Name: Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans des embryons de poissons zèbres. Cette technique permet de visualiser l'activité des récepteurs aux œstrogènes dans des larves vivantes.

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Nous remercions Susan Farmer et le personnel du centre de recherche de poisson zèbre UAB pour les soins du poisson zèbre. Le financement fourni par les fonds de démarrage du Département de pharmacologie et de toxicologie.

NOTE: Ce protocole a été approuvé par l&#39;Université de l&#39;Alabama à comité de protection et d&#39;utilisation des animaux Birmingham. 1. Élevage de poisson zèbre et collections d&#39;œufs <ol><li> Trois jours avant le début de l&#39;exposition aux produits chimiques, assembler bassins d&#39;élevage avec séparateurs à mâles et femelles séparés. Remplir chaque mi-chemin du réservoir avec de l&#39;eau du système de l&#39;aquaculture. L&#39;utilisation d&#39;un filet, transférer Tg (5xERE: GFP) poissons c262/c262 de bassins d&#39;élevage, en plaçant 2 mâles et 3 femelles dans chaque réservoir séparé par un diviseur. Placez un couvercle sur chaque réservoir et l&#39;étiquette avec la date et les souches à franchir. </li><li> Le lendemain matin, enlever tous les obstacles et de l&#39;inclinaison des déflecteurs pour créer une zone peu profonde à une extrémité de l&#39;aquarium de reproduction. Laisser le poisson zèbre pour s&#39;accoupler, la collecte des embryons à des intervalles de 10 min pour assurer la mise en scène de développement précis. Œufs propres par rinçage à travers une passoire à thé en utilisant un milieu E3B et rincer délicatement les embryons dans des boîtes de Pétri. Retour de poissons adultes à permanenteles réservoirs. </li><li> En utilisant un microscope de dissection, trier, compter, et enlever les embryons non fécondés, anormales ou endommagées. La place des embryons dans des boîtes de Pétri en milieu E3B et maison à 28,5 ° C avec une lumière 14h10: cycle d&#39;obscurité. densité de l&#39;embryon peut affecter le développement. Ne placez pas plus de 100 embryons dans une boîte de 100 mm x 35 et pas plus de 50 embryons dans une boîte de 60 mm x 15. </li><li> En 24 HPF, remplacer le support avec E3B contenant 200 uM 1-phényl 2-thiourée (PTU). PTU empêche la formation de pigment et conserve les embryons de poisson zèbre et de larves transparentes pour une clarté d&#39;image. ATTENTION: concentré PTU boursier est dangereux; porter des gants lors de la solution E3B + PTU. </li><li> A après la fécondation 1 jour (DPF), supprimer manuellement le chorion de l&#39;embryon à l&#39;aide de pinces fines. Le chorion ne semble pas affecter la pénétration des oestrogènes, mais la suppression améliore la clarté d&#39;image. Il n&#39;est pas nécessaire de retirer chorions des médias. NOTE: Comme alternative à dechorionation manuel, des lots d&#39;embryons peuvent être Chemiquement dechorionated en utilisant 1 mg / ml de pronase traitement, comme décrit précédemment 11. </li></ol> 2. Traitement chimique des embryons <ol><li> Le jour avant le traitement, la préparation des solutions mères de chaque produit chimique à une concentration 1000 fois dans du DMSO (ou solvant approprié). Par exemple, pour exposer les embryons à 10 uM bisphénol A (BPA), préparer une solution stock mM BPA de 10 à 100% de DMSO. Ceci assure la concentration de DMSO dans chaque traitement uniforme et permet une non-toxique 1:1000 dilution de DMSO pour servir de contrôle du véhicule. Solutions magasin de stock à -20 ° C. Pour ce protocole, les embryons seront exposés à 1 pM et 10 pM BPA, 18,5 nM et 1,85 uM génistéine, 367 nM d&#39;estradiol (contrôle positif) et véhicule (0,1% de DMSO, témoin négatif). ATTENTION: Les produits chimiques comme le BPA et l&#39;estradiol sont dangereux et peuvent avoir des effets néfastes sur le fœtus humain. Poignée perturbateurs endocriniens avec soin et toujours utiliser un équipement de protection individuelle approprié.</li><li> Le jour du traitement, d&#39;dégel préparé des solutions chimiques. Diluer 1:1000 par pipetage 1 ml E3B + PTU dans un tube de 1,5 ml et en ajoutant 1 pl de solution stock chimique. Vortex vigoureusement. Diluer DMSO 1:1000 dans E3B + PTU comme un contrôle de véhicule. Utilisez 1 ml E3B + PTU dans un tube de centrifugation de 1,5 ml comme un témoin non traité. </li><li> En utilisant un grand pipette de transfert en plastique de l&#39;alésage, de transfert d&#39;embryons à partir des boîtes de Pétri dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits, 3 embryons par puits, 3 puits par condition. Pour éviter l&#39;évaporation au cours du traitement prolongé, omettre embryons de lignes extérieures et les colonnes de la plaque (lignes A et E, les colonnes 1 et 12). Puits extérieurs peuvent être remplis avec 300 pl de E3B + PTU. Etiqueter le couvercle de la plaque de manière appropriée. </li><li> Retirez le support de chaque puits avec une fine pointe de transfert en plastique pipette. Travaillez rapidement pour éviter le dessèchement des embryons. </li><li> Ajouter 200 ul de solution de traitement dans le puits correspondant. Placer le couvercle underneath la plaque en tant que guide pour assurer l&#39;addition de traitements dans les puits appropriés. Vortex chaque tube avant pipetage pour distribuer le produit chimique en solution. Confirmer visuellement chaque embryon est dans la solution de traitement. Si les embryons sont sur le côté du puits, utiliser une pipette de transfert propre à les laver dans le puits avec la solution de traitement. