Name: Comprendre organogenèse précoce aide dun simplifié In Situ Protocole hybridation in Xenopus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Apprenez une méthode simplifiée d'hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus laevis pour visualiser l'expression génique. Ce protocole accélère l'étude de la biologie du développement.

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Les auteurs tiennent à remercier les IRSC pour le soutien de Steve Deimling dans le cadre de leur bourse, ainsi que le Département de pédiatrie de l’Université Western Ontario pour son soutien à Steve Deimling, Rami Halabi et Stephanie Grover. Ces travaux ont été financés par le R2654A11 de subventions du CRSNG et un supplément d’accélération à la découverte du CRSNG

<ol><li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li>
<li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor%2C+p27Xic1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
<li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li>
<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li>
<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+%28Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li>
<li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li>
<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.

La possibilité d&#39;utiliser l&#39;hybridation in situ de visualiser le profil d&#39;expression de gènes spécifiques reste le procédé le plus couramment utilisé pour identifier des organes spécifiques ou des types de cellules dans l&#39;embryon de Xenopus. Ce est en raison de plusieurs avantages offerts par cette technique. L&#39;expression d&#39;un gène peut identifier des structures spécifiques bien avant tout signe histologique de différenciation comme le cas pour l&#39;expression de Nkx2.5</em...

Le profil d’expression d’un gène spécifique est une information importante pour déterminer le rôle potentiel de ce gène dans le développement d’un organe ou d’un type de cellule spécifique. En termes simples, s’il n’est pas exprimé au bon moment et au bon endroit, il est peu probable qu’il joue un rôle clé. Chez le xénope, comme chez la plupart des embryons précoces, le test le plus couramment utilisé pour détecter l’expression d’un gène est l’hybridation in situ en monticule entier à l’aide de sondes d’ARN antisens marquées. L’utilisation de la coloration des anticorps pour évaluer l’expression d’un gène chez le xénope devient de plus en plus courante à mesure que les chercheurs découvrent des anticorps, généralement élevés contre des protéines de mammifères, qui réagissent de manière croisée à l’homologue du xénope ou génèrent leur propre 1-3. Cependant, la grande majorité des études sur l’organogenèse du xénope utilisent encore des sondes d’ARN antisens. Lorsque des anticorps sont utilisés, chaque anticorps individuel nécessite souvent une optimisation pour la concentration ou les protocoles de fixation de l’anticorps primaire. En revanche, le protocole pour les hybridations in situ est essentiellement invariant pour différentes sondes. Le concept de base est relativement simple et un excellent protocole standard a été bien établi 4. Notre protocole est une version simplifiée du protocole original 4 qui offre toujours une excellente détection des modèles d’expression génique dans l’embryon précoce. Les embryons sont fixés puis préparés pour l’hybridation en modifiant les solutions et les températures de sorte qu’il permet une liaison à haute rigueur de la sonde d’ARN antisens marquée à son ARNm cible. La sonde non liée est emportée et les embryons sont ensuite préparés pour la liaison d’un anticorps contre l’étiquette sur les sondes d’ARN. L’excès d’anticorps est ensuite éliminé et une réaction enzymatique de couleur est utilisée pour localiser l’endroit où la sonde d’ARN est liée dans l’embryon. Il existe maintenant un certain nombre de lignées transgéniques de Xenopus qui déterminent l’expression de protéines fluorescentes dans des tissus spécifiques et celles-ci sont disponibles dans les centres de stockage de Xénope tels que la National Xenopus Resource à Woods Hole. Bien que très utile pour de nombreuses expériences nécessitant d’examiner l’organogenèse chez les embryons vivants, cette option nécessite un logement séparé pour les lignées transgéniques. 
L’hybridation in situ permet de délimiter clairement l’endroit où des organes ou des types de cellules spécifiques se formeront au début de l’embryon (Figure 1). La technique est remarquablement sensible étant donné que l’on peut détecter l’expression génique dans un petit nombre de cellules d’un seul embryon 5. Cependant, l’hybridation in situ en utilisant l’intensité de la coloration colorimétrique n’est pas considérée comme quantifiable car la réaction de couleur n’est pas linéaire. Malgré la difficulté de quantifier l’intensité de la coloration, les changements d’expression sont souvent assez perceptibles ; en particulier lorsque l’hybridation in situ montre des augmentations ou des diminutions quantifiables de la taille des domaines d’expression 6,7. 
Les avantages évidents de l’hybridation in situ en monture entière en font un test essentiel dans l’étude du développement précoce. Cependant, il s’agit d’une tâche chronophage qui nécessite de nombreuses étapes sur plusieurs jours. Ce protocole est une version simplifiée du protocole standard qui élimine plusieurs étapes sans réduire la qualité du résultat in situ. La simplification élimine également les sources de variabilité, ce qui facilite le dépannage si une hybridation in situ n’est pas optimale. Plus précisément, nous avons éliminé l’utilisation des traitements à base de protéinase K et d’ARNASE de l’embryon, deux étapes qui peuvent dépendre de la qualité du réactif et peuvent également réduire l’intensité du signal en cas d’exagération. Le protocole permet également de réaliser une certaine économie en éliminant l’utilisation de plusieurs réactifs. Enfin, ce protocole fournit également quelques lignes directrices simples pour améliorer la capture d’images des résultats d’hybridation in situ. Bien que ce protocole soit optimisé pour le travail sur les embryons de xénope, il est probable qu’au moins certaines des simplifications seront applicables aux travaux d’hybridation in situ dans d’autres systèmes embryonnaires.

