage fibreux esprith fibronectine ou la conjugaison d&#39;un peptide d&#39;adhérence, tels que RGD, de l&#39;HA avant électrofilage 26. Des signaux chimiques, tels que des facteurs de croissance, sont les plus difficiles à maintenir sur de longues périodes, car ils ont besoin d&#39;une source pour une libération contrôlée. De nombreux systèmes ont été tenté d&#39;ajouter libération contrôlée de réseaux fibreux électrofilées avec différents niveaux de succès. Ces méthodes incluent mélange électrofilature, émulsion électrofilature, coque centrale électrofilature et protéines conjugaison 27. En outre, électrofilature se fait traditionnellement dans un solvant volatil, ce qui peut affecter la viabilité de la protéine 28, donc le maintien de l&#39;activité biologique de la protéine doit être envisagée. Cette approche traite spécifiquement de combiner les signaux mécaniques, topographiques, chimiques et adhésifs pour créer un échafaudage réglable de croissance des nerfs périphériques. mécanique d&#39;échafaudage est contrôlée avec précision par la synthèseméthacrylé acide hyaluronique (HA). Les sites de méthacrylation sont utilisés pour attacher photo agents de réticulation réactifs. Le matériau réticulé est plus soluble dans l&#39;eau et est exclusivement décomposé par les enzymes 29. La quantité de réticulant modifie la vitesse de dégradation, de la mécanique et d&#39;autres propriétés physiques du matériau. Utilisation de HA à 30% méthacrylation, qui a un module d&#39;environ 500 Pa à la traction, crée un substrat souple qui est proche de la mécanique natifs de tissu neural et est généralement préférée par les neurones 26,29. Électrofilage sur un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées à un repère topographique. Utilisation électrofilature avec microsphères fournit des signaux chimiques dans l&#39;échafaudage sur des périodes prolongées. Pour soutenir microsphères de croissance des neurites contenant NGF sont utilisés pour créer le signal chimique. Contrairement à la plupart des matériaux électrofilées HA est soluble dans l&#39;eau de sorte que le NGF ne rencontre pas de solvants agressifs pendant la production. Pour ajouter un signal d&#39;adhésif, la scaffold est enduite avec de la fibronectine. Le système complet comprend les quatre types de signaux décrits ci-dessus: alignement des fibres douces (mécaniques) topographiques (NGF) avec libération des microsphères (chimique) revêtue avec de la fibronectine (adhésif). Production et les essais de ce système est décrite dans ce protocole. Le processus commence par la production de microsphères ayant une double émulsion eau-dans-huile-dans-eau. L&#39;émulsion est stabilisée par un agent tensioactif, l&#39;alcool polyvinylique (PVA). La phase aqueuse interne contient de la protéine. Comme il est ajouté à la phase huileuse, qui contient le matériau de coque PLGA dissous dans du dichlorométhane (DCM), le tensioactif forme une barrière entre les phases de protection de la protéine à partir du DCM. Cette émulsion est dispersée dans l&#39;autre à la phase aqueuse contenant du PVA afin de créer la surface externe des microsphères. L&#39;émulsion stable est agitée pour permettre le DCM à s&#39;évaporer. Après rinçage et lyophilisation vous êtes de gauche avec la suite microsphères secaining la protéine. Une fois que les microsphères sont remplis, ils sont prêts à être électrofilées dans les échafaudages. D&#39;abord, vous préparez la solution de électrofilature. La viscosité de la solution est crucial pour la formation de fibres approprié. Solutions de HA pure ne répondent pas à cette exigence; PEO est ajouté en tant que polymère de support pour permettre électrofilage. Les microsphères sont ajoutées à la solution résultante et électrofilées dans un échafaudage fibreux avec des microsphères réparties sur l&#39;ensemble. Une fois que la production est terminée, la protéine doit être testé afin de vérifier sa viabilité. Pour ce faire, une cellule primaire qui répond au NGF peut être utilisé. Ce protocole utilise