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 28,5 ° C. Les embryons seront analysés pour la fluorescence à 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging des embryons en plaques à 96 puits <ol><li> Anesthésier les embryons en ajoutant 10 ul de 4 mg / ml de tricaïne à chaque puits. REMARQUE: Anesthetize embryons avant l&#39;imagerie. À 24-96 HPF, le poisson-zèbre exposer mouvement spontané et une réaction de sursaut à la source de lumière changeante pendant la capture d&#39;image. Anesthésier embryons réduit le mouvement lors de l&#39;imagerie. </li><li> Placer la plaque de 96 puits dans la platine motorisée et calibrer la scène. Utilisation Zeiss Zen Bleu de 2011 logiciels pour la microscopie automatiquementsur et de contrôle, sélectionnez l&#39;option de support de l&#39;échantillon et de sélectionner multipuits 96. Sélectionnez étalonnage. Suivez les instructions pas à pas pour calibrer la scène. NOTE: Ne pas décocher le bouton tuiles après cette étape. Si le bouton de tuiles n&#39;est pas cochée, les paramètres d&#39;étalonnage peuvent être perdues et la plaque de 96 puits devront être recalibré. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 10x et le fond clair (BF) fixant, identifier un embryon de contrôle positif et définir les paramètres d&#39;exposition appropriée pour BF et canaux de GFP, faire en sorte que le signal de fluorescence est pas saturer la caméra. Focus sur un seul embryon et programmer le microscope pour acquérir 3 total Z-sections, une image 50 um ci-dessus et un 50 um ci-dessous le plan focal actuel. NOTE: En raison de différents tissus occupent différents plans focaux, ce qui garantira que pour chacune des images de poisson zèbre sont capturées avec le coeur et le foie au point. </li><li> Définissez les paramètres du logiciel à acquérir une image en mosaïque utilisant la GFP et BF Channels. Sous l&#39;onglet d&#39;acquisition, sélectionnez la configuration avancée. Certaines régions de tuiles, puis les tuiles. Choisissez l&#39;option cercle bien. REMARQUE: Carrelage est utilisé pour créer une image composite de chaque puits. Un champ de vision unique ne saisit qu&#39;une petite partie de chaque bien. La fonction de carrelage peut capturer automatiquement multiples adjacent de chaque puits des champs de vue, la création d&#39;une image composite de l&#39;ensemble du bien. Il est donc possible de capturer automatiquement des images composites 96 par plaque, où chaque image composite contient plusieurs dizaines d&#39;images individuelles à partir d&#39;un seul bien. </li><li> Sélectionnez transporteur et le facteur de remplissage de 90%. La sélection d&#39;un facteur de remplissage de 90% sera capturer plusieurs images des puits choisis de telle sorte que 90% de la surface de chaque puits est visible dans l&#39;image composite. Remarque: Lors de la sélection facteur de remplissage, un diagramme est affiché représentant la zone à imager. Sélectionnez un pourcentage qui comprendra la zone du puitsqui est appropriée pour l&#39;expérience. </li><li> Sous Options, sélectionnez la quantité de chevauchement souhaité. NOTE: Lorsque la couture de tuiles pour une seule image représentant, un chevauchement de 5-10% permet une couture lisse entre les images. Toutefois, si l&#39;assemblage des images n&#39;est pas nécessaire, en utilisant un recouvrement de 0% sera de réduire le temps d&#39;imagerie. Utilisation de 90% facteur de remplissage et 5% de chevauchement, une image composite d&#39;un seul puits est constitué de 59 images individuelles. </li><li> Lancer imagerie. Le microscope va acquérir automatiquement les images. </li><li> Inspecter manuellement images composites de chaque puits pour la fluorescence spécifique du tissu (figure 1). </li><li> NOTE: Il est préférable de commencer avec le contrôle positif à confirmer que l&#39;exposition chimique travaillé avant à l&#39;observation des puits de traitement expérimental. </li></ol> 4. L&#39;image saisie manuelle des embryons en plaque de 96 puits REMARQUE: Pour confirmer les résultats, utilisez un objectif 20x à longue distance de travail à acQuire des images plus détaillées manuellement (Figure 2). <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 20x et le fond clair (BF) fixant, identifier un embryon de contrôle positif et définir les paramètres d&#39;exposition pour les canaux BF et GFP de manière appropriée, en veillant à ce que le signal de fluorescence est pas saturer la caméra. </li><li> Identifier les embryons individuels et de capturer des images manuellement. NOTE: Une fois les paramètres d&#39;exposition ont été sélectionnés pour l&#39;embryon de contrôle positif, ne pas modifier les réglages. Ceci permet une comparaison de l&#39;intensité de fluorescence en tant que chaque image est capturée dans des conditions uniformes. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce protocole décrit une méthode simple pour automatiquement fluorescence spécifique des tissus image embryons de poisson zèbre. Le protocole a été développé en utilisant un Zeiss Axio Observer. Z1 avec Zen logiciel Blue 2011, cependant la technique peut être adaptée en utilisant n&#39;importe quel microscope inversé avec une platine motorisée et un logiciel de contrôle de microscope qui peut effectuer carrelage pour créer des images composites. L&#39;équipement d&#39;un microscope inversé avec une platine motorisée peut...

