Name: Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et lanalyse génétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Découvrez une méthode de culture en monocouche non coloniale pour les cellules souches pluripotentes humaines utilisant des inhibiteurs de la kinase associée à Rho et la laminine 521. Cette approche optimise la croissance cellulaire homogène pour la recherche en médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health (NIH) au National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Nous tenons à remercier le Dr Ronald D. McKay pour sa discussion et ses commentaires sur ce projet.

Base unique cellule non-colonie de type monocouche (NCM) culture de hPSCs. 1. Préparatifs <ol><li> Ajoutez 500 ml de milieu de culture de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF): milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine et 0,1 mM d&#39;acides aminés non essentiels (NEAA). </li><li> Isoler les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) des cellules dérivées de la souche CF1 suivant un protocole de routine 16 et MEF culture sur 0,1% de gélatine revêtues plaque à 6 puits de culture de cellules dans du milieu DMEM. Sinon, acheter des actions du MEF au passage 3 de ressources commerciales. </li><li> Préparer plaques Matrigel. <ol><li> Diluer 5 ml de CSEh qualifié Matrigel actions avec 5 ml de milieu DMEM/F12 (refroidi à ~ 4 ° C) et l&#39;enregistrer comme 50% des aliquotes dans un congélateur à -20 ° C. Décongeler le stock congelé Matrigel dans un réfrigérateur (4 ° C ~) O / N et diluer encore le Matrigel dans du milieu DMEM/F12 froid (pour donner lieu à une concentration de travail de 2,5%). </li><li&gt; Manteau 6 puits des plaques de culture cellulaire avec 1,5 ml de 2,5% Matrigel par puits, de stocker les plaques enduites au réfrigérateur O / N (Note: utiliser la plaque Matrigel revêtu dans les 2 semaines). </li><li> Retirer la plaque Matrigel du réfrigérateur, laisser la plaque se réchauffer à la température ambiante dans la hotte de culture cellulaire pour 10 à 30 min (Note: ne pas chauffer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire), et aspirer milieu DMEM avant le placage hPSCs. </li></ol></li><li> Ajoutez 500 ml de milieu de hESC: moyenne de 80% de DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM d&#39;acides aminés non essentiels, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, et 4 ng / ml de FGF-2. </li><li> Préparer 10 ml de 2X HPSC milieu de congélation: 60% de FBS, 20% de DMSO et 20 uM Y-27632 dans un milieu mTeSR1, stériliser par filtration, et utiliser le support dans 1 semaine. </li></ol> . 2 Protocole 1 (de base): Cultivez HPSC colonies en distribution <ol><li> Utilisez des numéros de passage du MEF à 5 ou 6 (désigné comme P5 et P6) pour la culture HPSC afin d&#39;obtenir résul cohérentets. Inactiver mitotique MEF en traitant les cellules avec 10 pg / ml C mitomycine pendant 3 heures à 37 ° C, laver les cellules 3 fois avec du tampon phosphate salin de 1X Dulbecco (D-PBS), puis se dissocient MEF avec 0,05% de trypsine dans 0,53 mM EDTA. Sinon, irradier MEF à une dose de 8000 rads avec un irradiateur X-ray. </li><li> Compter le nombre de cellules en utilisant la méthode d&#39;exclusion du colorant bleu Trypan sous microscope. Vous pouvez également utiliser un compteur de cellules automatique. </li><li> Plate MEF irradiés sur des plaques de polystyrène à 6 puits revêtus avec 0,1% de gélatine à une densité de 1,88 x 10 5 cellules par puits (par exemple, 1,96 x 10 4 cellules / cm 2). Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 heures. </li><li> Retirez le milieu de culture MEF par aspiration avec une pipette Pasteur (Remarque: aucun des étapes de lavage nécessaires à ce moment). </li><li> Colonies triturer HPSC de la culture précédente en petits bouquets, examinent les touffes sous microscope pour s&#39;assurer que leurs tailles allant from 50 à 100 um de diamètre, et de la plaque touffes HPSC sur le dessus de couches nourricières du MEF dans un puits contenant 2 ml de milieu HPSC. </li><li> Changer CSEh moyen quotidien de 3 à 5 jours, une croissance record de la colonie par la photo, marquer les colonies