Une étape de purification de protéines Twin-Strep-marqués et leurs complexes sur Strep-Tactin résine réticulée Avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)

Bonjour, je suis Christina McKennan de l'Université d'Helsinki, en Finlande. L'un des défis dans la caractérisation d'un complexe protéique particulier consiste à déterminer sa composition moléculaire. Cela nécessite la mise au point de méthodes permettant d'isoler et de purifier le complexe à partir de son environnement cellulaire.

Le domaine de recherche sur les microbes concerne les interactions entre les virus végétaux et leurs hôtes, et nous nous intéressons donc aux divers complexes ribonucléoprotéiques viraux formés durant l'infection. Par le passé, nous avons étudié avec succès ces complexes grâce à une purification par affinité basée sur un marqueur dans nos expériences. Le marqueur double strep s'est révélé l'un des meilleurs marqueurs.

Nous avons toutefois observé certaines limites à son utilisation, dont un rendement faible, et nous souhaitions donc améliorer cette méthode. Bonjour, je m'appelle Mata et je vais vous guider à travers le protocole expérimental. Mais tout d'abord, permettez-moi de vous présenter un aperçu de la méthode.

Nous utilisons des billes de macro-préparation Strep-Tactin pour purifier des complexes spécifiques entre des protéines doublement marquées par la balise Strep et leurs partenaires d'interaction physiologiques. Le tétramère marqué par la balise Strep est représenté en vert, la protéine doublement marquée par la balise Strep en bleu, son partenaire d'interaction en orange, et deux copies de la balise Strep en rouge.

Les protéines non liées, représentées comme des peurs gracieuses, sont éliminées par lavage selon l'approche canonique. Les complexes liés sont élus de manière compétitive avec la biotine, indiquée en rose. Toutefois, lors de l'utilisation de cette approche, nous avons observé une élution incomplète des complexes liés, seulement une fraction se détachant avec succès des billes de streptacine.

Cela entraîne une faible récupération de la protéine cible. La récupération de la protéine cible peut être améliorée à l’aide d’une élution dénaturante avec S-D-S-S-D-S, ce qui complique toute analyse ultérieure. Des cellules Miss se forment autour de l’aimant protéique double marque Twin Strep TTag dénaturé.

Son partenaire de liaison et autour des monomères dissociés de strept-actine. La contamination de l'échantillon par la strept-actine libérée est inacceptable si l'échantillon doit être analysé ultérieurement par spectrométrie de masse. Pour résoudre le problème de contamination, nous avons mis au point une méthode par laquelle le tétramère de strept-tachinine est d'abord stabilisé par réticulation chimique.

La résine réticulée résultante est utilisée pour purifier la protéine cible et son partenaire de liaison. L'éluage de l'échantillon avec du SDS assure une forte récupération des protéines, tandis que la réticulation chimique de la résine garantit l'éluage de la protéine cible marquée par la strept et de son partenaire de liaison, en l'absence de contamination de l'échantillon par la strept libérée. Équilibrer un tube microscellique scellé ne présentant aucun obstacle. Contenant deux milligrammes de BS trois comme agent de réticulation, à température ambiante.

Préparez une pointe de pipette pour le transfert de résine en coupant l'extrémité de la pointe afin de faciliter le resuspendage du strep tact et de la résine macro prep par agitation vigoureuse brève, puis transférez immédiatement 600 microlitres de la suspension dans une colonne filtrante CoStar SpinX. Centrifugez à 4 000 tr/min pendant 30 secondes. Ajoutez 450 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante. L'objectif de cette étape est de remplacer la tris primaire amine par un phosphate non réactif.

Jetez le flux. Mélangez le contenu en retournant le tube plusieurs fois. Répétez deux fois les étapes de centrifugation et de lavage, puis laissez la résine dans 430 microlitres de P-B-S-P-H 8.

Après la dernière centrifugation, percer la feuille d’aluminium du microtube No Way avec une pointe de pipette contenant 100 microlitres d’eau Milli Q. Dissoudre la poudre BS three dans l’eau en pipetant doucement vers le haut et vers le bas. Une fois le BS three complètement dissous, ajouter immédiatement 20 microlitres de la solution dans la colonne Spin X. S’assurer que les composants sont correctement mélangés.

Faites tourner la colonne pendant 30 minutes à température ambiante, en veillant à ce que la résine soit correctement mélangée avec la solution BS trois. Pour arrêter la réaction, ajoutez six microlitres de triss trois molaire ajusté à un pH de 7,5 à l’aide d’acide chlorhydrique. Faites tourner la colonne pendant encore 15 minutes à température ambiante, puis centrifugez à 4 000 tr/min pendant 30 secondes.

À température ambiante, remettre en suspension la résine réticulée dans 450 microlitres de solution saline tamponnée au tris contenant du Tween 20, puis jeter l'écoulement. Répéter les étapes de centrifugation et de lavage deux fois supplémentaires. Lors de la dernière étape, remettre en suspension la résine dans 450 microlitres de TBS. Transférer la suspension de résine dans un tube neuf, remettre en suspension la résine restante dans la colonne avec 450 microlitres supplémentaires de TBS, puis transférer le tout dans le même tube.

