Comprendre organogenèse précoce aide d'un simplifié

L'objectif général de l'expérience suivante est de montrer où un gène particulier est exprimé dans un embryon intact. Cela est réalisé en fixant l'ARN sur place dans l'embryon lors d'une deuxième étape. Une sonde d'ARN antisens spécifique au gène d'intérêt est hybridée à l'ARN cible à l'intérieur de l'embryon.

Cette sonde contient un épitope, généralement de la digogénine, qui peut ensuite être détecté. Ensuite, un anticorps couplé à la phosphatase alcaline est hybridé à l'épitope sur la sonde d'ARN, suivi de l'utilisation d'une coloration chromogénique. Afin de visualiser la localisation de l'ARN dans l'embryon, des résultats sont obtenus montrant précisément où le gène d'intérêt est exprimé, en fonction de la réaction colorée et des connaissances relatives à l'anatomie de l'embryon.

Le principal avantage de notre protocole par rapport aux protocoles existants réside dans sa rapidité et son utilisation de moins de réactifs, sans perte apparente de qualité. Cette méthode permet de répondre à des questions fondamentales en embryologie, telles que la manière dont les tissus sont spécifiés et organisés. Bien que cette méthode puisse éclairer le développement de l'opus, elle peut également être utilisée pour de nombreux autres petits embryons, comme les embryons de poisson-zèbre et les embryons précoces de souris.

Nous avons commencé à développer ces méthodes parce que les méthodes initiales prenaient beaucoup de temps, et nous avons commencé à expérimenter l’omission d’étapes Ed afin d’augmenter l’efficacité du protocole sans compromettre la qualité. La fixation des embryons est réalisée par étapes. Préparez d’abord les flacons en verre qui seront utilisés pour toutes les étapes, y compris le stockage final des embryons, afin de permettre la surveillance des embryons durant toutes les phases du processus.

Utilisez des flacons transparents munis d'un bon joint en téflon dans le couvercle et étiquetez les flacons avec les informations expérimentales appropriées à l'aide d'un marqueur indélébile. Recouvrez l'étiquette d'un ruban adhésif transparent afin d'éviter la perte de l'identification au cours de la procédure. En raison de l'utilisation d'alcools et d'autres solvants, préparez la solution de fixation MFA comme décrit dans le texte du protocole.

Remplir chaque flacon en verre étiqueté avec trois à quatre millilitres de la solution MFA. Conserver une solution de méthanol à 100 % à moins 20 degrés Celsius. Préparer une pipette en verre coupée et l'utiliser pour transférer les embryons dans les flacons en verre contenant la solution Memphis destinée à la fixation.

Ajoutez les embryons en transférant un minimum de liquide du milieu d'embryons. Fixez au maximum 20 à 30 embryons par flacon. Laissez les embryons dans la solution de Memphis pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur.

À l'issue de la fixation par l'aldéhyde paraformique, remplacer la solution Memphis par environ quatre millilitres de méthanol à 100 % à moins 20 degrés Celsius pour le stockage des embryons avant la mise en place de la réaction de synthèse de la sonde. Laisser le mélange d'eau ADN NTP et le tampon polymérase atteindre la température ambiante. L'une des étapes les plus critiques pour la réussite de cette procédure consiste à assembler correctement la réaction de sonde.

Assemblez la réaction de synthèse de la sonde à température ambiante. Ajoutez les composants suivants, dans cet ordre, à un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre : ADN matrice, eau ajustée à un volume permettant d'obtenir un volume total de réaction de 20 microlitres, mélange de NTP, inhibiteur d'ARN, tampon de l'ARN polymérase et ARN polymérase. Incubez la réaction de transcription pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Des incubations légèrement plus longues que deux heures n'ont aucun effet indésirable, mais ne montrent également que peu d'augmentation du rendement. Si l'incubation dure une heure, le rendement sera réduit, bien qu'encore suffisant pour obtenir une bonne sonde. Une fois la réaction de transcription terminée, prélever un microlitre du mélange réactionnel pour vérification sur un gel d'agarose 1 % en tampon TAE, puis ajouter au mélange réactionnel restant.