morphologiquement modifiés ou différenciées (~ 5%), et supprimer manuellement les colonies marquées par aspiration doucement avec une pipette Pasteur. </li><li> Rincer les colonies restantes sur les MEF deux fois (2 min chacun avec du D-PBS) et incuber les colonies avec 2 ml de 1 mg / ml de collagénase IV en milieu HPSC pendant 10 à 30 min), et examiner le détachement des colonies HPSC de l&#39; MEF surface revêtue (Remarque: Utilisez un grattoir pour aider le processus de détachement que si les colonies sont étroitement attachés à la plaque). </li><li> Ajouter 5 ml de milieu HPSC à chaque puits pour minimiser les réactions enzymatiques, les colonies de transfert à un tube de 15 ml, permet colonies HPSC dans les sédiments de 3 à 5 min à température ambiante, et de veiller à la sédimentation des colonies par la visualisation directe de la caunes au fond du tube (Note: ne pas centrifuger le tube à cette étape). </li><li> Retirez les surnageants contenant MEF résiduelles et dissocié des cellules individuelles, remettre en suspension les colonies avec 5 ml de milieu de CSEh, et répéter deux fois l&#39;étape de sédimentation. </li><li> Retirez les moyennes, les colonies triturer HPSC en petits bouquets, magasin en 1X HPSC milieu de congélation (ou CryoStore CS10 milieu de congélation) pour la cryoconservation (1 confluent bien par flacon congelé) ou une plaque sur une plaque à 6 puits pour des passages de cellule. </li></ol> 3 protocole n ° 2:. Autre HPSC colonies de mangeoires pour NCM <ol><li> Rincer pastilles HPSC par D-PBS une fois, incuber les boulettes avec 1 ml d&#39;Accutase 1X pendant 10 min, et la réaction enzymatique examiner au microscope pour assurer la dissociation de cellule unique. </li><li> Terminer les réactions enzymatiques en remettant en suspension les cellules doucement dans 5 ml de milieu contenant 10 uM mTeSR1 Y-27632 suivie d&#39;une centrifugation à 200 x g à température ambiante pendant 5 min(Note, ne pas utiliser les forces de centrifugation excessives qui causent des dommages aux cellules). </li><li> Ajouter 5 ml de milieu mTeSR1 au culot, remettre le culot de cellules individuelles, et filtre dissocié cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm (pour éviter les agrégats de cellules résiduelles). </li><li> Semences 1.3-2 x 10 6 hPSCs dans un puits (1.4 à 2.1 x 10 5 cellules / cm 2) d&#39;une plaque à 6 puits revêtu de 2,5% CSEh qualifié Matrigel, ajoutent moyen mTeSR1 jusqu&#39;à 2,5 ml, et comprennent 10 uM Y-27632 dans le milieu (pour faciliter le départ de 24 h à cellule unique placage). Sinon, utiliser les petites molécules suivantes pour remplacer 10 uM Y-27632 pour l&#39;amélioration de placage seule cellule: 1 uM Y-39983 (ROCK je inhibiteur), 1 uM phenylbenzodioxane (inhibiteur ROCK II), 1 uM thiazovivin (un inhibiteur de ROCK roman) , et l&#39;inhibiteur de JAK 2 pM 1. </li><li> Remplacez le support avec un milieu de mTeSR1 sans drogue le jour suivant (à moins de 24 h), dissocier les cellules d&#39;un supplémentbien, et compter le nombre de cellules pour déterminer l&#39;efficacité de placage seule cellule (Note: environ 50 à 90% de mono-cellulaire efficacité de placage qui peut être atteint à ce stade). </li><li> Permettent aux cellules de se développer comme un seul formé de cellules monocouche pour quelques jours avec 3 ml de milieu mTeSR1. Changer le milieu tous les jours. </li><li> Empiriquement déterminer le calendrier pour repiquer adapté MR en fonction de la densité cellulaire. Passage lorsque la croissance cellulaire atteint confluence à jour 3 ou 4 jours, ou au point de temps de 4 heures après la disparition des frontières de cellule à cellule. Dissocier les cellules dans 1 ml d&#39;Accutase, utiliser un rapport de 1 à 3 de fendage (c.