Poisson-zèbre transgénique ont été développés qui permettent la visualisation directe de l&#39;activité dans les voies, telles que les facteurs de croissance des fibroblastes 1, l&#39;acide rétinoïque et les œstrogènes 2 3, dans embryons vivants signalisation. De tels outils permettent le dépistage de substances qui perturbent les voies de signalisation (dosée comme changement de l&#39;intensité de fluorescence) ou à des composés chimiques qui modulent la signalisation d&#39;une manière spécifique d&#39;un tissu (changement de fluorescence localisation) 4. Capture d&#39;image automatisé augmente le débit d&#39;écrans chimiques considérablement 5,6. Écrans fluorescence dosage automatiquement chez le poisson zèbre en direct s&#39;appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé. Soi-disant criblage à haut contenu offre l&#39;avantage de la haute résolution, l&#39;imagerie quantitative, mais au prix de l&#39;utilisation de lecteurs de plaques spécialisées équipées pour la microscopie confocale 7,8. Le but de cette méthode est d&#39;automatiquement fluorescence spécifique des tissus essai dans embryons de poissons zèbresdans une plaque à 96 puits en utilisant un microscope à épifluorescence standard. Fluorescence spécifique d&#39;un tissu peut être distingué en utilisant cette technique et peut-être une approche raisonnable pour les laboratoires qui n&#39;ont pas accès aux lecteurs de plaques spécialisées ou de l&#39;équipement de haute teneur dépistage. Dans ce protocole, nous utilisons l&#39;imagerie automatisée pour détecter récepteur des oestrogènes tissu-spécifique (ER) des agonistes chez le poisson zèbre en direct à 3 jours après la fécondation (DPF). La lignée transgénique Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contient 5 tandem réponse aux œstrogènes séquences d&#39;ADN d&#39;éléments (ERE) en amont de la protéine fluorescente verte (GFP) 3. En l&#39;absence de ligand, RÉ sont normalement inactifs. La liaison du ligand déclenche un changement de conformation, ce qui permet de lier les récepteurs ERE ADN et régulent la transcription 9. 5xERE: poissons GFP peuvent être utilisés pour cribler des bibliothèques chimiques pour modulateurs ER et peuvent être utilisés pour cribler des échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement pour les contaminants oestrogéniques.