les ganglions rachidiens (DRG) du 8-10 jours embryons de poulet. Les faisceaux de cellules sont ensemencées sur des échafaudages contenant des microsphères remplies de NGF ou ceux qui sont vides. Si le NGF est encore viable, vous devriez voir une croissance accrue des neurites sur les échafaudages contenant NGF. Si le NGF n&#39;est plus viable, il serapas promouvoir neurites pour étendre et devrait ressembler à la commande. La procédure exacte décrite ici porte sur l&#39;appui de neurones, cependant, avec des modifications simples à la matière, procédé électrofilage, et des protéines du système peut être optimisée pour différents types cellulaires et tissulaires.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Préparation de la solution mère dans la pompe à</td></tr><tr><td>seringue</td> DMSO <td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Source d’alimentation</td><td>Gamma Haute tension</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Moteur</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Doit être fixé à un mandrin personnalisé</td></tr><tr><td>Tachymètre</td><td>Réseau d’outils Entrepôt</td><td>ESI-330</td><td>Utiliser pour surveiller la vitesse</td></tr> <tr><td>du mandrinSystème de polymérisation UV Omnicure avec adaptateur collimatif</td><td>Aiguilles EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoporopylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Facteur de croissance nerveuse (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Acide polylactique-glycolique (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl méthacrylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Cette procédure décrit une méthode de fabrication d’un substrat à multiples facettes pour diriger la croissance des cellules nerveuses. Ce système intègre des signaux mécaniques, topographiques, adhésifs et chimiques. Les propriétés mécaniques sont contrôlées par le type de matériau utilisé pour fabriquer les fibres électrofilées. Dans ce protocole, nous utilisons de l’acide hyaluronique (HA) méthacrylé à 30 %, qui a un module de traction de ~500 Pa, pour produire un échafaudage fibreux doux. L’électrofilage sur un mandrin rotatif produit des fibres alignées pour créer un repère topographique. L’adhérence est obtenue en recouvrant l’échafaudage de fibronectine. Le principal défi abordé ici est de fournir un signal chimique sur toute la profondeur de l’échafaudage pendant de longues périodes. Cette procédure décrit la fabrication de microsphères de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) contenant du facteur de croissance nerveuse (NGF) et l’imprégnation directe de l’échafaudage avec ces microsphères pendant le processus d’électrofilage. En raison de l’environnement de production difficile, y compris les forces pures élevées et les charges électriques, la viabilité des protéines est mesurée après la production. Le système fournit une libération de protéines pendant plus de 60 jours et il a été démontré qu’il favorise la croissance des cellules nerveuses primaires.

Microsphères 50 ± 14 um de diamètre avec une protéine encapsulation plus de 85% ont été régulièrement produite et électrofilé dans les échafaudages. Taille a été déterminée par l&#39;imagerie des échantillons de microsphères de trois lots de production distinctes. Les images capturées sur lequel un microscope optique et où les longueurs mesurées en utilisant un logiciel commercial. Laboratoire La figure 1 montre un histogramme de la distribution de la taille. taux d&#39;encapsulation a également été tes...

Ce protocole combine l’électrofilage et les microsphères pour développer des échafaudages issus de l’ingénierie tissulaire afin de diriger les neurones. Le facteur de croissance nerveuse a été encapsulé dans des microsphères PLGA et électrofilé dans des échafaudages fibreux d’acide hyaluronique (AH). La bioactivité des protéines a été testée en ensemencant les échafaudages avec des ganglions de la racine dorsale primaires du poussin et en cultivant pendant 4 à 6 jours.

