Évaluation des contributions spécifiques aux espèces Vers développement cranio-facial Utilisation chimères caille-canard

L’objectif général de cette procédure est d’utiliser des chimères de canal de caille comme moyen d’étudier les mécanismes par lesquels les cellules de la croûte neurale génèrent des motifs spécifiques à l’espèce au cours du développement facial crânien. Ceci est accompli en disséquant et en retirant d’abord une bande du pli neural de la région cérébrale médiane et antérieure postérieure d’un embryon de caille de stade 9,5. La deuxième étape consiste à transférer le pli neural du donneur de caille à l’embryon hôte du canard.

La troisième étape consiste à disséquer et à retirer la région équivalente d’un embryon hôte de canard de stade 9,5. La dernière étape consiste à placer le pli neural de la bobine dans la région du canard, du milieu et du cerveau postérieur antérieur. En fin de compte, les embryons chimériques qui en résultent peuvent identifier des changements dans l’expression génique médiés par la crête neurale grâce à l’hybridation en C deux, et peuvent également révéler des changements morphologiques grâce à des analyses histologiques.

J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque je regardais les pélicans bruns voler au-dessus d’Ocean Beach à San Francisco. J’ai réalisé que les cellules de la crête neurale doivent être la source d’un motif spécifique à l’espèce puisqu’elles donnent naissance aux os et aux cartilages de leur long squelette de bec. Bien que je n’aie pas pu retrouver les œufs de pélican brun, j’ai pu trouver du canard laqué blanc.

Étant donné que San Francisco possède le plus grand quartier chinois en dehors de l’Asie, en exploitant les différences de taux de maturation et de morphologie entre les cailles et les canards. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la compréhension des origines du modèle spécifique à l’espèce, la Dre Jennifer Fish, qui est une chercheuse postdoctorale Dans mon laboratoire, l’aide sera Kate Ovitz, qui est une étudiante diplômée À l’aide d’un chignon et d’un brûleur, chauffez l’extrémité étroite d’une pipette en pâte jusqu’à ce que le verre le long du cône commence à fondre. Retirez-le de la flamme et tirez sur l’embout jusqu’à ce que la pipette soit scellée.

Assurez-vous qu’une partie de la partie conique a un diamètre extérieur compris entre 0,7 et un millimètre. Cassez ensuite l’extrémité scellée à environ quatre centimètres du cône. Ensuite, fixez environ deux pieds de tube en caoutchouc à l’extrémité ouverte du soufflage de la pipette à l’autre extrémité.

Il ne doit pas y avoir d’air passant à travers le raccord ou l’autre extrémité de la pipette tout en exerçant une légère pression en soufflant sur le tube. À l’aide d’un crayon propane, d’un chalumeau à flamme, chauffer une zone ovale d’un côté de la pipette, juste en dessous du début de la cône. Dès que le verre commence à se déformer vers l’extérieur, retirez la pipette de la flamme et soufflez doucement à travers le tube en caoutchouc.

Cela provoquera la formation d’une bulle en forme de boudin dans la partie chauffée du verre. Trop de pression fera éclater la bulle de verre, ce qui doit être évité. La fenêtre résultante dans la pipette doit être d’environ un centimètre de large et d’un centimètre et demi à deux centimètres de long.

Pointez maintenant l’extrémité effilée vers le haut et grattez la bulle dans un récipient à déchets en verre tout en soufflant doucement à travers le tube pour empêcher les fragments de verre de pénétrer dans la pipette. Ensuite, à l’aide de la flamme de propane, brûlez soigneusement les bords restants de la bulle et polissez au feu les côtés de la fenêtre ouverte. Ensuite, tenez le crayon à pointe diamantée en position verticale, utilisez un crayon à pointe de diamant pour marquer l’extrémité effilée de la pipette à un centimètre du début de la conicité.

À l’aide d’une pince, cassez doucement la pipette au niveau de la ligne entaillée. Pour retirer la pointe, vérifiez sous un microscope à dissection pour vous assurer que la cassure est propre et non irrégulière. Tenez la pipette comme on tiendrait un crayon avec un index au-dessus de la fenêtre ouverte à environ 9,5 millimètres de la pointe.

Ramollissez le verre de la pipette en le tenant à côté du bord de la flamme d’un brûleur à alcool. Appliquez une pression sur la pointe à l’aide d’une pince pour plier l’extrémité étroite de la pipette à un angle de 60 degrés sous une lunette de dissection. Rapidement et soigneusement, le feu a poli la pointe avec le brûleur à alcool.

