Name: Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez un test de plug de matrigel pour évaluer l'angiogenèse induite par les facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses chez la souris. Cette méthode combine échographie et endomicroscopie pour analyser la densité et la morphologie vasculaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le laboratoire de recherche Satchi-Fainaro est partiellement soutenu par l’Association pour la recherche internationale sur le cancer (AICR), la Fondation germano-israélienne (GIF), la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 1309/10), le Swiss Bridge Award, et par des subventions de l’Initiative nationale israélienne en nanotechnologie (INNI), du programme Focal Technology Area (FTA) : Nanomédecine pour le théranostique personnalisé, et par le Fonds de recherche en nanotechnologie Leona M. et Harry B. Helmsley.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés et réalisés en conformité avec les normes de l&#39;Université de Tel Aviv Sackler School of Medicine institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Préparation conditionné médias <ol><li> Graine 2 x 10 6 cellules U-87 MG dans une plaque de culture de 10 cm dans un volume de 8 ml du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline / streptomycine / nystatine à 1%. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C; 5% de CO 2 jusqu&#39;à la réalisation complète de confluence à 48 h. </li><li> Utiliser une seringue de 10 ml, retirer tout support de la plaque et filtrer à travers un filtre de 0,45 um dans un tube de 15 ml. </li><li> Sans lavage de la plaque de cellules, ajouter 1 ml de solution de trypsine (0,25%) et incuber. </li><li> Lorsque toutes les cellules sont décollées, inactiver la trypsine en utilisant au moins 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et préformer un nombre de cellules. </li><li<html> &gt; Compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un autre dispositif de comptage de cellule et calculer le nombre de cellules selon le procédé de comptage utilisé. NOTE: Il sera utilisé plus tard afin de normaliser la concentration CM. </li><li> Transférer le CM à un verre ballon à fond rond et on concentre sous vide poussé évaporateur rotatif. Afin d&#39;accélérer le processus, augmenter la température du bain à 37 ° C, si on le souhaite. Continuez jusqu&#39;à ce que le CM réalise une texture pâteuse. </li><li> Reprendre le CM de chaque plaque de culture dans 400 ul de solution saline. Lorsque vous utilisez plus d&#39;une plaque, utiliser un volume équivalent. Par exemple, pour deux plaques de culture, utiliser 800 pi. Utilisez chaque plaque pour 4 souris. </li><li> Afin de comparer différentes lignées cellulaires ou des traitements, ajuster le volume en fonction du rapport de cellule reçue à l&#39;étape 1.6. Par exemple, si une plaque 1.5x contient plus de cellules, ajouter 200 ul de solution saline pour les 400 ul de pré-existants. Ce sera le CM ajusté </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-mimétique Gel Plug-inoculation à des souris <ol><li> Avant l&#39;inoculation du gel de ECM-mimétique à des souris, préparer les matériaux suivants: <ol><li> Les facteurs de croissance réduits gel de ECM-mimétique sans phénol (décongeler une nuit, un jour avant l&#39;expérience, à 4 ° C sur de la glace). </li><li> Rasoir électrique. </li><li> Kétamine et de xylazine pour anesthésier les souris. </li><li> Glacée 1000 conseils ul stériles. </li><li> Glacée seringue de 1 ml et 27 g d&#39;aiguilles. </li></ol></li><li> Préparer pour chaque souris un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 80 ul ajustés CM et garder sur la glace. </li><li> Pour chaque tube, ajouter 600 les facteurs de croissance glacées ul gel de ECM-mimétique sans phénol réduite qui a été décongelé nuit à 4 ° C, sur de la glace. Le gel d&#39;ECM-mimétique est liquide à 4 ° C et se solidifie à la température du corps; afin d&#39;éviter le gel de l&#39;ECM-mimétique de se solidifier, utiliser 1000 conseils ul glacées. Mélanger soigneusement tubes sans formation de bulles et de garder sur la glace. </li><li> Anesthésier vieille six semaines BALB / c souris en utilisant de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée selon le soins institutionnels animale et du comité de l&#39;utilisation, ce est à dire avant le début de l&#39;expérience. Les animaux ont atteint leur bon plan de l&#39;anesthésie quand ils ne répondent plus à un pincement de l&#39;orteil entreprise. </li><li> Rasez la région abdominale des souris et désinfecter l&#39;aide d&#39;un gommage chirurgicale / alcool. </li><li> Utiliser une seringue froid 1 ml et une aiguille de 27 G pour injecter le contenu du tube Eppendorf voie sous-cutanée. Effectuer l&#39;injection très lentement pour éviter la formation de bulles. Une fois tout le volume est administré, ne pas éjecter