<table><tbody><tr><td>Labguake Tube Shakers</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>Flacons VWR</td><td>VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucléoside Triphosphate Set, 100mM</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigénine-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la Rnase (Rnase OUT)</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>ARN polymérase T7</td><td>Fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>ARN polymérase T3</td><td>Fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 ARN polymérase</td><td>Fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de mouton</td><td> Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>Réactif bloquant</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM violet Ap Substrat</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigénine-Ap Feb fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp ;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp ;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Vadrouilles</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>&nbsp ; VWR&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>CAFX0420-4&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>ARN</td><td>Roche</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>Acide Maléique</td><td>&nbsp ; VWR&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (solution à 30 %)</td><td>EM&nbsp ;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Alcool benzylique</td><td>Sigma</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl Benzoate</td><td>Sigma</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ultrapure&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>Référence 16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>

comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; in situ</em&gt; protocole hybridation in<em&gt; xenopus</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

L’organogenèse est l’étude de la façon dont les organes sont spécifiés et acquièrent ensuite leur forme et leurs fonctions spécifiques au cours du développement. L’embryon de Xenopuslaevis est très utile pour l’étude de l’organogenèse car sa grande taille le rend très approprié pour identifier les organes dès les premières étapes de l’organogenèse. À l’heure actuelle, la principale méthode utilisée pour identifier un organe ou un primordium spécifique est l’hybridation in situ sur monture entière avec des sondes d’ARN antisens marquées spécifiques à un gène exprimé dans l’organe d’intérêt. De plus, il est relativement facile de manipuler des gènes ou des voies de signalisation chez le xénope et l’hybridation in situ permet ensuite de rechercher des changements dans la présence ou la morphologie d’un organe cible. L’hybridation in situ de l’ensemble du mont est un protocole de plusieurs jours comportant de nombreuses étapes. Ici, nous fournissons un protocole simplifié avec un nombre réduit d’étapes et de réactifs utilisés qui fonctionne bien pour les tests de routine. Les robots d’hybridation in situ ont grandement facilité le processus et nous détaillons comment et quand nous utilisons cette technologie dans le processus. Une fois l’hybridation in situ terminée, capturer la meilleure image du résultat peut s’avérer frustrant. Nous fournissons des conseils sur la façon d’optimiser l’imagerie des résultats d’hybridation in situ. Bien que le protocole décrive l’évaluation de l’organogenèse chez Xenopus laevis, le même protocole de base peut presque certainement être adapté à Xenopus tropicalis et à d’autres systèmes modèles.