L’ouverture finie doit être arrondie et dégagée. Notez que l’embout deviendra rétréci et inutilisable s’il est maintenu trop longtemps dans la flamme. Maintenant, lubrifiez un tube en caoutchouc de 2,5 centimètres de long avec 70 % d’éthanol.

Faites-le glisser sur la tige de la pipette de bas en haut pour couvrir la fenêtre ouverte. Placez ensuite une poire en latex de deux millilitres sur l’extrémité ouverte de la pipette. Pour maintenir la pression de l’air interne, préparez d’abord l’œuf hôte.

Coupez la membrane Vitale à l’aide d’une aiguille de tungstène aiguisée à la flamme et tirez la membrane sur l’embryon. Ensuite, refermez l’ovule avec du ruban adhésif comme cela a été fait pour l’ovule de la donneuse. Retirez le ruban adhésif de la fenêtre de l’ovule de donneuse pour couper le pli neural de l’embryon de donneur.

Faites des fentes des deux côtés du tube neural à l’aide d’une aiguille en tungstène aiguisée à la flamme. Ensuite, coupez à travers le tube neural aux niveaux antérieur et postérieur souhaités du greffon et séparez le greffon du reste du tube neural. Faites attention à tous les détails anatomiques particuliers comme la forme antérieure ou postérieure du greffon, qui permettra d’orienter correctement le tissu donneur.

Lorsqu’elle est placée dans l’hôte, assurez-vous que l’aiguille en tungstène est extrêmement tranchante. Utilisez des mouvements rapides et délibérés afin de retirer complètement le tissu et en un seul morceau, retirez le pli neural de l’embryon donneur à l’aide d’une pipette chaman. Prélevez le moins de liquide possible, sinon le tissu pourrait flotter lors du transfert.

Retirez maintenant le ruban adhésif de la fenêtre de l’ovule hôte et utilisez la pipette chamanique pour placer le pli neural du donneur à côté de l’embryon hôte adjacent à la région du tube neural qui recevra la greffe. Maintenant, séparez le pli neural du tube neural de l’embryon hôte comme fait avec le donneur. Prenez soin de prélever un greffon de taille égale à celle du tissu donneur.

Poussez doucement ce tissu hôte loin de l’embryon. Ensuite, à l’aide d’une aiguille en tungstène émoussée ou de la pointe arrondie d’une micro-pipette, déplacez doucement le pli neural du donneur dans le tube neural de l’hôte, en maintenant les bonnes orientations anter postérieure et dorsale ventrale. Assurez-vous que le greffon est rentré le long des côtés, mais assurez-vous de ne pas piquer ou endommager les tissus sous-jacents.

Une solution saline stérile doit être appliquée avec précaution sur l’embryon hôte. S’il y a des signes de dessiccation, refermez et étiquetez soigneusement l’œuf et remettez-le doucement dans un incubateur à haute humidité où l’embryon chimérique peut se développer jusqu’au stade souhaité. Pour analyse.

Pour l’analyse, collectez les embryons chimériques dans le fixateur froid de Sarah fraîchement préparé. Ensuite, placez-les immédiatement sur une bascule à quatre degrés Celsius pour une fixation de nuit. Cela permettra une détection plus sensible des œufs de caille avec l’anticorps anti-caille.

Une autre étape importante pour l’analyse de l’expression génique par PCR quantitative en temps réel consiste à congeler les embryons et l’azote liquide avant l’ARN. Les bobines d’extraction et les canards présentent des différences considérables de taille et de forme, et leurs embryons sont donc parfaitement adaptés à la fabrication d’un système chimérique. Étudier le développement craniofacial C.

Plus précisément, le système est utile pour étudier le rôle des cellules de la crête neurale. En modelant le squelette facial chez le chimérique en tant qu’embryon, les cellules de la crête neurale de la caille migrent dans l’arc mandibulaire du canard hôte. Dans un motif semblable à celui d’un canard, les cellules de donneur de caille en vert sont observées avec un anticorps anti-caille depuis la vue ventrale.

Dans un embryon chimérique de stade 12, la crête neurale du donneur génère un squelette mandibulaire de taille et de forme semblable à celle d’une caille. Une fois maîtrisée, chaque greffe peut être effectuée en cinq minutes environ. Si cela est fait correctement plus longtemps, l’embryon risque d’être desséché et le taux de survie diminuera.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important d’être conscient de votre posture, de détendre vos épaules et de maintenir une bonne position de la main. De plus, établissez une routine et placez vos outils et réactifs chirurgicaux au même endroit à chaque fois afin de pouvoir garder vos yeux dans le microscope et bouger vos mains de manière automatisée.