l&#39;aiguille pendant plusieurs minutes, jusqu&#39;à ce que la solidification se produit. </li></ol> 3. Évaluation des ECM-mimétique Gel Branchez vascularisation par ultrasons NOTE: Cette partie du protocole nécessite la connaissance préalable de fonctionnement d&#39;un système d&#39;imagerie par ultrasons, ou l&#39;assistance d&#39;un technicien agréé. <ol><li> Avant de commencer, avoir la fmatériaux et instruments prêts uite: <ol><li> Rasoir électrique. </li><li> Crème dépilatoire. </li><li> Kétamine et de xylazine pour anesthésier les souris. </li><li> Microbulles non ciblée. </li><li> dispositif d&#39;activation. </li><li> Système d&#39;imagerie US, y compris un 55 MHz 708 sonde et une acquisition micromanipulateur 3D. </li></ol></li><li> Mesurer la vascularisation dans les bouchons trois semaines après l&#39;inoculation: NOTE: Dans le modèle animal U-87 MG-base, trois semaines a été trouvé pour représenter le point de moment idéal pour l&#39;imagerie. Sous différents paramètres, calibrer la cinétique de vascularisation à partir de quelques jours après l&#39;inoculation de bouchons. <ol><li> Anesthésier les souris à l&#39;aide de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée selon le soins institutionnels animale et du comité de l&#39;utilisation, ce est à dire avant le début de l&#39;expérience. Les animaux ont atteint leur bon plan de l&#39;anesthésie quand ils ne répondent plus à un pincement de l&#39;orteil entreprise. </li><li> Raser lesrégion abdominale des souris et traiter avec de la crème dépilatoire. </li><li> Fixer les souris passivement sur la scène de la micro-manipulateur. </li><li> En utilisant une solution saline contenant 1 ml de seringue et une aiguille 30 G, placer l&#39;aiguille à l&#39;intérieur de la veine caudale, fixer fermement l&#39;aiguille et desserrer la seringue. </li><li> Mettre en place pour la session 3D en mode acquisition de l&#39;image de contraste: <ol><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; pour initialiser l&#39;étape du moteur 3D et placer le transducteur dans le milieu de la zone de numérisation souhaitée. </li><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et entrez la distance et l&#39;étape format de numérisation, puis appuyez sur &quot;Scan&quot;. </li><li> Assurez-vous que l&#39;ensemble du bouchon a été balayé dans les données d&#39;image 3D affichées. Si non, ajustez la sonde afin que l&#39;ensemble du bouchon est visible dans l&#39;analyse et répétez l&#39;étape 3.5.2. </li><li> Appuyez sur &quot;Contraste&quot; et pousser la compensation de gain de temps (TGC) contrôle vers la gauche pour assombrir l&#39;image. </li></ol></li><li> Activer les microbulles en utilisant un mélangeur flacon qui est designated pour l&#39;activation de microbulles pendant 45 sec. </li><li> Mélanger dans un seringue de 1 ml 50 pi de microbulles avec 50 ul de solution saline. </li><li> Remplacer la seringue contenant une solution saline-desserré avec une seringue contenant des microbulles activés. Injecter les microbulles dilué dans la veine de la queue des souris, attendre quelques secondes pour que les bulles d&#39;atteindre un état d&#39;équilibre, puis acquérir 3D contraste amélioré ciné boucle de la prise, en utilisant le moteur d&#39;acquisition 3D: <ol><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et sélectionnez &quot;Scan&quot; pour acquérir des images à contraste renforcé 3D puis appuyez sur &quot;Cine Store&quot; pour enregistrer les données d&#39;image. </li><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et cliquez sur &quot;Destroy 3D&quot; pour détruire les microbulles. </li><li> Appuyez sur &quot;3D&quot; et sélectionnez &quot;Scan&quot; pour acquérir une boucle ciné post-destruction, puis appuyez sur &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Générer la superposition des trames d&#39;image avant et après l&#39;destruction de microbulles: <ol><li> Dans la &amp;# 8220; Paramètres de référence &quot;sur le côté gauche de l&#39;écran cliquez sur&quot; Créer de référence &quot;. </li><li> Appuyez sur &quot;Study Management&quot; pour ouvrir la boucle ciné pré-acquis de destruction. </li><li> Cliquez sur &quot;Processus de Cine&quot; pour générer la superposition de contraste vert, puis cliquez sur &quot;Load Into 3D&quot;. </li></ol></li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie américain afin de quantifier l&#39;image 3D obtenue pour le volume de sang dans les bouchons: <ol><li> Appuyez sur &quot;Scan / Freeze» et appuyez sur &quot;Paramètres de mode&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Volume&quot; et sélectionnez &quot;parallèle&quot;. </li><li> Insérer un volume 3D du tissu cible par segmentation d&#39;une série de contours. </li><li> Cliquez sur &quot;Terminer&quot; pour terminer la segmentation. REMARQUE: Le volume de l&#39;agent de contraste sera affiché sur le côté inférieur gauche