Ajouter 80 microlitres de SDS à 1 % dans un tampon TE, 10 microlitres d'acétate d'ammonium à cinq molaire et 220 microlitres d'éthanol froid. Vortexer vigoureusement le mélange et le mettre de côté sur de la glace jusqu'à obtention des résultats du contrôle de qualité de l'ARN. Après avoir ajouté de l'eau et un colorant de charge standard au microlitre d'ARN prélevé avant la précipitation, faire migrer l'ARN sur un gel d'agarose à 1 % dans du tampon TAE contenant du bromure d'AUM.

Visualisez l'ARN marqué au bromure d'athérium sur le gel en utilisant un transilluminateur UV afin de vérifier la qualité de la sonde. Une seule bande, sans traînée au-dessus ou en dessous, doit être observée. Une fois la qualité de l'ARN vérifiée, précipitez l'ARN restant mis de côté sur de la glace en centrifugeant dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10 à 15 minutes.

Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre affinée et laisser sécher brièvement l’ARN. Ensuite, le sonde est remise en suspension dans un tampon d’hybridation d’ARN et conservée dans un tube en polystyrène de 15 millilitres à vis à une température de moins 20 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, récupérer les embryons qui ont été stockés dans du méthanol à moins 20 degrés Celsius et les laisser atteindre la température ambiante.

Toute la procédure est réalisée dans des vials en verre. Si différents embryons d'un même groupe doivent être examinés avec des sondes différentes, conservez-les dans un seul vial jusqu'immédiatement avant l'ajout des sondes. Afin de réduire la variabilité et la charge de travail le premier jour, en préparation de l'ajout de la sonde, réhydratez les embryons à l'aide d'une série de méthanol comme indiqué dans ce tableau, en utilisant des pipettes en verre pour retirer et ajouter chaque solution avec précaution, car les embryons peuvent être facilement endommagés durant cette étape.

Lors du transfert des liquides, vérifiez l'intérieur des bouchons pour vous assurer que les embryons n'y sont pas piégés. Agitez doucement les embryons après chaque changement afin de garantir qu'ils n'adhèrent ni aux parois ni entre eux. Faites osciller les embryons en fixant les flacons sur un agitateur rotatif ; avant utilisation, l'hybridation de l'ARN, le tampon d'hybridation et la sonde doivent être préchauffés à 65 degrés Celsius.

Hybrider les embryons dans la solution de sonde pendant la nuit avec agitation à 65 degrés Celsius le jour suivant. Retirer la solution de sonde et la conserver dans un tube en polystyrène de 15 millilitres à bouchon vissable, marqué avec la date et le nombre de fois que la sonde a été utilisée. Conserver la solution de sonde à moins 20 degrés Celsius.

Une fois la sonde retirée, préparer les embryons pour la coloration immunohistochimique dirigée contre la sonde au moyen d'une série de lavages comme décrit ici, en modifiant la température selon les besoins en déplaçant le mutateur avec les vials d'embryons directement dans des fours d'hybridation réglés à la température appropriée. Pendant l'incubation des embryons dans la solution de blocage, préparer le volume adéquat de solution de blocage additionnée d'anticorps anti-DIG afin que l'anticorps soit bloqué avant son ajout aux embryons. Incuber les embryons dans la solution d'anticorps toute la nuit avec agitation à quatre degrés Celsius le jour suivant.

Éliminer la solution d'anticorps et rincer avec du mab, une solution contenant de l'acide maléique et du chlorure de sodium. Effectuer au moins 12 lavages de 30 minutes à température ambiante sous agitation. Remplacer la dernière solution de lavage par le substrat de la phosphatase alcaline.