Répétez la dernière étape une fois de plus afin d'assurer un transfert maximal de la résine de la colonne vers le tube. Laissez le tube contenant la suspension de résine reposer 10 minutes à température ambiante et ajustez le volume à 600 microlitres. En éliminant l'excès de TBS, la résine est prête à être utilisée immédiatement ou peut être conservée à quatre degrés Celsius sans congélation.

Cette méthode convient à la purification de toute protéine de fusion marquée par une double étiquette strep et de ses complexes associés. La protéine peut être d'origine animale, végétale ou bactérienne et peut être isolée soit à partir d'un lysat total de cellules, soit à partir d'une fraction organellaire enrichie. Dans cet exemple, nous isolons une protéine de virus de pomme de terre A portant une double étiquette strep, appelée VPG Pro, à partir de la fraction nucléaire de plantes infectées par le virus, en centrifugeant un millilitre de l'échantillon de la protéine cible dans un tampon de liaison à 13 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Transférez le surnageant dans un tube neuf afin de minimiser la liaison des protéines biotinylées endogènes au strep tact et à la résine. Ajoutez de l'avadon à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre, en veillant à ce que le mélange soit homogène. Incubez sous agitation pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Resuspendre la résine réticulée par vortexage et, à l’aide d’une pipette à embout conique, ajouter immédiatement 50 microlitres de la suspension de résine dans le tube contenant l’échantillon de protéine cible. Incuber sous agitation rotative pendant encore 30 minutes à quatre degrés Celsius en attendant. Régler le mélangeur thermique à 55 degrés Celsius et préchauffer 500 microlitres de tampon d’élution pour l’utilisation lors de l’étape d’élution. Centrifuger à 2000 tr/min pendant une minute à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez la résine avec un millilitre de tampon de lavage prérefroidi. Premièrement, agitez pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Répétez les étapes de centrifugation et de lavage trois fois lors de la dernière étape.

Resuspendre la résine dans 250 microlitres de tampon de lavage numéro deux et transférer la suspension de résine dans une colonne spinx fraîche. Resuspendre la résine restante dans le tube dans un autre 250 microlitres de tampon de lavage numéro deux et transférer dans la même colonne. Centrifuger à 2000 tr/min pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Transférer la colonne dans un tube fraîche de type dolphin nose de deux millilitres et jeter le flux traversant.

Passez immédiatement à l'étape d'élution suivante. Ajoutez 150 microlitres de tampon d'élution préchauffé à la colonne spinx. Incubez la solution dans le mélangeur thermorégulé pendant cinq minutes à 55 degrés Celsius, en agitant à 1400 tr/min, puis centrifugez à 4 000 tr/min pendant une minute à température ambiante et jetez la colonne.

Les protéines cibles purifiées sont désormais prêtes pour des analyses supplémentaires et peuvent être conservées à une température inférieure à moins 20 degrés Celsius. L'image montre que l'élution des protéines à partir de la résine strept actine macro prep avec la biotine est incomplète par rapport à l'élution avec le SDS. La différence des intensités du signal sur le western blot reflète les rendements protéiques différents obtenus avec les deux techniques d'élution. Bien que l'élution avec le SDS soit beaucoup plus efficace que l'élution avec la biotine, elle entraîne une contamination de l'échantillon par la strept actine libérée.

L'image montre un gel coloré à l'argent de SDS EIT provenant de la résine Strept actin Macro prep. Notez la présence de strept actine libérée dans la colonne de gauche, mais son absence dans celle de droite. L'échantillon de gauche a été élué à partir de la résine non réticulée, et l'échantillon de droite à partir de la résine réticulée avec BS trois. D'après ces résultats, nous concluons que la réticulation avec BS trois empêche le relargage de la strept actine à partir de la résine lors de l'élution au SDS.

Dans cet exemple, nous avons utilisé une résine Strept actin macro prep réticulée avec du BS trois pour purifier la protéine cible VPG PRO et ses partenaires d'interaction. Un aliquot de l'échantillon purifié a été soumis à une analyse en spectrométrie de masse pour l'identification des protéines. L'absence de bande spécifique dans le témoin négatif confirme la spécificité de la précipitation.

La bande inférieure correspond à la protéine cible VPG PRO et la bande supérieure à son partenaire de liaison NIB réplicat, identifié par spectrométrie de masse. Bonjour, nous venons de vous montrer comment le réticulation chimique peut être utilisée pour surmonter les limitations associées à la Dena et à l'illusion provenant de la résine strep tact. En plus de la purification de complexes protéine-protéine, la méthode peut également être utilisée pour purifier des complexes protéiques avec des acides nucléiques, y compris ceux réticulés en sens inverse au moyen de formaldéhyde.

Enfin, la méthode peut être utilisée pour purifier les protéines membranaires strep tech solubilisées à l’aide de détergents. Les détergents sont nécessaires pour maintenir ces protéines hydrophobes en solution.

Cependant, leur présence peut entraîner une contamination de l'échantillon par la streptane libérée. Même lorsqu'une évolution douce de la biotine est utilisée, nous pensons que la réticulation de la résine pourrait constituer une solution au problème de contamination de l'échantillon. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. D'accord.