de l&#39;écran. </li></ol></li><li> À la fin de la procédure, placez la souris dans un environnement propre et sec et chaud, calme, loin ded&#39;autres animaux. Fournir de la chaleur en utilisant un tampon disponible dans le commerce chirurgicale chauffage ou une lampe à incandescence (50-75 watts), placé 12-14 centimètres de rongeurs. Surveiller souris continuellement jusqu&#39;à ce que le maintien de la posture debout et de marcher normalement. </li></ol></li></ol> 4. Évaluation des ECM-mimétique Gel Branchez Vasculature Morphologie Utilisation fibrée confocale Endomicroscopie NOTE: cette partie du protocole est effectuée imagerie US immédiatement après et il nécessite la connaissance préalable de l&#39;exploitation du système d&#39;imagerie confocale fibrée de l&#39;endomicroscopie, ou l&#39;assistance d&#39;un technicien agréé. <ol><li> Avant de commencer, avoir les matériaux et instruments prêts suivants: <ol><li> outils de chirurgie comme une pince, ciseaux et fils à coudre résorbables. </li><li> Dextran-FITC conjugué (70 kDa). </li><li> des solutions d&#39;étalonnage (trois tubes contenant chacun peroxyde d&#39;hydrogène, eau ou de solution fluorescente). </li><li> Système d&#39;imagerie et d&#39;unsonde appropriée pour l&#39;imagerie des vaisseaux sanguins selon fabricant. </li></ol></li><li> Anesthésier les souris à l&#39;aide de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). </li><li> Iv administrer, via la veine caudale, 200 ul de 10 mg / ml de dextrane marqué au FITC. </li><li> Désinfectez la région abdominale chirurgicale en utilisant un gommage / alcool et appliquer une petite incision d&#39;environ 1 cm de la fiche. </li><li> Placer la sonde de l&#39;endomicroscopie sur le dessus de la bougie doucement tout en gardant la fiche intacte. </li><li> Acquisition: <ol><li> Une fois la sonde est réglée sur la fiche, appuyez sur &quot;Démarrer laser&quot; en utilisant la pédale. La fluorescence devrait être affiché sur l&#39;écran. </li><li> Acquérir des films courts (jusqu&#39;à 30 secondes) en appuyant sur «Record» sur l&#39;écran ou &#39;Select&#39; en utilisant la pédale. </li><li> Entre les films, laver la sonde en plaçant la pointe dans un tube contenant de l&#39;eau. </li><li> Lorsque vous avez terminé, retirez la sonde et nettoyer l&#39;embout avec un coton-tige. </li></ol></li><li> Pour analyser moyenne cinqdiamètre ssel: <ol><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;Détecter microvaisseaux&quot; dans le panneau supérieur pour ouvrir la fenêtre du module de détection des navires. </li><li> Cliquez sur &quot;Préférences&quot; et marquer &quot;le diamètre du vaisseau moyenne&quot; dans la &quot;statistique d&#39;intérêt» et «Afficher les barres de l&#39;histogramme&quot; dans le &quot;Mode d&#39;affichage&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Détecter&quot; pour afficher les mesures sélectionnées. </li></ol></li><li> Pour analyser l&#39;intensité du signal fluorescent dans les zones adjacentes aux vaisseaux sanguins: <ol><li> Cliquez sur &quot;Créer un cercle ROI&quot; dans le panneau de gauche et de créer un cercle dans la zone d&#39;intérêt. </li><li> Cliquez sur &quot;Calculer histogramme sein ROI&quot; pour calculer les valeurs liées à cette région. </li></ol></li></ol> 5. Traitement post-procédurale de souris <ol><li> À la fin de chaque procédure d&#39;imagerie, placez la souris dans un environnement propre et sec et chaud, calme, loin des autres animaux. Fournir de la chaleur en utilisant un commerce-uncoussin chauffant chirurgicale vailable ou une lampe à incandescence (50-75 W), placés dans 12-14 loin de rongeurs. Surveiller souris continuellement jusqu&#39;à ce que le maintien de la posture debout et de marcher normalement. </li><li> Pour une analyse plus approfondie de la vascularisation de bouchons à des points de temps supplémentaires, appliquer les conditions de récupération suivantes: <ol><li> Suturer la petite incision avec des sutures absorbables. </li><li> Donnez une analgésie souris comme la buprénorphine (1 mg / kg par voie sous cutanée), et revenir à des cages individuelles. </li><li> Observez tous les animaux pour déterminer si un traitement antalgique est nécessaire et de réévaluer tous les jours pour surveiller et évaluer la détresse. </li></ol></li><li> À la fin-point de l&#39;expérience, euthanasier les souris par l&#39;isoflurane appliquant d&#39;abord, suivie par dislocation cervicale. </li><li> Si l&#39;imagerie supplémentaire sera effectué dans les semaines suivant les étapes initiales d&#39;imagerie, toutes les procédures doivent être aussi stérile que possible. Un gommage de la peau chirurgicale doit être réalisée, wa stérileter et coton stérile conseils devraient être utilisés pour nettoyer la sonde de l&#39;endomicroscopie, et la sonde doivent être désinfectés entre chaque animal en utilisant de l&#39;eau stérile. </li></ol>