Réaliser la réaction de coloration à température ambiante avec agitation pendant la nuit, le jour suivant. Arrêter la réaction de coloration et préparer les embryons pour le stockage et l'observation en changeant les liquides selon les indications de ce tableau. Après réhydratation des embryons, fixer la coloration avec du MFA pendant 30 minutes.

Une fois fixés, retirez le MFA et lavez les embryons avec du méthanol à 25 %. Si la suppression du pigment endogène est nécessaire, éliminez le méthanol à 25 % et ajoutez la solution de blanchiment. Surveillez attentivement le blanchiment, car il se produit relativement rapidement, et le degré de blanchiment peut être ajusté pour obtenir différents effets.

Pour le stockage à long terme, déshydrater les embryons par une série de méthanol jusqu'à 100 % de méthanol après le blanchiment pour le stockage à court terme et l'imagerie ultérieure ; transférer ensuite les embryons dans du PBS. Les embryons non clarifiés sont mieux observés et imagés sur un fond d'aros à 1 %. Pour préparer la solution d'aros, ajouter l'aros à l'eau et porter à ébullition jusqu'à dissolution complète de l'aros. Une fois que l'aros a refroidi à 50 degrés Celsius, le verser dans une boîte de Pétri sur une profondeur d'environ deux millimètres.

Lorsque la boîte de Pétri contenant l'aros est prête, placez-y les embryons non décolorés et procédez à l'acquisition d'images. L'aros confère un fond gris-bleu qui contraste bien avec l'embryon et la couleur bleue de la réaction de marquage. Il aide également à diffuser les ombres et reflets gênants qui détournent l'attention de l'embryon, permettant ainsi d'obtenir une image de l'embryon sous des angles alternatifs, par exemple depuis le côté ventral.

Utilisez des pinces fines pour effectuer des incisions dans les aros afin d'ajuster l'embryon. Placez les embryons dans ces canaux pour les orienter. Manipulez les embryons avec précaution car ils sont facilement endommagés.

Utilisez une source lumineuse à fibre optique pour éclairer l'embryon selon un angle faible, créant ainsi des ombres sur l'embryon qui confèrent de la profondeur à l'image et aident à distinguer les structures de surface, car le blanchiment peut éliminer les pigments fournissant des repères utiles. Utilisez le cadrage en ombres pour les embryons fortement blanchis. Les embryons clarifiés sont utilisés pour visualiser des colorations situées en profondeur dans l'embryon, comme dans la corde dorsale, le poumon ou certaines régions du cerveau.

Dans ce protocole, différents niveaux de décoloration sont utilisés pour visualiser la coloration dans l'embryon. Si la coloration est intense, une décoloration plus légère qui conserve une partie de la pigmentation permet un meilleur étalement et un meilleur repérage de l'embryon. Toutefois, si la coloration se trouve dans une zone présentant un taux élevé de pigmentation, comme le rein, une décoloration plus poussée donne de meilleurs résultats.

La manipulation de la base ARO peut aider à l'orientation de l'embryon. Par exemple, en découpant un fin canal dans les aros, un embryon au stade de têtard qui repose sur le côté peut être observé depuis le côté ventral avec une stabilité suffisante pour obtenir une bonne image. Cet embryon a été placé dans un petit trou qui stabilisait sa position avec le côté ventral vers le haut, permettant ainsi une visualisation complète du profil d'expression du gène d'intérêt.

Les organes internes peuvent être observés dans des embryons non clarifiés et clarifiés, dans un embryon opaque non clarifié coloré pour PAX deux. Au stade 34, le pédoncule optique ainsi que le tube neural peuvent être visualisés. Toutefois, les détails ne sont pas nets. En clarifiant l'embryon, les limites des sites d'expression, y compris celles du pédoncule optique, deviennent plus nettes.

Le degré de clarification est indiqué par la capacité à voir les deux yeux de cet embryon. Toutefois, un problème courant avec les embryons clarifiés est l’accumulation de coloration dans les cavités internes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer rapidement une hybridation in situ en montage entier en utilisant moins de réactifs et de capturer des images de haute qualité.