In Vitro agrégation essais utilisant la protéine tau hyperphosphorylée

L’objectif global de cette procédure est de surveiller et de comparer la cinétique d’agrégation d’espèces de protéines tau non modifiées et hyperphosphorylées. Ceci est accompli en générant d’abord la protéine tau non modifiée et hyper phosphorylée par le système de catalyseur assisté par des fermetures éclair. La deuxième étape consiste à configurer les tests d’agrégation pour qu’ils conviennent à l’un ou l’autre des deux instruments différents.

Le processus d’agrégation de tau est surveillé par la fluorescence de deux thio différents. Matrices de flavine, celle de la flavine S et celle de la flavine T.La dernière étape consiste à tracer et à comparer les courbes d’agrégation. En fin de compte, les changements cinétiques de la fluorescence de la thioflavine à partir de la liaison à des espèces TA agrégées sont utilisés pour montrer l’augmentation dépendante de l’hyperphosphorylation de la fibrillation tau in vitro.

Bonjour.Bienvenue dans notre article JOV. Essais d’agrégation in vitro utilisant la protéine hyper phospho tau. Je m’appelle Minko, et les expériences seront menées et démontrées par la route.

Et pour ce protocole, un tampon d’agrégation raisonnablement frais créé au cours du dernier mois. Juste avant son utilisation, ajoutez DIO trois etol à un millimolaire également nécessaire : un thé Theo Flavin filtré ou une solution mère S. Solution mère d’hein, à la fois stockable à moins 20 degrés Celsius et protéine de serviette stockée à moins 80 degrés Celsius.

Tirez la serviette sur de la glace, puis ajustez sa concentration à l’aide du tampon d’agrégation au besoin pour plus de cohérence. Faites tourner la serviette avec le tampon d’agrégation et 20, 800 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez maintenant le supinate dans un autre tube et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit temps d’assembler la réaction d’agrégation.

Installez le mélange d’agrégation dans des tubes microcentri de 1,5 millilitre. Selon le tableau, 100 microlitres suffisent pour une aliquote de réactifs. Calculez le volume total en fonction du nombre de réactions et augmentez-le de 10 % pour tenir compte des erreurs de pipetage.

Le poivre peut être remplacé par de l’acide raonique ou un tampon d’agrégation si nécessaire. Mélangez les réactions par inversion et transférez-les à 37 degrés Celsius sans végétation. Toutes les 24 heures, réapprovisionnez les réactions avec un millimolaire supplémentaire de DTT pour assurer un environnement réducteur pour mesurer la fluorescence.

Réchauffez le fluorimètre spectral pendant environ 10 minutes. Cela améliorera la cohérence des mesures dans le logiciel informatique. Sélectionnez le mode d’affichage en temps réel situé dans le centre de contrôle des instruments.

Réglez la longueur d’onde d’excitation à 450 nanomètres avec la fente à deux nanomètres et réglez la longueur d’onde d’émission à 510 nanomètres avec la fente de cinq nanomètres. Retournez ensuite au centre de contrôle de l’instrument et choisissez l’analyse à longueur d’onde constante. Appuyez sur la touche d’ajout dans le cadre supérieur pour ajouter un ensemble de longueurs d’onde.

Réglez les paramètres d’acquisition de l’erreur type sur un et les essais maximum sur trois. Cliquez ensuite sur ajouter. Cliquez ensuite sur Aller pour ouvrir la fenêtre d’affichage des données.

Maintenant, dans la fenêtre d’affichage des données, cliquez sur démarrer l’action pour ouvrir la boîte de dialogue de nouvel échantillon et choisissez inconnu pour le type d’échantillon. Préparez ensuite les réactions pour prendre des mesures tous les 100 microlitres à 98. Des microlitres de tampon d’agrégation, et deux microlitres de trois millimolaires de flavine S ou T pipetent le mélange plusieurs fois pour assurer un bon mélange.