<ol><li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth%3A+an+in+vivo+Matrigel+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li>
<li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane%2C+heparin%2C+and+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+assays%3A+a+critical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li>
<li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li>
<li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+cytometry%3A+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li>
<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li>
<li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+medical+imaging%3A+current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li>
<li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li>
<li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li>
<li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Combinant les méthodes d&#39;imagerie complémentaires permet l&#39;acquisition d&#39;informations sur la densité des microvaisseaux, la fonctionnalité et la morphologie de différentes composantes de l&#39;angiogenèse. Chargement CM sur les bouchons de gel ECM-synoptique génère un microenvironnement tumoral, qui est séparée des autres populations de cellules, comme les cellules endotheliales, qui sont recrutés et se extravaser dans le bouchon. En effectuant, en parallèle, des microbulles cont...

L&#39;essai d&#39;angiogenèse de bouchon de Matrigel a été décrit en premier par Kibbey et al. En 1992, où elle a été utilisée pour évaluer la stimulation de l&#39;angiogenèse par la SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) une. Contrairement à d&#39;autres essais in vivo de l&#39;angiogenèse, comme l&#39;angiogenèse de la cornée de souris ou de poulet dosages de membrane chorio, ce dosage est relativement facile à réaliser deux. Le gel d&#39;ECM-mimétique injecté peut contenir des cellules pro-angiogénique, ou un des composés anti-angiogènes et / ou facteurs. Lors de l&#39;évaluation de l&#39;activité d&#39;un composé anti-angiogénique, le bouchon contient normalement un mélange de facteur de croissance endothelial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), et la substance anti-angiogénique peut être administré directement dans le bouchon ou systémique 3, 4. Le gel de ECM-synoptique est injection sous-cutanée où il se solidifie en quelques minutes. Évaluation de recrutement des vaisseaux sanguins dans le bouchon résultant est typically effectuée en mesurant le taux d&#39;hémoglobine à l&#39;intérieur de la prise, par mesure du signal de fluorescence suite à l&#39;injection de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au dextran, par immunocoloration de coupes histologiques de marqueurs spécifiques endothéliales ou de cellules activé par fluorescence (FACS) 2,5, 6. Cependant, cette évaluation ne permet qu&#39;une analyse de point final et n&#39;a pas d&#39;informations sur la fonctionnalité et la morphologie des vaisseaux sanguins. En outre, les mesures de volume de plasma, soit par le taux d&#39;hémoglobine ou de dextran-FITC en utilisant comme indicateur, peut être trompeuse, car la teneur en sang est affectée par la taille des vaisseaux sanguins et l&#39;étendue de mares de sang. Cela est particulièrement important lorsque le système vasculaire recruté est caractérisée par la perméabilité accrue et la rétention (EPR) effet 7. Nous vous proposons ici un nouveau plus précise, un procédé pour la visualisation des vaisseaux sanguins recrutés, en combinant les deux techniques d&#39;imagerie complémentaires. Higmicrobulles h résolution ultrasons contraste amélioré (US) combinés avec intravitale fibré-confocale endomicroscopie peut fournir des informations non seulement sur la densité des vaisseaux sanguins, mais aussi sur leur morphologie et leur fonctionnalité. En outre, cette analyse peut être effectuée à plusieurs points dans le temps permettant ainsi le suivi de la cinétique de l&#39;angiogenèse. États-Unis sont une modalité d&#39;imagerie largement utilisé qui possède une haute résolution spatiale pour les vaisseaux sanguins imagerie suivante par voie intraveineuse (iv) injection de microbulles qui restent exclusivement dans le compartiment vasculaire 8-11. Les microbulles sont microbulles remplies de gaz qui produisent un signal échogène forte lorsqu&#39;il est excité avec une impulsion des États-Unis et servir ainsi comme un bon agent de contraste. Des images 3D de la fiche sont acquises à l&#39;aide du logiciel de système d&#39;imagerie Etats-Unis après la destruction des microbulles. Les images obtenues sont composées de trames d&#39;image avant et après la destruction de microbulles et reflètent la différence d&#39;intensité de la vidéo en couleur. Ces superposéeles images sont affichées automatiquement par le logiciel. Par conséquent, le pour cent de vaisseaux fonctionnels dans le bouchon peut être quantifiée. Haute résolution fibrée endomicroscopie confocale sert de modalité d&#39;imagerie complémentaire en signalant sur les vaisseaux sanguins morphologie. Dans cette méthode minimalement invasive, les images sont acquises suite à l&#39;administration intraveineuse de dextran conjugué au FITC 12. Le polymère fluorescent teint dans la circulation sanguine et sert comme un «agent de contraste» pour les vaisseaux sanguins morphologie et la circulation sanguine ainsi. En outre, étant donné que le polymère est injecté à une taille de 70 kDa, il ne peut traverser les vaisseaux qui fuient que l&#39;on trouve dans le système vasculaire tumoral. Cela se traduira par du bruit de fond élevé de dextrane marqué au FITC à l&#39;extérieur des vaisseaux sanguins. Par conséquent, endomicroscopie confocale fibrée peut être utilisé pour visualiser les caractéristiques typiques de l&#39;effet EPR dans la tumeur qui fuient agrandies navires, neovasculature-, hautement enchevêtrées, avec des extrémités franches. Ce modèle de système a été décrilit dans la comparaison du potentiel angiogénique de U-87 MG glioblastome humain clone et son dormant 13. La vascularisation dans les bouchons a été évalué trois semaines après l&#39;inoculation de gel ECM-synoptique. Il a été montré que la vascularisation à l&#39;intérieur des bouchons contenant CM U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices a été augmenté de façon significative en termes de nombre, la densité et la fonctionnalité, par rapport à la vascularisation à l&#39;intérieur des bouchons contenant CM de cellules tumorales génératrices de dormance. Par conséquent, les auteurs ont pu conclure que CM isolé du U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices contient des niveaux plus élevés de facteurs pro-angiogéniques, par rapport à la CM de cellules tumorales génératrices dormants. Ces facteurs stimulent la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels par un effet positif sur toutes les étapes de la cascade angiogénique (par exemple, la prolifération, la germination, la migration et finalement, la formation de structures tubulaires de cellules endothéliales).