<table><tbody><tr><td>Pipettes de transfert en plastique ; à alésage large</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert en plastique ; pointe fine</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond plat et rondes à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 100 x 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 35 x 60 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>dimensions de la pointe 0,05 x 0,01 mm, pour l’élimination manuelle des chorions des embryons</td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de tricaïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>voir le livre Zebrafish pour la recette (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp ;</td></tr><tr><td>1-phényl-2-thiourée (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Préparer un stock de 20 mM (100x) et l’utiliser à 200 &mu ; M dans E3B&nbsp ;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Le protocole nécessite un microscope à fluorescence inversée avec une platine motorisée</td></tr><tr><td>Objectif à longue distance de travail 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Nous utilisons un objectif avec une distance de travail de 0,4 NA et 8,4 mm</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique Axiocam HRm</td><td>Logiciel de contrôle de microscope Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>ZenBlue 2011Le protocole nécessite un logiciel d’automatisation et de contrôle de la microscopie pour permettre la capture d’images en mosaïque à l’aide d’une platine motorisée</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1 ; 25 grammes</td><td>de solution à 2 % dans de l’eau osmosée pour une utilisation dans E3B (ci-dessous)</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 SOLUTION : NaCl&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; - 17,2 grammes KCl&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; - 0,76 gramme CaCl2-2H2O&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; - 2,9 grammes MgSO4-7H2O&nbsp ; - 4,9 grammes ou MgSO4 - 2,39 grammes Dissoudre dans 1 litre d’eau Milli-Q ; CONSERVER DANS UNE BOUTEILLE STÉRILE DE 1 LITRE. 1X E3B SOLUTION POUR POISSON ZÈBRE : 60X E3&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 150 ml 2 % de bleu de méthylène&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 100 &mu ; l&nbsp ; Porter à 9 litres avec de l’eau Milli-Q &nbsp ;</td></tr></tbody></table>

imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Embryons de poisson zèbre constituent un outil puissant pour le dépistage à grande échelle de petites molécules. Poisson-zèbre transgénique qui exprime des protéines rapporteurs fluorescents sont fréquemment utilisés pour identifier des produits chimiques qui modulent l&#39;expression des gènes. écrans chimiques qui essai de fluorescence chez le poisson zèbre en direct s&#39;appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé pour le criblage à haut contenu. Nous décrivons une procédure à l&#39;aide d&#39;un microscope à épifluorescence standard avec une platine motorisée à automatiquement l&#39;image des embryons de poisson zèbre et de détecter la fluorescence spécifique de tissu. Utilisation de poisson-zèbre transgénique pour signaler que l&#39;activité du récepteur des oestrogènes via l&#39;expression de la GFP, nous avons développé une procédure semi-automatique pour cribler des ligands du récepteur de l&#39;œstrogène qui activent le rapporteur d&#39;une manière tissu-spécifique. Dans cette vidéo, nous décrivons les procédures pour rangeant embryons de poisson zèbre à 24-48 heures après la fécondation (HPF) dans une plaque de 96 puits et ajouter de petites molécules qui se lient les récepteurs des œstrogènes. À 72-96 HPF, des images de chaque puits dela totalité de la plaque sont collectées automatiquement et manuellement pour inspecter fluorescence spécifique d&#39;un tissu. Ce protocole démontre la capacité de détecter les oestrogènes qui activent les récepteurs dans les valves cardiaques, mais pas dans le foie.