Transférez les 200 microlitres d’un mélange dans un FA trois quarts et chargez-le en position. Après avoir retiré la solution du vétérinaire, rincez-la trois fois à l’eau distillée et séchez-la dans un courant d’air. Ce test inclut le colorant fluorescent dans la réaction aion, ce qui permet des mesures continues et est mieux réalisé avec un lecteur automatique de plaques à puits de tapis.

Un paramètre régulier fonctionne également est limité par la vitesse de fonctionnement manuel. Installez le mélange d’agrégation dans une plaque noire opaque de 96 biens. Avec 360 microlitres, un puits de 200 microlitres de volume est suffisant pour chaque mesure de point temporel.

Mélangez bien chaque réaction avec le pipetage. Incuber la plaque à 96 puits à 37 degrés Celsius et toutes les 24 heures, ajoutez une millimolaire supplémentaire de DTT pour assurer un environnement réducteur à chaque point temporel. Pour une mesure, allumez le lecteur de microplaques multimode et l’ordinateur au moins 10 minutes à l’avance dans le logiciel de l’ordinateur.

Réglez la température sur 37 degrés Celsius et sélectionnez le mode d’intensité de fluorescence. Réglez ensuite la longueur d’onde d’excitation sur 450 nanomètres et la longueur d’onde d’émission sur cinq et 10 nanomètres. Insérez la plaque à 96 puits dans le tirage et appuyez sur la touche de lecture.

Après avoir pris les mesures, retournez immédiatement la plaque dans l’incubateur avant d’analyser les données, le test en mode continu peut être effectué à l’aide d’un spectrophotomètre compact pour ce test. Installez le mélange d’agrégation dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre. 200 réactions de microlitres suffisent pour mesurer un point temporel.

Retournez les tubes pour mélanger. Réglez les réactions à 37 degrés Celsius ou à température ambiante et ajoutez un millimolaire supplémentaire de DTT toutes les 24 heures pour prendre des mesures. Configurez l’uromètre et le logiciel comme pour le test terminal sans matrice.

Transférez tout le mélange chez un vétérinaire et placez-le dans le porte-échantillon dans le compartiment à échantillon et fermez le couvercle. Cliquez sur Exécuter pour collecter les données de fluorescence aux intervalles de temps appropriés. Si cet intervalle est court, par exemple 30 ou 60 secondes, vous pouvez laisser le vétérinaire Q dans la machine entre les mesures jusqu’à ce que le dernier point de temps soit atteint.

Retournez la réaction du vétérinaire dans son tube d’échantillon et retournez le tube dans l’incubateur une fois terminé. Maigrez le vete comme indiqué précédemment en utilisant des recombinants tau et P tal. Deux protocoles différents ont été établis pour comparer la cinétique d’agrégation de tau et de ptal, en tirant parti de la forte émission fluorescente de la flavine t et du s lors de la liaison à des agrégats de protéines amyloïdes, y compris tau et p tal, avec ou sans colorant fluorescent.

Dans la réaction d’agrégation, il y avait une augmentation constante de l’agrégation de tau par hyperphosphorylation. En règle générale, les liga T et p tal augmentent rapidement dans les 30 premières minutes avant un ralentissement significatif, y compris la flavine. T dans les réactions d’agrégation provoque un retard significatif dans le taux d’agrégation.

Theof Flavian s et t ont approché un plateau après avoir réagi pendant 160 minutes. Les flavines biologiques, en revanche, n’ont pas provoqué de ralentissement appréciable de l’agrégation. Suite à cette procédure, des isoformes supplémentaires du système nerveux central ou d’autres protéines sujettes à l’agrégation dans la neurodégénérescence peuvent être effectuées à l’aide du test afin de comprendre la contribution de la définition des protéines dans la pathogenèse après son développement.

Cette technique de préparation d’une protéine supérieure hyper phosphate PA pour la recherche dans le domaine, de nombreuses maladies pour explorer nos thérapies et le développement de médicaments.