Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

L’objectif général de l’expérience suivante est d’utiliser l’échographie et l’endomicroscopie pour illustrer le potentiel angiogénique d’un ensemble de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses. Ceci est réalisé en implantant d’abord un bouchon pour générer un environnement semblable à celui d’une tumeur chez la souris en l’absence de cellules tumorales. Ensuite, la densité des vaisseaux sanguins et le pourcentage de vaisseaux sanguins fonctionnels à l’intérieur du bouchon sont évalués.

Dans la dernière étape, la morphologie des vaisseaux sanguins est visualisée. En fin de compte, l’équilibre entre les facteurs pro et anti-angiogéniques sécrétés par les cellules et leurs effets sur l’angiogenèse peut être évalué de manière vitale et à divers moments par les deux modalités d’imagerie complémentaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le test conventionnel du matrigel plug est qu’elle permet l’analyse d’un pool de facteurs sécrétés par les cellules tout en utilisant des modalités d’imagerie intravitale complémentaires.

Pour utiliser l’échographie pour évaluer la matrice extracellulaire ou la localisation du bouchon de gel mimétique ECM, commencez par placer un tube einor de 1,5 millilitre contenant 80 microlitres de milieux conditionnés fraîchement préparés sur de la glace. La partie la plus délicate de la procédure est l’injection du gel sans bulles à l’aide d’embouts glacés. Un mélange doux et une injection lente assureront une administration optimale du gel.

Ensuite, à l’aide d’embouts glacés de 1000 microlitres, mélangez 600 microlitres de glace à quatre degrés Celsius pendant la nuit. ECM décongelé : mimer le gel dans le support en prenant soin de ne pas former de bulles. Après avoir confirmé la sédation par pincement des orteils, rasez l’abdomen de chaque souris et utilisez une seringue glacée d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 pour lentement par voie sous-cutanée.

Injecter le contenu d’un tube EEND DPH par animal. Une fois que tout le volume est administré, maintenez l’aiguille en place pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que la solidification se produise. Trois semaines plus tard, rasez à nouveau la région abdominale des souris, en enlevant tous les poils supplémentaires avec de la crème dépilatoire, puis fixez les souris en position couchée sur la platine du micromanipulateur.

Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30 avec du sérum physiologique. Placez ensuite l’aiguille à l’intérieur de la veine de la queue. Fixez fermement l’aiguille et desserrez la seringue.

Placez maintenant le transducteur au milieu de la zone de balayage souhaitée et cliquez sur 3D pour initialiser l’étage du moteur 3D. Cliquez sur 3D. Encore une fois, entrez la distance de balayage et la taille du pas, puis appuyez sur scan.

Vérifiez que l’intégralité de la prise a été numérisée dans les données d’image 3D affichées. Si ce n’est pas le cas, ajustez le transducteur de manière à ce que toute la prise soit visible et balayez à nouveau la zone comme nous venons de le démontrer. Ensuite, sélectionnez le contraste et ajustez la compensation de gain de temps ou les commandes tgc pour assombrir l’image, utilisez un mélangeur de flacons pour activer les microbulles pendant 45 secondes.

Mélangez ensuite 50 microlitres de microbulles avec 50 microlitres de solution saline dans une seringue d’un millilitre. Remplacez la seringue desserrée contenant du sérum physiologique par la seringue contenant les microbulles activées et injectez les microbulles diluées dans la veine de la queue de chaque souris. Attendez quelques secondes que les bulles atteignent un état stable, puis cliquez sur 3D et sélectionnez Analyser pour acquérir la 3D.

Images améliorées en contraste. Cliquez sur un magasin pour enregistrer les données de l’image, puis sélectionnez 3D et détruisez la 3D. Pour détruire les microbulles, cliquez à nouveau sur 3D et sélectionnez Scan pour acquérir une boucle cena post-destruction.

Cliquez ensuite à nouveau sur un magasin. Ensuite, dans les paramètres de référence, cliquez sur créer une référence, puis sélectionnez Gestion de l’étude. Pour ouvrir la boucle cena pré-destruction.

Cliquez maintenant sur le processus cena pour générer une superposition de contraste vert. Sélectionnez ensuite charger en 3D dans le logiciel d’imagerie par ultrasons. Ensuite, cliquez sur Paramètres de mode, Cliquez sur Volume et sélectionnez Parallèle.

Segmentez ensuite une série de contours pour créer un volume 3D du tissu cible et cliquez sur Terminer pour terminer la segmentation. Pour utiliser l’endomicroscopie confocale fibrée pour évaluer la morphologie vasculaire du bouchon de gel mimétique ECM, injectez 200 microlitres de 10 milligrammes par millilitre, ajustez le dextran marqué C dans la veine de la queue de chaque animal de laboratoire. Appliquez ensuite une petite incision à environ un centimètre du bouchon et placez doucement la sonde d’endomicroscopie sur le bouchon tout en gardant le bouchon intact.

Une fois la sonde en place, utilisez la pédale pour appuyer sur le bouton de démarrage du laser. Une fois que la fluorescence apparaît à l’écran, appuyez sur select avec la pédale pour acquérir des films courts jusqu’à 32 longs entre les films, lavez la pointe de la sonde dans un tube contenant de l’eau. Une fois le tournage terminé, nettoyez l’embout à l’aide d’un coton-tige pour analyser le diamètre moyen du vaisseau.

Ensuite, cliquez sur détecter les micro-récipients pour ouvrir la fenêtre du module de détection de récipients et cliquez sur préférences. Assurez-vous que le diamètre moyen du récipient dans la statistique d’intérêt. Les barres de fenêtre et d’histogramme d’affichage en mode d’affichage sont marquées.

Cliquez sur Détecter pour afficher les mesures sélectionnées. Afin d’analyser l’intensité du signal fluorescent dans les zones adjacentes aux vaisseaux sanguins, sélectionnez créer un cercle ROI et créez un cercle dans la zone d’intérêt. Enfin, sélectionnez Calculer l’histogramme dans ROI pour calculer les valeurs liées à la région encerclée.

Ici, le recrutement étendu de vaisseaux sanguins fonctionnels dans des bouchons moyennement chargés conditionnés à l’U 87 mg est révélé par l’imagerie par ultrasons améliorée par microbulles. À l’inverse, à l’intérieur des bouchons contenant du milieu conditionné à partir de cellules tumorales dormantes, le flux sanguin est presque indétectable. La morphologie de ces vaisseaux sanguins nouvellement formés est encore accentuée par l’endomicroscopie confocale fibreuse des vaisseaux après l’administration de fit c dextran, comme le démontrent ces images représentatives, notez comment les vaisseaux sanguins à l’intérieur des bouchons chargés avec le milieu conditionné à l’U 87 mg présentent une morphologie vasculaire élargie typique à l’extrémité émoussée.

Les vaisseaux sanguins élargis et très enchevêtrés présentent également un flux non continu et lent et une fuite de sang est observée dans la zone environnante, ainsi que par le signal fluorescent élevé évident à l’extérieur des vaisseaux sanguins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures à plusieurs points temporels pour optimiser la cinétique de l’angiogenèse.