Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

L’objectif global de cette procédure est de détecter automatiquement les cellules sensibles aux œstrogènes dans les larves de poisson-zèbre vivantes. Ceci est accompli en sélectionnant d’abord cinq poissons adultes X-E-R-E-G-F-P pour générer des embryons de poisson-zèbre rapporteur d’œstrogènes. Ensuite, les embryons sont placés dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits.

Ensuite, des œstrogènes sont ajoutés à la plaque d’embryons. Enfin, la fluorescence de la plaque est scannée à l’aide d’un microscope épifluorescent doté d’une platine motorisée. En fin de compte, la microscopie fluorescente est utilisée pour montrer l’activité tissulaire spécifique des récepteurs d’œstrogènes.

Ainsi, le principal avantage de l’utilisation de cette technique par rapport à d’autres techniques traditionnelles telles que le criblage à haut débit ou à haut contenu, est que la fluorescence spécifique des tissus des larves de poisson-zèbre peut être imagée à l’aide d’un microscope épifluorescent standard. Equipé d’une platine motorisée, aucun lecteur de plaques spécialisé n’est nécessaire. Attention : les produits chimiques contenant du BPA et de l’œstradiol sont dangereux et peuvent avoir des effets délétères sur le fœtus humain.

Manipulez les perturbateurs endocriniens avec précaution et utilisez toujours un équipement de protection individuelle approprié. Dans cette démonstration, le poisson-zèbre sera exposé aux œstrogènes 17 bêta-œstradiol, bisphénol A et génine à diverses doses, à partir de 48 heures après la fécondation après la reproduction du poisson-zèbre, et la collecte et l’assimilation des œufs. Selon le texte le jour du traitement, diluer dégeler les solutions chimiques mères, un à 1000 dans un millilitre de E trois B plus PTU vortex vigoureusement.

En tant que contrôle du véhicule. Utilisez une dilution de un à 1000 de DMSO dans E, trois, B et PTU à l’aide d’un transfert plastique de grand calibre. La pipette transfère trois embryons par puits dans une plaque de 96 puits préparant trois puits par condition.

Évitez de placer les embryons dans les puits extérieurs pour éviter l’évaporation du milieu pendant un traitement prolongé. En travaillant rapidement pour éviter de dessécher les embryons, retirez le milieu de chaque puits et ajoutez 200 microlitres de solution de traitement bien mélangée. Confirmez visuellement que tous les embryons sont immergés dans la solution et ne sont pas collés sur le côté du puits.

Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius à 72 heures. Après la fécondation, anesthésez les embryons en ajoutant 10 microlitres de quatre milligrammes par millilitre de trica. Pour chacun, placez bien la plaque à 96 puits sur une platine motorisée et à l’aide du logiciel Zeiss Zen Blue 2011.

Étalonnez l’étage en sélectionnant l’option de support d’échantillon et en choisissant multipuits 96. Sélectionnez ensuite calibrer avant de suivre les instructions par étapes, à l’aide d’un objectif 10 x et du réglage fond clair ou BF, identifiez un embryon de contrôle positif et réglez les paramètres d’exposition de manière appropriée pour les canaux BF et GFP, en vous assurant que le signal de fluorescence ne sature pas l’appareil photo. Concentrez-vous sur un seul embryon et programmez le microscope pour acquérir un total de trois sections Z qui comprennent une image à 50 micromètres au-dessus et une à 50 micromètres en dessous du plan focal actuel.

Ensuite, pour définir les paramètres du logiciel afin d’acquérir une image en mosaïque à l’aide des canaux GFP et BF. Sous l’onglet acquisition, sélectionnez Configuration avancée, sélectionnez Régions de vignettes, puis Vignettes. Choisissez le cercle.

L’option de puits sélectionne le support et le facteur de remplissage de 90 % pour capturer plusieurs images des puits sélectionnés, de sorte que 90 % de la surface de chaque puits soit visible dans l’image composite. Sous les options, sélectionnez le degré de chevauchement souhaité, par exemple de cinq à 10 %, ce qui permet une couture fluide entre les images. Ensuite, commencez l’imagerie pour capturer manuellement des images à l’aide d’un objectif 20 x et du réglage BF, identifiez un embryon témoin positif.

Réglez les paramètres BF et GFP comme précédemment et prenez des images. Cette figure montre des images composites de puits individuels d’une plaque de 96 puits. Chaque image est composée de 59 images individuelles avec un chevauchement de 5 %.

Notez que les poissons-zèbres vivants sont orientés de manière aléatoire à l’intérieur de chaque puits. Pourtant, nous sommes capables de distinguer la fluorescence dans le cœur de la fluorescence dans le foie. Les images en fond clair sont utiles comme références pour évaluer l’orientation du poisson-zèbre et visualiser les anomalies morphologiques.

Les images présentées ici ont été capturées avec un objectif de longue distance de travail de 20 x pour une analyse plus détaillée, et ont été prises directement après le balayage automatisé qui vient d’être montré sans retirer la plaque de la platine du microscope. À l’aide d’un objectif 20x, la fluorescence dans le cœur peut être localisée avec précision sur les valves ventriculaires auriculaires indiquées par les flèches et les valves aortiques indiquées par la pointe de flèche. Une fois cette technique maîtrisée, il est possible de capturer par jour des images de 3 96 plaques murales.

N’oubliez pas que travailler avec des perturbateurs endocriniens peut être dangereux, alors prenez toujours les précautions appropriées, comme le port de l’équipement de protection individuelle approprié lors de l’exécution de cette procédure.