-à-confluente bien une des cellules étalées dans 3 puits de plaque à 6 puits) de passages des cellules, et de stabiliser adapté NCM par cinq passages. </li><li> Cellule de congélation <ol><li> Utiliser un puits de confluence (5-6 ~ x10 6 cellules) pour un flacon congelé: dissocier les cellules d&#39;un puits confluentes avec 1 ml d&#39;Accutase pendant 10 min. </li><li> Diluer with 5 ml de mTeSR1 cellules moyen et centrifugation comme décrit ci-dessus. </li><li> Reprendre le culot dans 500 ul de milieu mTeSR1 puis ajouter lentement 500 pi de 2X HPSC milieu de congélation (contenant 20 uM Y-27632) dans un flacon de cryoconservation. En variante, remettre en suspension les cellules dans 1X HPSC milieu de congélation contenant un inhibiteur de JAK 2 uM 1 ou 1X milieu CryoStor CS10 en présence de 10 pM soit Y-27632 ou 2, l&#39;inhibiteur de JAK de 1 uM. </li><li> Placez les flacons congelés dans un réservoir cryogénique de glace réfrigéré (en bas-rempli avec isopranol) et transférer immédiatement le cryogénique à -80 ° C congélateur. </li><li> les cellules de transfert à partir de la congélation de -80 ° C à un réservoir d&#39;azote liquide (le jour suivant) pour la cryoconservation à long terme. </li></ol></li><li> Cellule dégel <ol><li> Utiliser un flacon de cryoconservation pour le placage 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Préchauffer mTeSR1 milieu dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 10 min, les cellules de dégel dans le même bain d&#39;eau pendant 2 min,goutte à goutte ajouter des cellules à 5 ml de milieu mTeSR1 préchauffé contenant 10 uM Y-27632, et centrifuger comme décrit ci-dessus. </li><li> Resuspendre doucement les boulettes de cellules avec 2 ml de milieu mTeSR1 contenant 10 uM Y-27632 et transférer progressivement les cellules à un bien pré-enduit de Matrigel (Remarque: éviter de produire des bulles d&#39;air). </li><li> Changer moyen quotidien et s&#39;attendent à une croissance HPSC pour atteindre la confluence à jour 3 ou 4. </li></ol></li></ol> 4 Protocole 3:. Autre HPSC colonies sur Matrigel à NCM Culture <ol><li> Retirer une plaque revêtue de Matrigel réfrigérateur, placez la plaque dans la culture de tissus capot pour 10 à 30 min, retirez le support de chaque puits de la plaque, et ajouter 2 ml de milieu mTeSR1 préchauffé à chaque puits. </li><li> Transfert des touffes HPSC trituré à partir de la culture d&#39;alimentation (étape 2.10 du protocole de base) à la plaque de Matrigel ci-dessus. Ajouter à moyen mTeSR1 jusqu&#39;à 2,5 ml volume final dans chaque puits. </li><li> Changer le milieu tous les jours pendant 3 à 4 jourss jusqu&#39;à ce que les colonies atteignent 80 à 90% de confluence. </li><li> Pour des passages de cellule: rincer les colonies avec D-PBS deux fois, traiter les cellules avec 1 ml de 2 mg / ml dispase à 37 ° C pendant 15 à 20 minutes, et les cellules de sédiments et de passage comme les grumeaux. </li><li> Pour la culture NCM: répétez les étapes 3.1 à 3.9 décrites dans le protocole 2. </li></ol> 5 Protocole 4:. NCM Culture de hPSCs sur LN-521 <ol><li> Décongeler la solution recombinant LN-521 à 4 ° C avant le jour de l&#39;utilisation et de préparer la solution de revêtement de la laminine (LCS) en diluant la laminine décongelé avec 1X D-PBS (contenant du Ca 2 + / Mg 2 +) à une concentration finale de 10 pg / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de la LCS à un puits dans une plaque à 6 puits (note: éviter à sec pendant le processus de revêtement). </li><li> Sceller la plaque enduite avec du Parafilm pour éviter l&#39;évaporation et stocker la plaque au réfrigérateur (4 ° C) O / N (note: utiliser la plaque dans 1 semaine). </li><li> Retirez délicatement les LCS avec une pipette Pasteur sans pouruching la surface revêtue et ajouter 2 ml de milieu mTeSR1 pour un bien. </li><li> Réchauffer toutes les solutions de culture (y compris D-PBS) dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 25 min. </li><li> Convertir colonies HPSC à NCM <ol><li> Dissocier les agrégats de cellules à cellules individuelles avec Accutase comme décrit dans le protocole 2. </li><li> Semences 1.3-2 x 10 6 hPSCs dans un puits LN-521-enduit (1.4 à 2.1 x 10 5 cellules / cm 2) sans la présence d&#39;inhibiteurs de ROCK. </li><li> Changer le milieu tous les jours pendant 3 à 4 jours. </li><li> Dissocier les cellules dans 1 ml d&#39;Accutase au jour 3 ou 4, pour le repiquage de la cellule suivante en utilisant un rapport de 1 à 3 de fendage. </li></ol></li></ol> . 