Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

L'objectif général de cette procédure est de cibler les neurones internes dans le cerveau de souris en développement à l'aide de l'électroporation in utero. Cela est réalisé en préparant d'abord les aiguilles d'injection. La deuxième étape consiste à extraire la chaîne embryonnaire de l'animal anesthésié.

Ensuite, l'injection d'ADN et l'électroporation sont réalisées dans le cerveau. La dernière étape consiste à laisser l'animal se remettre de l'intervention chirurgicale. En définitive, l'électroporation in utero est utilisée pour permettre un ciblage sélectif des sous-types de neurones intermédiaires.

L'avantage de ces méthodes par rapport à nos techniques existantes, comme l'électroporation in utero non spécifique, réside dans leur capacité à permettre une analyse autonome au niveau cellulaire d'une sous-population de neurones intercalés corticaux. Les niveaux élevés d'expression de la GFP permettent la visualisation et l'analyse de chaque interneurone individuel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine du développement neuronal, telles que quelles sont les règles régissant l'intégration des interneurones en cours de maturation.

Pour commencer cette procédure, préparez la pipette de microinjection en tirant une capillaire en verre à l’aide d’un tireur de pipettes. Ensuite, retirez soigneusement la capillaire et récupérez l’aiguille inférieure destinée à la microinjection. Placez maintenant une souris gravide anesthésiée sur le côté ventral, dos vers le bas, sur le tapis chauffant.

Couvrez ses voies respiratoires avec un masque qui continuera à délivrer de l'isoflurane pendant toute la durée de la chirurgie. Appliquez ensuite un lubrifiant oculaire sur les deux yeux. Réglez le tapis chauffant à 36 degrés Celsius afin de prévenir l'hypothermie par la suite.

Vérifiez l'absence de réflexes plantaires et caudaux en pinçant les pattes arrière ou la queue. Ensuite, nettoyez la peau de l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez une pince pour soulever la peau vers le haut.

Ensuite, réalisez une petite incision verticale de deux centimètres le long de la ligne médiane, en partant du milieu entre la troisième et la quatrième paire de glandes mammaires. Veillez à ne pas endommager la paroi abdominale en utilisant des pinces rondes. Écartez délicatement la chaîne embryonnaire de la cavité.

Laissez la chaîne reposer sur les lingettes humides. Commencez par exposer une moitié de l'utérus, puis procédez à l'électroporation des embryons avant de passer à l'autre moitié.

Dans cette procédure, préparez une solution d'ADN en dissolvant le culot obtenu à partir d'un protocole de purification standard de type maxi prep dans de l'eau distillée. Ajoutez ensuite du vert rapide à la solution d'ADN dans un rapport de un à vingt afin d'en permettre la visualisation pendant l'injection. Ensuite, coupez l'extrémité d'une micropipette préalablement tirée à l'aide de pinces fines, de manière à laisser six millimètres entre le début de l'épaule et l'extrémité de la pointe.

Ensuite, charger la micropipette avec un microlitre de solution d'ADN contenant du vert rapide pour l'injection. Tenir la tête de l'embryon avec des pincettes rondes. Insérer la micropipette dans le cerveau à 45 degrés, en visant le ventricule latéral situé près de la ligne médiane.

Si l'aiguille pénètre à travers le ventricule, retirez lentement la pipette. Le ventricule doit devenir vert lorsque la solution commence à le remplir. À ce stade, cessez tout déplacement de la pipette et injectez un microlitre d'ADN.

Ensuite, retirez doucement la pipette. Régler l'électroporateur ECM 308 sur huit impulsions de 545 volts, d'une durée de 50 millisecondes chacune, espacées par un intervalle inter-impulsion de 950 millisecondes. Plonger les électrodes en forme de palette de cinq millimètres dans du PBS afin d'assurer une transmission efficace du courant.

Ensuite, placer les palettes électrodes autour de la tête de l'embryon, avec une palette positive sur le ventricule contenant la solution d'ADN. Placer la palette positive légèrement plus bas que la palette négative afin de créer un courant ventral à travers les éminences ganglionnaires. Cela minimisera l'expression ectopique dans les cellules paramétales.

Appliquez maintenant une impulsion en appuyant une fois sur la pédale, puis retirez les électrodes et essuyez-les soigneusement. Répétez ces étapes pour chacun des embryons. Après avoir électroporé tous les embryons.

Versez trois millilitres de PBS dans la cavité abdominale et replacez les embryons dans la cavité abdominale. Ensuite, suturer la paroi abdominale à l’aide d’une aiguille courbe et d’un fil de soie 5/0, puis la peau. Appliquez de la lidocaïne sur la plaie et administrez initialement 120 milligrammes par kilogramme d’aspirine pour l’analgesie.

Retirer l'animal du tube d'anesthésie et laisser la récupération s'effectuer sur un coussin chauffant recouvert d'un papier absorbant. Ensuite, remettre l'animal dans sa cage. Le maintenir sur le coussin chauffant à 37 degrés Celsius et surveiller son état de santé.

Dans cette expérience, les interneurones électroporés sont délimités par l'expression de marqueurs de sous-type dérivés du CGE E. Cette image montre que les interneurones interneurones dérivés du CGE sont électroporés avec un plasmide DLX cinq six EGFP. Cette image montre un interneurone exprimant la VIP au stade P huit.

L'expression de l'EGFP délimite l'arbre dendritique complet et l'arborisation axonale de neurones individuels, et voici un interneurone exprimant la NPY au stade P8. L'expression de la NPY délimite les cellules de forme neurogliale. Enfin, voici un interneurone exprimant la NPY au stade P15.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes si elle est correctement exécutée. En combinant l'utilisation de plasmides spécifiques et de lignées de souris génétiquement modifiées, il est possible d'obtenir un contrôle temporel et spatial de l'expression des gènes d'intérêt. Dans certaines expériences, nous utilisons le plasmide A-D-L-X-T-T-A pour induire l'expression de transgènes dépendants de l'AU.

Dans ces expériences, nous inhibons l'expression du transgène en administrant de la doxycycline.