La figure 1 montre des images composites à partir de puits individuels d&#39;une plaque à 96 puits. Chaque image composite est composé de 59 images individuelles avec 5% d&#39;image de chevauchement. Notez que le poisson zèbre en direct sont orientés de façon aléatoire au sein de chaque bien, mais nous sommes en mesure de distinguer la fluorescence dans le coeur du foie. Images en fond clair sont utiles comme références pour évaluer l&#39;orientation du poisson zèbre et de visualiser les anomalies morph...

Décrit ici est un protocole d&#39;imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d&#39;embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter automatiquement les cellules sensibles aux œstrogènes chez des larves de poisson zèbre vivantes. Cela est réalisé en croisant d'abord cinq poissons adultes X-E-R-E-G-F-P afin de produire des embryons de poisson zèbre rapporteurs d'œstrogènes. Ensuite, les embryons sont placés dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits.Ensuite, des œstrogènes sont ajoutés sur la plaque contenant les embryons. Enfin, la plaque est analysée en fluorescence à l’aide d’un microscope épifluorescent équipé d’un plateau motorisé. En définitive, la microscopie en fluorescence permet de révéler l’activité tissulaire spécifique des récepteurs aux œstrogènes.Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes traditionnelles, telles que le criblage à haut débit ou le criblage à contenu élevé, réside dans le fait que la fluorescence spécifique aux tissus chez les larves de poisson zèbre peut être visualisée à l'aide d'un simple microscope épifluorescent standard, équipé d'une platine motorisée, sans nécessiter de lecteur de plaques spécialisé. Les produits chimiques de précaution tels que le BPA et l'estradiol sont dangereux et peuvent avoir des effets néfastes sur le fœtus humain.Manipulez les perturbateurs endocriniens avec précaution et utilisez toujours des équipements de protection individuelle adaptés. Dans cette démonstration, des zebrafish seront exposés aux œstrogènes 17 bêta-estradiol, au bisphénol A et à la génine à diverses doses, à partir de 48 heures après la fécondation, après accouplement des zebrafish, collecte et équation des œufs. Selon le protocole prévu le jour du traitement, diluez les solutions chimiques stock décongelées, d’un à 1000, dans un millilitre de E3B plus PTU, puis vortexez vigoureusement.En tant que témoin véhicule. Utilisez une dilution au 1/1000 de DMSO dans le milieu E3B et PTU à l’aide d’une pipette plastique à embout large. Transférez à l’aide d’une pipette trois embryons par puits dans une plaque de 96 puits, en préparant trois puits par condition.Évitez de placer les embryons dans les puits périphériques afin de prévenir l'évaporation du milieu pendant un traitement prolongé. Travaillez rapidement pour éviter que les embryons ne s'assèchent, retirez le milieu de chaque puit et ajoutez 200 microlitres de solution de traitement bien mélangée. Vérifiez visuellement que tous les embryons sont immergés dans la solution et ne sont pas collés sur la paroi du puit.Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant 72 heures. Après la fécondation, anesthésier les embryons en ajoutant 10 microlitres de quatre milligrammes par millilitre de trica. Pour chaque puits, placer la plaque de 96 puits sur une platine motorisée et utiliser le logiciel Zeiss Zen Blue 2011.Étalonner la platine en sélectionnant l'option de porte-échantillon et en choisissant la plaque multicuvettes 96. Ensuite, sélectionner l'étalonnage, puis suivre les instructions étape par étape, en utilisant un objectif 10 x et le réglage en champ clair ou BF. Identifier un embryon témoin positif et régler correctement les paramètres d'exposition pour les canaux BF et GFP, en veillant à ce que le signal de fluorescence n'entoure pas la caméra. Mettre au point sur un embryon unique et programmer le microscope pour acquérir un total de trois sections en Z, comprenant une image à 50 micromètres au-dessus et une autre à 50 micromètres en dessous du plan focal actuel.Ensuite, configurez les paramètres du logiciel pour acquérir une image en mosaïque à l’aide des canaux GFP et BF. Dans l’onglet d’acquisition, sélectionnez « configuration avancée », puis « régions en mosaïque » et enfin « mosaïques ». Choisissez le cercle.Sélectionnez l’option de puits, le porte-objet et un facteur de remplissage de 90 % pour capturer plusieurs images des puits sélectionnés, de sorte que 90 % de la surface de chaque puits soit visible sur l’image composite. Dans les options, choisissez le taux de recouvrement souhaité, par exemple de 5 à 10 %, ce qui permet une transition fluide entre les images. Démarrez ensuite l’acquisition pour capturer manuellement les images à l’aide d’un objectif 20 x et du réglage BF, puis identifiez un embryon témoin positif.Configurez les paramètres de BF et de GFP comme précédemment et acquérez les images. Cette figure montre des images composites provenant de puits individuels d'une plaque de 96 puits. Chaque image est composée de 59 images individuelles avec un chevauchement de 5 %.Remarquez que les zebrafish vivants sont orientés aléatoirement dans chaque puits. Néanmoins, nous sommes capables de distinguer la fluorescence du cœur de celle du foie. Les images en champ clair sont utiles comme références pour évaluer l'orientation des zebrafish et visualiser les anomalies morphologiques.Les images présentées ici ont été capturées à l’aide d’un objectif à longue distance de travail de 20 x pour une analyse plus détaillée, et ont été prises directement après le balayage automatisé précédemment montré, sans retirer la plaque de la platine du microscope. En utilisant un objectif de 20 x, la fluorescence au niveau du cœur peut être localisée précisément aux valves atrioventriculaires indiquées par les flèches ainsi qu’aux valves aortiques, comme l’indique la tête de flèche. Une fois cette technique maîtrisée, des images de 3 plaques de 96 puits peuvent être acquises par jour.N'oubliez pas que le travail avec des composés perturbateurs endocriniens peut être dangereux ; prenez donc toujours les précautions appropriées, comme le port d'équipements de protection individuelle adaptés lors de la réalisation de cette procédure.