<table><tbody><tr><td>Évaporateur rotatif sous vide</td><td></td> <td>--</td><td>-</td></tr> <tr><td>Facteurs de croissance réduits sans phénol Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>FAL356231</td><td>décongeler pendant la nuit, à 4 &deg ; C sur glace</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>-</td><td>-</td><td>--</td></tr> <tr><td>Vevo2100 Système d’imagerie américain</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>Nécessite des connaissances préalables en fonctionnement ou l’assistance d’un technicien agréé</td></tr><tr><td>sonde 55 MHz 708</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie Vevo2100</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>VialMix</td><td>DEFINITY Imaging</td><td>VMIX-DEFINITY</td><td></td></tr> <tr><td>microbulles</td><td>DEFINITY Imaging</td><td>DE4</td><td>S’activer pendant 45 secondes à l’aide de VialMix avant utilisation</td></tr><tr><td>CellVizio (Endomicroscope confocal fibré)</td><td>Mauna Kea</td> <td>Technologies-Nécessite</td> des <td>connaissances préalables en fonctionnement ou l’assistance d’un technicien agréé</td></tr><tr><td>Sonde ProFlex MiniO/30</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>70 kD FITC labellisé dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945-ImageCell</td><td></td></tr> <tr><td>software</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Kit d’étalonnage</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)</td><td>Gibco Life Tecchnologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline/streptomycine/nystatine</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Le sous-cutanée de matrigel bouchon dosage chez la souris est une méthode de choix pour l&#39;évaluation in vivo de facteurs pro et anti-angiogéniques. Dans ce procédé, les facteurs désirés sont introduits dans le gel de ECM-mimétique à froid liquide qui, après l&#39;injection sous-cutanée, se solidifie pour former un milieu simulant le milieu du cancer. Cette matrice permet la pénétration des cellules hôtes telles que des cellules endotheliales, et donc, la formation de vaisseaux sanguins. Ici, nous proposons une nouvelle analyse de bouchon de Matrigel modifié, qui peut être exploitée pour illustrer le potentiel angiogénique d&#39;une piscine de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses, par opposition à un élément spécifique (par exemple, le bFGF et le VEGF) ou un agent. La fiche contenant du gel de ECM-synoptique est utilisée pour introduire l&#39;hôte (ce est à dire, souris) avec un pool de facteurs sécrétés au CM de cellules de glioblastome tumorales génératrices à croissance rapide. Nous avons déjà décrit une comparaison approfondie du potentiel angiogénique deU-87 MG glioblastome humain clone et de son dérivé dormant, dans ce modèle de système, montrant l&#39;angiogenèse induite dans les cellules parentales MG U-87. Le CM est préparé en filtrant les médias recueillies à partir de plaques de culture de tissus de confluence des deux lignée cellulaire suivants 48 heures d&#39;incubation. Par conséquent, il ne contient que des facteurs sécrétés par les cellules, sans que les cellules elles-mêmes. On décrit ici est la combinaison de deux techniques d&#39;imagerie, micro-bulles imagerie ultrasonore à contraste amélioré et intravitale endomicroscopie de fibrée-confocale, pour une précision, la caractérisation en temps réel de la mesure, de la morphologie et de la fonctionnalité de nouvellement formés vaisseaux sanguins dans les bouchons.