6 Protocole 5: NCM Culture pour l&#39;ADN plasmidique transfection <ol><li> Adapter colonies HPSC à la culture NCM comme décrit dans les protocoles de 2 à 4. </li><li> Plate dissocié hPSCs en plaque de 12 puits avec une densité de cellules de 7,5 x 10 5 cellules / puits dans du milieu mTeSR1 en présence de 10 pM de Y-27632. </li><li> Remplacer moyen mTeSR1 avec le milieu mTeSR1 sans drogue entre 4-8 heures après l&#39;étalement des cellules. </li><li> Pour chaque transfection, diluer 2,5 pg de plasmides d&#39;expression (par exemple, pmaxGFP) et 5 ul de Lipofectamine 2000 dans des tubes Eppendorf séparées dans 125 pi de chacun d&#39;Opti-MEM Reduced Serum Medium. </li><li> Après 5 min, mélanger les réactifs dilués et incuber pendant 20 min à température ambiante (pour former des complexes de transfection). </li><li> Ajouter les complexes de transfection de 250 ul à chaque puits contenant 1 ml hPSCs en milieu mTeSR1 et incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 24 heures. </li><li> Examiner l&#39;efficacité de la transfection sous un microscope à fluorescence et la photographie de manière aléatoire pour le calcul de l&#39;efficacité de transfection réelle. </li></ol> . 7 Protocole 6: NCM Culture pour la transfection de microARN <ol><li> Dissocier hPSCs semi-confluentes à jour 2 dans des conditions NCM en ajoutant 1 ml de Accutase par puits dans 6<html> Puits plaque. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu mTeSR1 pour diluer les réactions enzymatiques et centrifuger à 200 g pendant 5 min. </li><li> Reprendre le culot cellulaire avec du milieu mTeSR1, ensemencer les cellules à une densité de 7,5 x 10 5 cellules par puits dans une plaque de 12 puits dans un milieu contenant 10 uM mTeSR1 Y-27632, et que les cellules se fixent pendant 4 heures. </li><li> Remplacez le support avec le milieu Y27632 sans mTeSR1. </li><li> Utilisez disponible dans le commerce microARN (par exemple, un miRIDIAN miRNA contrôle de transfection non-ciblage marqué avec Dy547). Titrer des concentrations allant de 0 à 160 nm en utilisant les réactifs fournis et suivez les instructions du fabricant. </li><li> Optimiser l&#39;efficacité de la transfection pour chaque concentration en traits HPSC par imagerie de la fluorescence Dy547 des cellules vivantes sous un microscope à 24 h après la transfection. </li><li> Calculer les efficacités de transfection en fonction du pourcentage de cellules positives Dy547 sur toutes les cellules imagées. </li></ol>. tle &quot;&gt; 8 Protocole 7: NCM Culture pour la transduction du vecteur lentiviral <ol><li> Répétez les étapes 7.1 à 7.4 du Protocole 6. </li><li> Calculer les quantités de particules virales à être utilisés pour la transduction: Utilisez la formule suivante: TU = (MOI x CN) / VT, alors TU représente le nombre total d&#39;unités de transformation, MOI est égale à la multiplicité souhaitée de l&#39;infection dans le puits (MOI ou TU / cellule), le CN indique le nombre de cellules dans chaque puits, et VT indique d&#39;titres viraux (TU / ml). Par exemple, étant donné que les actions des titres viraux pour SMART-shRNA vecteur est égal à 1 x 10 9 TU / ml (unités de transformation par ml), 7,5 x 10 5 cellules par puits au moment de la transduction, et une MOI attendue de 20: 15 utilisent pl des actions particules virales pour chaque bien (à noter: cette condition est recommandé pour l&#39;induction transitoire lentivirus). </li><li> Préchauffage 300 ul de milieu mTeSR1 avec 10 mg / ml de polybrène pendant 30 min. </li><li> Ajouter 15 ul de particules virales dans d&#39;le milieu mTeSR1 préchauffé contenant polybrene et mélanger doucement la solution. </li><li> Remplacer le milieu de culture de cellules avec 300 pi de milieu préchauffé contenant les particules virales. </li><li> Après 4 heures d&#39;incubation, examiner turboGFP fluorescence (un fabricant d&#39;expression shRNA) pour déterminer l&#39;efficacité de transduction. </li><li> Ajouter 300 ul de milieu mTeSR1 supplémentaire pour la transduction bien lorsque les cellules commencent à exprimer turboGFP. </li><li> Après 12-16 heures d&#39;incubation, réexaminer expression turbo-GFP. </li><li> Réaliser des expériences de suivi souhaités avec ces cellules transduites dans les 72 heures. </li></ol>