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Biologie

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Source : Zhang, X., et al. Un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de l’infection à Staphylococcus aureus associée aux biomatériaux. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’imagerie par fluorescence d’embryons de poisson-zèbre injectés avec Staphylococcus aureus, permettant de quantifier la progression de l’infection et la distribution bactérienne pour évaluer l’impact des microsphères de biomatériaux sur les interactions hôte-pathogène in...

 Imagerie par fluorescence de l’infection bactérienne associée aux biomatériaux chez les embryons de poisson-zèbre

Le développement de poisson zèbre peut être suivie au fil des jours avec la microscopie nappe de lumière lorsque les embryons sont incorporés dans des tubes de polymères optiquement transparents à faible concentration d'agarose.

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

Microinjection des embryons de poisson-zèbre et des larves est une technique cruciale mais difficile utilisée dans de nombreux modèles de poisson-zèbre. Nous présentons ici une gamme d’outils de micro-échelle pour aider à la stabilisation et l’orientation du poisson-zèbre pour microinjection et l’imagerie.

Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre

Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Ce protocole utilise l’imagerie par feuille de lumière pour étudier la fonction contractile cardiaque chez les larves de poisson-zèbre et mieux comprendre la mécanique cardiaque grâce au suivi cellulaire et à l’analyse interactive.

Imagerie 4D de la contraction cardiaque du poisson-zèbre

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Découvrez une méthode d'imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans des embryons de poissons zèbres. Cette technique permet de visualiser l'activité des récepteurs aux œstrogènes dans des larves vivantes.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

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