L&#39;utilisation de sondes spécifiques de tissus peut fournir des informations en circulation en ce qui concerne l&#39;état de développement des organes spécifiques. Dans les exemples suivants, l&#39;étape de l&#39;embryon est basée sur la table de transfert Nieuwkoop et Faber 11. Si l&#39;on utilise des sondes de gènes exprimés forme après différenciation, la troponine I cardiaque au stade 28-30, par exemple (figure 1C), la présence ou la taille d&#39;un organe différencié peut êtr...

L’embryon de Xenopus laevis continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude du développement précoce en raison de sa grande taille et de sa facilité de manipulation. Un protocole simplifié pour l’hybridation in situ de l’ensemble du mont est fourni qui peut être utilisé dans l’identification d’organes spécifiques dans ce système modèle.

Comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de montrer où un gène particulier est exprimé dans un embryon intact. Cela est réalisé en fixant l'ARN sur place dans l'embryon lors d'une deuxième étape. Une sonde d'ARN antisens spécifique au gène d'intérêt est hybridée à l'ARN cible à l'intérieur de l'embryon.Cette sonde contient un épitope, généralement de la digogénine, qui peut ensuite être détecté. Ensuite, un anticorps couplé à la phosphatase alcaline est hybridé à l'épitope sur la sonde d'ARN, suivi de l'utilisation d'une coloration chromogénique. Afin de visualiser la localisation de l'ARN dans l'embryon, des résultats sont obtenus montrant précisément où le gène d'intérêt est exprimé, en fonction de la réaction colorée et des connaissances relatives à l'anatomie de l'embryon.Le principal avantage de notre protocole par rapport aux protocoles existants réside dans sa rapidité et son utilisation de moins de réactifs, sans perte apparente de qualité. Cette méthode permet de répondre à des questions fondamentales en embryologie, telles que la manière dont les tissus sont spécifiés et organisés. Bien que cette méthode puisse éclairer le développement de l'opus, elle peut également être utilisée pour de nombreux autres petits embryons, comme les embryons de poisson-zèbre et les embryons précoces de souris.Nous avons commencé à développer ces méthodes parce que les méthodes initiales prenaient beaucoup de temps, et nous avons commencé à expérimenter l’omission d’étapes Ed afin d’augmenter l’efficacité du protocole sans compromettre la qualité. La fixation des embryons est réalisée par étapes. Préparez d’abord les flacons en verre qui seront utilisés pour toutes les étapes, y compris le stockage final des embryons, afin de permettre la surveillance des embryons durant toutes les phases du processus.Utilisez des flacons transparents munis d'un bon joint en téflon dans le couvercle et étiquetez les flacons avec les informations expérimentales appropriées à l'aide d'un marqueur indélébile. Recouvrez l'étiquette d'un ruban adhésif transparent afin d'éviter la perte de l'identification au cours de la procédure. En raison de l'utilisation d'alcools et d'autres solvants, préparez la solution de fixation MFA comme décrit dans le texte du protocole.Remplir chaque flacon en verre étiqueté avec trois à quatre millilitres de la solution MFA. Conserver une solution de méthanol à 100 % à moins 20 degrés Celsius. Préparer une pipette en verre coupée et l'utiliser pour transférer les embryons dans les flacons en verre contenant la solution Memphis destinée à la fixation.Ajoutez les embryons en transférant un minimum de liquide du milieu d'embryons. Fixez au maximum 20 à 30 embryons par flacon. Laissez les embryons dans la solution de Memphis pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur.À l'issue de la fixation par l'aldéhyde paraformique, remplacer la solution Memphis par environ quatre millilitres de méthanol à 100 % à moins 20 degrés Celsius pour le stockage des embryons avant la mise en place de la réaction de synthèse de la sonde. Laisser le mélange d'eau ADN NTP et le tampon polymérase atteindre la température ambiante. L'une des étapes les plus critiques pour la réussite de cette procédure consiste à assembler correctement la réaction de sonde.Assemblez la réaction de synthèse de la sonde à température ambiante. Ajoutez les composants suivants, dans cet ordre, à un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre : ADN matrice, eau ajustée à un volume permettant d'obtenir un volume total de réaction de 20 microlitres, mélange de NTP, inhibiteur d'ARN, tampon de l'ARN polymérase et ARN polymérase. Incubez la réaction de transcription pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Des incubations légèrement plus longues que deux heures n'ont aucun effet indésirable, mais ne montrent également que peu d'augmentation du rendement. Si l'incubation dure une heure, le rendement sera réduit, bien qu'encore suffisant pour obtenir une bonne sonde. Une fois la réaction de transcription terminée, prélever un microlitre du mélange réactionnel pour vérification sur un gel d'agarose 1 % en tampon TAE, puis ajouter au mélange réactionnel restant.Ajouter 80 microlitres de SDS à 1 % dans un tampon TE, 10 microlitres d'acétate d'ammonium à cinq molaire et 220 microlitres d'éthanol froid. Vortexer vigoureusement le mélange et le mettre de côté sur de la glace jusqu'à obtention des résultats du contrôle de qualité de l'ARN. Après avoir ajouté de l'eau et un colorant de charge standard au microlitre d'ARN prélevé avant la précipitation, faire migrer l'ARN sur un gel d'agarose à 1 % dans du tampon TAE contenant du bromure d'AUM.Visualisez l'ARN marqué au bromure d'athérium sur le gel en utilisant un transilluminateur UV afin de vérifier la qualité de la sonde. Une seule bande, sans traînée au-dessus ou en dessous, doit être observée. Une fois la qualité de l'ARN vérifiée, précipitez l'ARN restant mis de côté sur de la glace en centrifugeant dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10 à 15 minutes.Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre affinée et laisser sécher brièvement l’ARN. Ensuite, le sonde est remise en suspension dans un tampon d’hybridation d’ARN et conservée dans un tube en polystyrène de 15 millilitres à vis à une température de moins 20 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, récupérer les embryons qui ont été stockés dans du méthanol à moins 20 degrés Celsius et les laisser atteindre la température ambiante.Toute la procédure est réalisée dans des vials en verre. Si différents embryons d'un même groupe doivent être examinés avec des sondes différentes, conservez-les dans un seul vial jusqu'immédiatement avant l'ajout des sondes. Afin de réduire la variabilité et la charge de travail le premier jour, en préparation de l'ajout de la sonde, réhydratez les embryons à l'aide d'une série de méthanol comme indiqué dans ce tableau, en utilisant des pipettes en verre pour retirer et ajouter chaque solution avec précaution, car les embryons peuvent être facilement endommagés durant cette étape.Lors du transfert des liquides, vérifiez l'intérieur des bouchons pour vous assurer que les embryons n'y sont pas piégés. Agitez doucement les embryons après chaque changement afin de garantir qu'ils n'adhèrent ni aux parois ni entre eux. Faites osciller les embryons en fixant les flacons sur un agitateur rotatif ; avant utilisation, l'hybridation de l'ARN, le tampon d'hybridation et la sonde doivent être préchauffés à 65 degrés Celsius.Hybrider les embryons dans la solution de sonde pendant la nuit avec agitation à 65 degrés Celsius le jour suivant. Retirer la solution de sonde et la conserver dans un tube en polystyrène de 15 millilitres à bouchon vissable, marqué avec la date et le nombre de fois que la sonde a été utilisée. Conserver la solution de sonde à moins 20 degrés Celsius.Une fois la sonde retirée, préparer les embryons pour la coloration immunohistochimique dirigée contre la sonde au moyen d'une série de lavages comme décrit ici, en modifiant la température selon les besoins en déplaçant le mutateur avec les vials d'embryons directement dans des fours d'hybridation réglés à la température appropriée. Pendant l'incubation des embryons dans la solution de blocage, préparer le volume adéquat de solution de blocage additionnée d'anticorps anti-DIG afin que l'anticorps soit bloqué avant son ajout aux embryons. Incuber les embryons dans la solution d'anticorps toute la nuit avec agitation à quatre degrés Celsius le jour suivant.