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

L'objectif général de cette procédure est de créer un environnement pluridimensionnel permettant de soutenir la croissance et la réparation nerveuse. Cela est réalisé en encapsulant d'abord des facteurs de croissance dans des microsphères biodégradables. La deuxième étape consiste à préparer le matériau de soutien pour la majeure partie de l'environnement.Ensuite, les microsphères et le matériau de soutien sont combinés et électrofilés en une matrice fibreuse alignée. La dernière étape consiste à tester la matrice avec des neurones de ganglions racinaires dorsaux de poulet. En fin de compte, la microscopie par immunofluorescence est utilisée pour montrer que la croissance et l'orientation des neurites sont accélérées par rapport aux témoins.Bien que ce système soit conçu pour le tissu nerveux, avec de légers changements apportés aux protéines et aux matériaux utilisés, il pourrait également être appliqué à divers types de tissus, notamment les cœurs, les poumons et les os. Avant de commencer cette procédure, préparez les réactifs nécessaires : une solution aqueuse de polyvinyl alcool (PVA) à 2 % et à 0,5 % poids par volume, une solution d’alcool isopropylique à 2 % volume par volume dans de l’eau déionisée, ainsi qu’une solution aqueuse de la protéine hydrophile souhaitée. Placez 40 millilitres de la solution de PVA à 0,5 % dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et mettez de côté. Dans un petit flacon, dissolvez 300 milligrammes d’acide polylactique-co-glycolique (PLGA) 65 à 35 et trois millilitres de dichlorométhane.Un mélangeur vortex peut être utilisé pour accélérer la dissolution du PLGA en combinant 200 microlitres de solution protéique et quatre microlitres de solution de PVA à 2 %. Verser le mélange protéine-PVA dans la solution de PLGA. Les solutions resteront principalement séparées.Placer le flacon dans un bécher d’eau glacée à l’aide d’un W ator d’environ 10 watts, agiter la solution pendant cinq à dix secondes jusqu’à l’obtention d’une émulsion uniforme de couleur blanc crémeux. Verser l’émulsion dans le tube de 50 millilitres préparé précédemment contenant du PVA à 0,5 %. Mélanger la solution à grande vitesse sur un vortex pendant environ 20 secondes.La solution prendra une apparence trouble. Transférez l'émulsion dans un bécher de 200 millilitres et placez-le sur une plaque agitatrice à 350 tr/min pendant deux minutes. Ajoutez 50 millilitres d'alcool isopropylique à 2 % dans le bécher placé sur la plaque agitatrice.Laisser le mélange sous agitation pendant au moins une heure afin de permettre l'évaporation du chlorométhane et le durcissement du PLGA. Ensuite, transférer la solution de microsphères dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 425 fois G pendant trois minutes. Les microsphères s'accumuleront au fond du tube et apparaîtront blanches. Retirer soigneusement le surnageant situé au-dessus des microsphères et le conserver dans une bouteille de 500 millilitres.Rincez les microsphères avec de l'eau déionisée en remplissant chaque tube aux trois quarts et en le secouant pour redistribuer les microsphères dans le liquide. Répétez la centrifugation, l'élimination du surnageant et le rinçage des microsphères avec de l'eau déionisée quatre fois après le rinçage final. Éliminez le surnageant et placez-le dans la bouteille de 500 millilitres avec les autres échantillons.Congelez les microsphères recueillies dans les tubes de centrifugeuse à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit, puis lyophilisez-les pendant au moins 24 heures. La solution d’électrofilage suivante doit être préparée au préalable dans de l’eau déionisée : 2 % poids par volume d’acide méthylhyaluronique ou miha, 3 % poids par volume de polyoxyéthylène ou PEO de 900 kilodaltons et 0,05 % poids par volume de solution d’amorceur photo.Après avoir préparé le volume souhaité de solution d'électrofilage, ajouter les microsphères à la concentration désirée, jusqu'à 400 milligrammes par millilitre. Mélanger la solution à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que les microsphères soient uniformément réparties dans la solution. Transférer la solution dans une seringue et fixer une aiguille de calibre 18 à extrémité émoussée de six pouces.Placer la seringue dans une pompe à seringue et régler le débit à 1,2 millilitre par heure. Fixer avec du ruban adhésif une couche de papier d'aluminium sur le mandrin. Cela permet un nettoyage et un stockage faciles de la structure finie.Un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées. Connectez le fil de masse provenant d'une source d'alimentation haute tension à l'appareil de collecte. Connectez