L&#39;implantation des fiches de gel ECM-mimétique avec CM à partir de la lignée cellulaire de tumeur génératrices angiogénique à croissance rapide U-87 MG, des résultats très étendue dans l&#39;angiogenèse. Ce système vasculaire peut être largement exploré en utilisant deux méthodes d&#39;imagerie complémentaires. Les microbulles contraste amélioré imagerie US révèle très étendue recrutement des vaisseaux sanguins fonctionnels dans le bouchon en illustrant étendue du flux sanguin à l&#39;in...

Nous décrivons un test de matrigel pour illustrer le potentiel angiogénique d’un ensemble de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses à l’aide de deux modalités d’imagerie complémentaires, l’échographie et l’endomicroscopie. Le matrigel, un gel imitant la matrice extracellulaire (ECM), est utilisé pour introduire chez l’hôte (la souris) des facteurs angiogéniques sécrétés dans le milieu conditionné (C.M.).

Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser l'échographie et la microscopie endo pour illustrer le potentiel angiogénique d'un ensemble de facteurs sécrétés par des cellules cancéreuses. Ceci est réalisé en implantant d'abord une éponge afin de créer un environnement similaire à une tumeur chez la souris en l'absence de cellules tumorales. Ensuite, la densité des vaisseaux sanguins et le pourcentage de vaisseaux sanguins fonctionnels au sein de l'éponge sont évalués.Dans la dernière étape, la morphologie des vaisseaux sanguins est visualisée. En définitive, l'équilibre entre les facteurs pro- et anti-angiogéniques sécrétés par les cellules et leurs effets sur l'angiogenèse peut être évalué in vitro, in vivo et à différents points temporels à l'aide de deux modalités d'imagerie complémentaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test classique du plug de Matrigel, est qu'elle permet l'analyse d'un ensemble de facteurs sécrétés par les cellules tout en utilisant des modalités d'imagerie intravitale complémentaires.Pour démontrer cette procédure, elle sera réalisée par She Ran F, étudiante au doctorat dans mon laboratoire. Pour évaluer la vascularisation d’un gel mimétique de la matrice extracellulaire, ou ECM, à l’aide d’ultrasons, commencez par placer un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant 80 microlitres de milieu conditionné fraîchement préparé sur de la glace. La partie la plus délicate de la procédure consiste à injecter le gel sans bulles, en utilisant des embouts glacés. Un mélange doux et une injection lente garantiront une administration optimale du gel.Ensuite, à l’aide de pipettes de 1000 microlitres refroidies sur glace, mélanger 600 microlitres de gel mimétique de MEC refroidi sur glace à quatre degrés Celsius toute la nuit. Intégrer le gel décongelé dans le milieu en prenant soin de ne pas former de bulles. Après avoir confirmé la sédation par pincement de l’orteil, raser l’abdomen de chaque souris et utiliser une seringue de un millilitre refroidie sur glace, équipée d’une aiguille de 27 gauge, pour injecter lentement de manière sous-cutanée.Injecter le contenu d'un tube EEND DPH par animal. Une fois que tout le volume a été administré, maintenir l'aiguille en place pendant plusieurs minutes jusqu'à ce que la solidification se produise. Trois semaines plus tard, raser à nouveau la zone abdominale des souris, éliminer tout poil excédentaire à l'aide d'une crème dépilatoire, puis fixer les souris en position dorsale sur la platine du micromanipulateur.Ensuite, remplissez une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 30 avec du sérum physiologique. Puis insérez l'aiguille dans la veine de la queue. Fixez fermement l'aiguille et desserrez la seringue.Placez maintenant le transducteur au centre de la zone de balayage souhaitée et cliquez sur 3D pour initialiser la platine motorisée 3D. Cliquez sur 3D. Saisissez à nouveau la distance de balayage et la taille du pas, puis appuyez sur balayage.Confirmez que l'ensemble du bouchon a été scanné dans les données d'image 3D affichées. Si ce n'est pas le cas, ajustez le transducteur afin que tout le bouchon soit visible, puis balayez à nouveau la zone comme vient de l'être. Ensuite, sélectionnez le contraste et réglez les commandes de compensation du gain en fonction