Éliminer la solution d'anticorps et rincer avec du mab, une solution contenant de l'acide maléique et du chlorure de sodium. Effectuer au moins 12 lavages de 30 minutes à température ambiante sous agitation. Remplacer la dernière solution de lavage par le substrat de la phosphatase alcaline.Réaliser la réaction de coloration à température ambiante avec agitation pendant la nuit, le jour suivant. Arrêter la réaction de coloration et préparer les embryons pour le stockage et l'observation en changeant les liquides selon les indications de ce tableau. Après réhydratation des embryons, fixer la coloration avec du MFA pendant 30 minutes.Une fois fixés, retirez le MFA et lavez les embryons avec du méthanol à 25 %. Si la suppression du pigment endogène est nécessaire, éliminez le méthanol à 25 % et ajoutez la solution de blanchiment. Surveillez attentivement le blanchiment, car il se produit relativement rapidement, et le degré de blanchiment peut être ajusté pour obtenir différents effets.Pour le stockage à long terme, déshydrater les embryons par une série de méthanol jusqu'à 100 % de méthanol après le blanchiment pour le stockage à court terme et l'imagerie ultérieure ; transférer ensuite les embryons dans du PBS. Les embryons non clarifiés sont mieux observés et imagés sur un fond d'aros à 1 %. Pour préparer la solution d'aros, ajouter l'aros à l'eau et porter à ébullition jusqu'à dissolution complète de l'aros. Une fois que l'aros a refroidi à 50 degrés Celsius, le verser dans une boîte de Pétri sur une profondeur d'environ deux millimètres.Lorsque la boîte de Pétri contenant l'aros est prête, placez-y les embryons non décolorés et procédez à l'acquisition d'images. L'aros confère un fond gris-bleu qui contraste bien avec l'embryon et la couleur bleue de la réaction de marquage. Il aide également à diffuser les ombres et reflets gênants qui détournent l'attention de l'embryon, permettant ainsi d'obtenir une image de l'embryon sous des angles alternatifs, par exemple depuis le côté ventral.Utilisez des pinces fines pour effectuer des incisions dans les aros afin d'ajuster l'embryon. Placez les embryons dans ces canaux pour les orienter. Manipulez les embryons avec précaution car ils sont facilement endommagés.Utilisez une source lumineuse à fibre optique pour éclairer l'embryon selon un angle faible, créant ainsi des ombres sur l'embryon qui confèrent de la profondeur à l'image et aident à distinguer les structures de surface, car le blanchiment peut éliminer les pigments fournissant des repères utiles. Utilisez le cadrage en ombres pour les embryons fortement blanchis. Les embryons clarifiés sont utilisés pour visualiser des colorations situées en profondeur dans l'embryon, comme dans la corde dorsale, le poumon ou certaines régions du cerveau.Dans ce protocole, différents niveaux de décoloration sont utilisés pour visualiser la coloration dans l'embryon. Si la coloration est intense, une décoloration plus légère qui conserve une partie de la pigmentation permet un meilleur étalement et un meilleur repérage de l'embryon. Toutefois, si la coloration se trouve dans une zone présentant un taux élevé de pigmentation, comme le rein, une décoloration plus poussée donne de meilleurs résultats.La manipulation de la base ARO peut aider à l'orientation de l'embryon. Par exemple, en découpant un fin canal dans les aros, un embryon au stade de têtard qui repose sur le côté peut être observé depuis le côté ventral avec une stabilité suffisante pour obtenir une bonne image. Cet embryon a été placé dans un petit trou qui stabilisait sa position avec le côté ventral vers le haut, permettant ainsi une visualisation complète du profil d'expression du gène d'intérêt.Les organes internes peuvent être observés dans des embryons non clarifiés et clarifiés, dans un embryon opaque non clarifié coloré pour PAX deux. Au stade 34, le pédoncule optique ainsi que le tube neural peuvent être visualisés. Toutefois, les détails ne sont pas nets. En clarifiant l'embryon, les limites des sites d'expression, y compris celles du pédoncule optique, deviennent plus nettes.Le degré de clarification est indiqué par la capacité à voir les deux yeux de cet embryon. Toutefois, un problème courant avec les embryons clarifiés est l’accumulation de coloration dans les cavités internes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer rapidement une hybridation in situ en montage entier en utilisant moins de réactifs et de capturer des images de haute qualité.

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