le fil positif à l'aiguille afin d'assurer une électrofilage réussi.Il est très important de vérifier que toutes les connexions et les paramètres sont corrects. Lancez la pompe à polymère et, lorsque la solution est visible à l'extrémité de la seringue, activez la source de tension et réglez la tension à 24 kilovolts. Faites circuler la solution jusqu'à ce que l'épaisseur souhaitée du support soit atteinte.Lorsque l'opération est terminée, éteignez la source de tension et la pompe à seringue. Pour commencer cette procédure, fixez les lamelles correspondantes sur la zone de collecte du filateur électrostatique à l'aide d'un ruban adhésif double face amovible avant le filage électrostatique. Le fait de filer directement sur les lamelles facilite la manipulation et l'observation après le filage électrostatique jusqu'à l'épaisseur souhaitée.Comme illustré dans le segment vidéo précédent, retirez soigneusement les lamelles du mandrin. Placez les lamelles recouvertes de l'édifice dans une chambre d'azote transparente et assurez-vous que tout l'oxygène est éliminé. Exposez la chambre et l'édifice à une lumière de 10 milliwatts par centimètre carré à 365 nanomètres pendant 15 minutes.Après la réticulation, placer les lamelles dans une plaque de puits de taille appropriée. Veiller à ce que le côté de l'échafaudage soit orienté vers le haut. Ajouter 100 à 200 microlitres de milieu sur chaque échafaudage dans la plaque de puits. Soigneusement.Placer un ganglion de la racine dorsale ou DRG sur chaque support dans la goutte de milieu. Pour un support épais, davantage de milieu peut être nécessaire. Le ganglion de la racine dorsale doit être entièrement immergé et ne pas flotter.Incuber le support et le ganglion rachidien à 37 degrés Celsius pendant quatre heures afin de permettre l'adhérence des cellules au support. Ensuite, compléter le milieu jusqu'au niveau approprié pour le puits. Remettre la plaque dans l'incubateur et incuber pendant quatre à six jours après la période d'incubation.Retirez soigneusement le milieu de chaque puits et rincez doucement une fois avec du PBS. Fixez les cellules pendant 30 minutes en utilisant du paraformaldéhyde à 4 % poids par volume, puis coloriez les cellules pour les neurofilaments et les noyaux selon un protocole établi.Pour visualiser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence, placez la plaque de culture sur la platine du microscope et localisez l’amas cellulaire à l’aide des réglages de filtre et d’excitation pour dpi. Une fois la cellule identifiée, changez de filtre en passant à zi. Pour visualiser les neurites étendus, utilisez la fonction de juxtaposition d’images du microscope afin d’acquérir et de combiner autant d’images que nécessaire pour observer toute la structure.Répétez pour les microsphères en dpi, FITE et champ clair. Des microsphères d'un diamètre de 50 ± 14 micromètres avec une encapsulation de protéines supérieure à 85 % ont été régulièrement produites et électrofilées en échafaudages selon ce protocole. Cette image fluorescente montre des microsphères représentatives contenant du Rodamine dans l'enveloppe de PLGA et de l'albumine sérique bovine (BSA) encapsulée à l'intérieur.Pour évaluer l'encapsulation, les microsphères ont été remplies d'albumine sérique de bovin (BSA) et testées pour la libération de protéines pendant plus de 60 jours à l'aide d'un dosage des protéines de Bradford. La libération commence par un dégagement initial, puis se poursuit lorsque les microsphères se dégradent après l'électrofilage. Les microsphères sont visibles tout au long de la structure fibreuse tridimensionnelle.Dans cette image de MEB du support complet. Les sphères peuvent être observées en plusieurs couches, indiquées par des flèches. Cette image à fort grossissement montre une microsphère avec les nanofibres du support situées au-dessus.Les ganglions de la racine dorsale, ou DRG, ont été utilisés pour tester la viabilité du facteur de croissance nerveuse, ou NGF, dans les microsphères au sein de l'échafaudage. Voici des DRG placés sur un échafaudage contenant des microsphères. Chargées en NGF, elles sont situées à côté d'une microsphère sans protéine. Les prolongements neuritaux plus longs émanant du DRG sur l'échafaudage contenant le NGF indiquent que le NGF est viable et peut favoriser la croissance.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'encapsuler des protéines dans des microsphères et de les incorporer dans des échafaudages fibreux.

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Électrofilage treillis polymères fibreux pour l&#39;ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

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