du temps, ou tgc, pour assombrir l'image, et utilisez un mélangeur de flacons pour activer les microbulles pendant 45 secondes.Ensuite, mélanger 50 microlitres de microbulles avec 50 microlitres de sérum physiologique dans une seringue d'un millilitre. Remplacer la seringue contenant le sérum physiologique par celle contenant les microbulles activées, puis injecter les microbulles diluées dans la veine de la queue de chaque souris. Attendre quelques secondes que les bulles atteignent un état stable, puis cliquer sur 3D et sélectionner « scan » pour acquérir l'image en 3D.Images avec contraste amélioré. Cliquez sur vu un magasin pour enregistrer les données d'image, puis sélectionnez 3D et détruire 3D. Pour détruire les microbulles, cliquez à nouveau sur 3D et sélectionnez balayage pour acquérir une séquence post-destruction.Ensuite, cliquez sur un magasin vu à nouveau. Puis, dans les paramètres de référence, cliquez sur créer une référence, puis sélectionnez la gestion des études. Pour ouvrir la boucle de scène préalable à la destruction.Cliquez maintenant sur processus cena pour générer un masque de contraste vert. Ensuite, sélectionnez charger dans 3D dans le logiciel d'imagerie par ultrasons. Puis, cliquez sur paramètres du mode, cliquez sur volume et sélectionnez parallèle.Ensuite, segmentez une série de contours afin de créer un volume 3D du tissu cible, puis cliquez sur « terminer » pour finaliser la segmentation. Pour utiliser la microscopie endoscopique confocale fibrée afin d’évaluer la morphologie de la vascularisation du bouchon de gel mimétique de la MEC, injectez 200 microlitres de dextran marqué FITC à 10 milligrammes par millilitre dans la veine caudale de chaque animal expérimental. Ensuite, pratiquez une petite incision située à environ un centimètre du bouchon et placez délicatement la sonde de microscopie endoscopique au-dessus du bouchon, tout en maintenant l’intégrité du bouchon.Une fois la sonde en place, utilisez la pédale pour appuyer sur démarrer le laser. Dès que la fluorescence apparaît à l'écran, appuyez sur sélectionner à l'aide de la pédale pour acquérir des courtes séquences allant jusqu'à 32e longues entre les films, rincez la pointe de la sonde dans un tube contenant de l'eau. Lorsque le tournage est terminé, nettoyez la pointe avec un coton-tige afin d'analyser le diamètre moyen des vaisseaux.Ensuite, cliquez sur « détecter les microvaisseaux » pour ouvrir la fenêtre du module de détection des vaisseaux, puis cliquez sur « préférences ». Assurez-vous que le diamètre moyen des vaisseaux dans les statistiques d'intérêt, ainsi que la fenêtre et l'affichage des barres d'histogramme dans le mode d'affichage, sont cochés.Cliquez sur détecter pour afficher les mesures sélectionnées. Afin d'analyser l'intensité du signal fluorescent dans les zones adjacentes aux vaisseaux sanguins, sélectionnez créer un ROI circulaire et dessinez un cercle dans la zone d'intérêt. Enfin, sélectionnez calculer l'histogramme dans le ROI pour obtenir les valeurs relatives à la région entourée.Ici, le recrutement étendu de vaisseaux sanguins fonctionnels au sein des implants chargés de milieu conditionné U 87 mg est révélé par l'imagerie échographique avec contraste à microbulles. En revanche, dans les implants contenant du milieu conditionné provenant de cellules générant des tumeurs dormantes, le flux sanguin est presque indétectable. La morphologie de ces vaisseaux sanguins nouvellement formés est davantage mise en évidence par la microscopie endoscopique confocale à fibre optique des vaisseaux après administration de dextran marqué par la fluorescéine (FITC), comme le montrent ces images représentatives ; notez comment les vaisseaux sanguins présents dans les implants chargés de milieu conditionné U 87 mg présentent une morphologie vasculaire agrandie, obtuse et typiquement perméable.Les vaisseaux sanguins élargis et fortement enchevêtrés présentent également un flux non continu et lent, et des fuites sanguines sont observées dans la zone environnante, comme en témoigne le signal fluorescent élevé visible à l'extérieur des vaisseaux sanguins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures à plusieurs points temporels afin d'optimiser la cinétique de l'angiogenèse.