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<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin-511+but+not+-332%2C+-111%2C+or+-411+enables+mouse+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro.</a> Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).</li>
<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li>
<li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il ya deux façons principales de hPSCs de culture in vitro: culture classique de type colonie (des cellules sur des mangeoires ou des matrices extracellulaires) et de la culture de suspension de hPSCs que les agrégats sans mangeoires 6. Les limites de ces deux type de colonie et de la suspension des méthodes de culture comprennent hétérogénéité accumulé et les changements épigénétiques héritables. NCM culture, sur la base à la fois des passages à cellule unique et à haute densité cellulaire ...

La capacité de hPSCs de différencier vers les tissus adultes multilignée a ouvert de nouvelles voies pour le traitement des patients qui souffrent de maladies graves qui impliquent cardiovasculaires, hépatiques, pancréatiques, et les systèmes neurologiques 1-4. Différents types de cellules dérivées de hPSCs seraient également fournir des plates-formes cellulaires robustes pour la modélisation de la maladie, le génie génétique, le dépistage des drogues et de tests toxicologiques 1,4. La question clé qui assure leurs applications cliniques et pharmacologiques futures est la génération d&#39;un grand nombre de hPSCs clinique de qualité à travers la culture de cellules in vitro. Cependant, les systèmes de culture actuels sont insuffisants ou de nature variable, impliquant diverses cultures nourricières et sans alimentation-de hPSCs les colonies 5,6. croissance de type colonie d&#39;actions hPSCs de nombreuses caractéristiques structurelles de la masse cellulaire interne (ICM) d&#39;embryons de mammifères début. L&#39;ICM est sujette à se différencier en trois feuillets germinatifsdans un environnement multicellulaire du fait de l&#39;existence de gradients de signalisation hétérogènes. Ainsi, l&#39;acquisition de l&#39;hétérogénéité dans le développement précoce de l&#39;embryon est considéré comme un processus nécessaire à la différenciation, mais une caractéristique non désirée de la culture HPSC. L&#39;hétérogénéité de la culture HPSC est souvent induite par des signaux apoptotiques excessives et différenciation spontanée en raison des conditions de croissance sous-optimales. Ainsi, dans le type de colonies de culture, les cellules hétérogènes sont souvent observés dans la périphérie des colonies 7,8. Il a également été montré que les cellules dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) colonies réponses différentielles d&#39;exposition à des molécules telles que BMP-4 9 signalisation. En outre, les méthodes de culture des colonies produisent des rendements de cellules faibles ainsi que les taux de cryoconservation de récupération très faible de cellules en raison de taux de croissance et signalisation apoptotique incontrôlables cheminements de 6,9. Ces dernières années, diverses cultures en suspension ont été développés pour hPSCs de culture, particulArly pour l&#39;expansion de grandes quantités de hPSCs en alimentation-et les conditions sans matrice 6,10-13. Il est évident que différents systèmes de culture ont leurs propres avantages et inconvénients. En général, la nature hétérogène de hPSCs représente l&#39;un des principaux inconvénients des méthodes colonie de type et de la culture agrégées, qui sont sous-optimal pour la livraison des matériaux d&#39;ADN et d&#39;ARN dans hPSCs pour le génie génétique 6. De toute évidence, il est impératif de développer de nouveaux systèmes qui contournent certaines lacunes des méthodes de culture actuelles. Les découvertes d&#39;inhibiteurs de petites molécules (comme l&#39;inhibiteur de ROCK Y-27632 et JAK inhibiteur 1) qui améliorent la survie de cellule unique ouvrent la voie à dissociée-HPSC culture 14,15. Avec l&#39;utilisation de ces petites molécules, nous avons récemment développé un procédé de culture en fonction du type non-colonie (MR) de la croissance dissociées hPSCs-9. Cette nouvelle méthode de culture combine à la fois des passages à cellule unique et de haute densitéplacage méthodes, ce qui nous permet de produire de grandes quantités de hPSCs homogènes sous des cycles de croissance cohérentes sans grandes anomalies chromosomiques 9. En variante, la culture peut être mise en œuvre NCM avec différentes petites molécules et des matrices telles que définies (laminines) afin d&#39;optimiser le procédé de culture pour les applications de large. Ici, nous présentons plusieurs protocoles détaillés sur la base de la culture NCM et délimiter des procédures détaillées pour l&#39;ingénierie génétique. Pour démontrer la polyvalence de protocoles MR, nous avons également testé la culture NCM avec des inhibiteurs de ROCK diverses et avec la seule isoforme de laminine 521 (c.-à-LN-521).