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Un essai de formation de tube est utilisé pour évaluer l'activité vasculaire des cellules tumorales.

Un test basé sur Matrigel Tube Formation d&#39;évaluer l&#39;activité Vasculogenic de cellules tumorales

Nous décrivons une méthode d'imagerie de la réponse à un traitement...

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

Dans cet article, nous présentons une méthode pour analyser les microvaisseaux tumoraux in vivo en utilisant la fluorescence dynamique vidéomicroscopie de contraste amélioré. Deux paramètres quantitatifs ont été acquises: densité capillaire fonctionnelle réfléchissant la vascularisation de la tumeur, et les fuites d'index reflétant la perméabilité de la paroi endothéliale.

Dans l&#39;imagerie in vivo de angiogenèse tumorale en utilisant la fluorescence confocale vidéomicroscopie

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

En utilisant des souris rapporteures transgéniques et des marqueurs fluorescents injectables, la microscopie confocale à disque rotatif intravital à long terme permet de visualiser directement le comportement des cellules myéloïdes dans l’adénome intestinal dans le modèle de cancer colorectal ApcMin/+.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc Min / + Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Un modèle in vitro de la niche vasculaire de la moelle osseuse est établi en ensemençant des cellules mésenchymateuses et endothéliales sur des hydrogels PEG 3D préfabriqués. Les réseaux endothéliaux, les composants ECM et l’activité ALP des niches varient en fonction du facteur de croissance utilisé. La plateforme peut être utilisée pour des modèles avancés de cancer.

Mise en place simple d’une niche de moelle osseuse ostéogénique vascularisée à l’aide d’hydrogels de poly(éthylène glycol) (PEG) préfabriqués dans une microplaque d’imagerie

Ce protocole présente un modèle de tumeur sur puce physiologiquement pertinent pour effectuer des recherches fondamentales et translationnelles à haut débit sur le cancer humain, en faisant progresser le dépistage des médicaments, la modélisation des maladies et les approches de médecine personnalisée avec une description des procédures de chargement, d’entretien et d’évaluation.

Établissement d’un modèle physiologique de micro-tumeurs vascularisées humaines pour la recherche sur le cancer

Découvrez un test de plug de matrigel pour évaluer l'angiogenèse induite par les facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses chez la souris. Cette méthode combine échographie et endomicroscopie pour analyser la densité et la morphologie vasculaire.

Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide (Vidéo) | JoVE Journal

Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

Explorer plus de vidéos