<table><tbody><tr><td>Compteur automatisé de cellules Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Comptage automatique de cellules</td></tr><tr><td>Faxitron Armoire Système à rayons X</td><td>Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&nbsp ;</td><td>Modèle RX-650</td><td>Irradiation par rayons X des MEF MULTIWELL</td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Becton Dickinson Matériel de laboratoire</td><td>353046</td><td>Plaques de polystyrène</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965&ndash ; 092</td><td>Pour le milieu MEF</td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Roche</td><td>107409</td><td>Inhibiteur mitotique</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>25300-054</td><td>Pour dissociation MEF</td></tr><tr><td>DGEM/F12</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11330&ndash ; 032</td><td>Pour le milieu hPSC</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum Réduit&nbsp ;</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>31985-062</td><td>Pour transfection hPSC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash ; 044</td><td>Composant du sérum de remplacement moyen MEF</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen Inc.</td><td>10828&ndash ; 028</td><td>KSR, Composant du hPSC medium</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td>D-PBS, sans Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140&ndash ; 050</td><td>NEAA, composant du milieu hPSC</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>25030&ndash ; 081</td><td>Composant du milieu hPSC</td></tr><tr><td>mTeSR1 & Suppléments</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Sans protéines animales</td></tr><tr><td>TeSR2 & Suppléments</td><td>StemCell Technologies</td><td>5860</td><td>Milieu sans xéno</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>M7522</td><td>Composant de</td></tr> la <tr><td>collection de cultures de type américain (ATCC)</td> de hPSC moyen<td> (CF-1)</td>&nbsp ;<td>SCRC-1040</td><td>Pour la culture nourricière de hPSC</td></tr><tr><td>hESC qualifiée hESC Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td>Pour la culture sans feeder de hPSCs</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td>Protéine recombinante humaine</td></tr><tr><td>FGF-2 (FGF recombinant, basique)</td><td>R& D Systems, MN</td><td>223-FB</td><td>Facteur de croissance dans le milieu hPSC</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>1X solution enzymatique mixte</td></tr><tr><td>Inhibiteur de JAK I</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>420099</td><td>Un inhibiteur de Janus kinase</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>688000</td><td>Inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>Y-39983</td><td>Stemgent</td><td>04-0029</td><td>Inhibiteur de ROCK I</td></tr><tr><td>Phénylbenzodioxane</td><td>Stemgent</td><td>04-0030</td><td>Inhibiteur de ROCK II</td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Un nouvel inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td>40 &micro ; passoire à cellules m</td></tr><tr><td>Nalgene 5100-0001 Cryo 1 &deg ; C</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>C6516F-1</td><td>"M. Frosty » Contenant de congélation</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11668-027</td><td>Réactifs de transfection</td></tr><tr><td>DharmaFECT Duo</td><td>Thermo Scientific</td><td>T-2010-02</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>miARN miRIDIAN non ciblé Contrôle de la transfection</td><td>Thermo Scientific</td><td>IP-004500-01-05</td><td>Marqué avec Dy547, pour surveiller l’administration des microARN.</td></tr><tr><td>SMART-shRNA</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>À déterminer</td><td>Vecteur lentiviral</td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>amaxa Inc (Lonza)</td><td>Inclus dans chaque kit de transfection</td><td>Plasmide d’expression pour le contrôle de la transfection</td></tr><tr><td>Oct-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>Souris IgG2b, marqueur pluripotent</td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21702</td><td>IgM de souris, marqueur de différenciation</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-21704</td><td>IgG3 de souris, marqueur pluripotent</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21705&nbsp ;</td><td>IgM de souris, marqueur pluripotent</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21706</td><td>IgM de souris, marqueur pluripotent</td></tr><tr><td>CK8 (C51)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8020</td><td>IgG1 de souris, contre la cytokératine 8</td></tr><tr><td>&alpha ;-fœtoprotéine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8399</td><td>AFP, souris IgG2a</td></tr><tr><td>HNF-3&beta ; (P-19)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9187</td><td>FOXA2, anticorps polyclonal de chèvre</td></tr><tr><td>Troponine T (Av-1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-P0</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9014-P1</td><td>Rabbit IgG</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>ReproCELL Inc, Japon</td><td>RCAB0004P-F</td><td>Anticorps polyclonal&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-GFAP chez le rat</td><td>Zymed</td><td>13-0300</td><td>Protéine acide fibrillaire gliale</td></tr><tr><td>Albumine (clone HSA1/25.1.3)</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL2513A</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>Actine musculaire lisse (clone 1A4)</td><td>DakoCytomation Inc</td><td>IR611/IS611</td><td>Souris IgG2a</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5326</td><td>Lapin Anticorps polyclonal</td></tr><tr><td>TUBB3</td><td>Convance Inc</td><td>MMS-435P</td><td>Tuj1, souris IgG2a</td></tr><tr><td>HNF4&alpha ; (C11F12)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3113</td><td>Anticorps monoclonal de lapin</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (solution)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixateur, dilué dans du D-PBS</td></tr></tbody></table>

cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont très prometteuses pour la médecine régénérative et les applications biopharmaceutiques. À l’heure actuelle, la culture optimale et l’expansion efficace de grandes quantités de CSPh de qualité clinique sont des questions cruciales dans les thérapies à base de CSPh. Traditionnellement, les hPSC se multiplient en colonies dans des systèmes de culture avec ou sans mangeoire. Cependant, ces méthodes présentent plusieurs limites majeures, notamment de faibles rendements cellulaires et la génération de cellules différenciées de manière hétérogène. Pour améliorer les méthodes actuelles de culture de hPSC, nous avons récemment développé une nouvelle méthode, basée sur la culture monocouche de type non-colonie (NCM) de cellules uniques dissociées. Ici, nous présentons des protocoles NCM détaillés basés sur l’inhibiteur de la kinase associée à Rho (ROCK) Y-27632. Nous fournissons également de nouvelles informations concernant la culture de NCM avec différentes petites molécules telles que l’Y-39983 (inhibiteur de ROCK I), le phénylbenzodioxane (inhibiteur de ROCK II) et la thiazovivine (un nouvel inhibiteur de ROCK). Nous étendons davantage notre protocole de base pour cultiver des hPSC sur des protéines extracellulaires définies telles que l’isoforme de laminine 521 (LN-521) sans utiliser d’inhibiteurs de ROCK. De plus, sur la base de NCM, nous avons démontré la transfection ou la transduction efficace d’ADN plasmidique, de particules lentivirales et de microARN à base d’oligonucléotides en hPSC afin de modifier génétiquement ces cellules pour des analyses moléculaires et la découverte de médicaments. Les méthodes basées sur le NCM surmontent les principales lacunes de la culture de type colonie et peuvent donc convenir à la production de grandes quantités de hPSC homogènes pour les futures thérapies cliniques, la recherche sur les cellules souches et la découverte de médicaments.

Un schéma général de la culture NCM La figure 1 représente un schéma typique de culture NCM montrant les changements dynamiques de hPSCs après placage à forte densité de cellule unique en présence de l&#39;inhibiteur de ROCK Y-27632. Ces changements morphologiques comprennent des connexions intercellulaires après placage, la formation de grappes cellulaires, et la croissance cellulaire exponentielle suivie d&#39;une condensation de cellules (Figure 1...

Ici, nous présentons des protocoles de culture de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), basés sur la croissance de cellules uniques dissociées de type monocouche non colonie (NCM). Cette nouvelle méthode, qui utilise des inhibiteurs de kinases associés à Rho ou l’isoforme 521 de la laminine (LN-521), convient à la production de grandes quantités de hPSC homogènes, à la manipulation génétique et à la découverte de médicaments.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole démontre comment maintenir en bonne santé, indifférencié souches embryonnaires humaines (ES) cellules.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Le protocole suivant fournit des instructions pour l'adaptation humaine souches pluripotentes induites (iPS) à la desserte de culture sans l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyennes (KSR-FF). Une fois adaptée, des instructions pour l'entretien continu sont également fournis.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

Les protocoles décrits permettent aux laboratoires d’effectuer une culture de cellules souches évolutives et adhérentes à haut débit avec un minimum de main-d’œuvre, d’expérience et de coût d’investissement en équipement à l’aide d’un robot de manipulation de liquides programmable et de plaques à 96 puits.  Les iPSC passées plus de 20 fois sur ce système ont maintenu la pluripotence, les caryotypes normaux et se sont différenciées en cardiomyocytes.

Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

Ce protocole offre un moyen simple et efficace de propager des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain dans une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrats synthétiques spécifiques aux hPSC.

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

Voici un protocole pour cultiver des cellules souches pluripotentes (CSP) et des cellules souches neurales (CSN) dans un système de culture cellulaire fermé qui permet une stérilité et une reproductibilité maximales, remplaçant l’enceinte de biosécurité et l’incubateur traditionnels. Cet équipement est conforme aux directives de bonnes pratiques de fabrication clinique (cGMP) et de bonnes pratiques de laboratoire clinique (cGLP).

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

La caractérisation régulière des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), afin de déterminer le maintien de leur état pluripotent, est une étape importante avant que ces cellules ne soient utilisées pour d’autres applications. Nous décrivons ici une méthode de propagation à petite échelle des iPSC humaines, spécialement conçue pour permettre leur caractérisation facile et routinière par immunocytochimie.

Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.

Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

Afin d’éviter les limitations associées au passage enzymatique ou mécanique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi) cultivées sur des cellules nourricières, nous avons mis au point une méthode rapide, efficace, rentable et à haut rendement pour la récolte de colonies de CSEh ou de CSPhi, maintenues sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes de prépuce humain en utilisant la désadhésion médiée par l’EDTA.

Passage rapide, rentable et sans enzyme de cellules souches pluripotentes humaines sur des cellules nourricières par désadhérence médiée par l’acide éthylènediaminetétraacétique

Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.

Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Découvrez une méthode de culture en monocouche non coloniale pour les cellules souches pluripotentes humaines utilisant des inhibiteurs de la kinase associée à Rho et la laminine 521. Cette approche optimise la croissance cellulaire homogène pour la recherche en médecine régénérative.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l'analyse génétique

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