A Step Beyond BRET: Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL)
23 mai 2014
Extension de la fondation et de l'applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d'anticorps ciblés.
L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer la simplicité du carburant et d'observer la génération de photons rouges dus à des événements d'émission par excitation radiative. Ceci est réalisé en combinant des bactéries bioluminescentes et des nanoparticules luminescentes pour la production de carburant. Ensuite, un lecteur de plaque à bioluminescence est utilisé pour observer les photons rouges résultants qui émanent du carburant. Les résultats obtenus montrent qu'une quantité importante de photons rouges peut être produite lorsque les bactéries bioluminescentes et les points quantiques sont maintenus en solution conjointe.
Sur la base de l'augmentation observée du flux de photons rouges, les implications de cette technique vont jusqu'à remettre en question le paradigme du transfert d'entrée résidentielle NCE ou de Brett. Ce phénomène est souvent rapporté dans la littérature à partir de colonies individuelles. À partir de colonies individuelles, préparer des cultures sur plaque de culture standard avec des bactéries bioluminescentes en culture nocturne.
Ici, des Vibrio Fisher Eye ont été utilisés le jour de l'expérimentation. Initiez des sous-cultures fraîches et laissez-les croître jusqu'à l'obtention d'une densité optique (DO) à 600 nanomètres comprise entre 1 et 1,5. Utilisez des bactéries à des stades de croissance similaires, au cours desquels elles produisent des signaux intenses, afin d'obtenir des résultats comparables.
Combiner des aliquotes de 100 microlitres provenant de chacun avec soit cinq microlitres de la sonde fluorescente, QD 7 0 5, soit du sérum physiologique. Ajouter ensuite le mélange à 895 microlitres de sérum physiologique dans des cuvettes spectroscopiques standards. Placer les cuvettes remplies dans un imageur bioluminescent pour animaux entiers et effectuer les mesures avec les jeux de filtres appropriés.
Ici, le filtre d'émission de 710 à 730 nanomètres a été utilisé pour effectuer le carburant à différentes distances. Remplissez deux cuvettes photométriques en plastique de volume réduit avec soit 50 microlitres de QD 7 0 5, soit 97,2 microlitres de microsphères de polystyrène non fluorescentes de 48 nanomètres, dans un volume total d'un millilitre de solution saline physiologique. Cela garantit une surface solide par volume total similaire entre les deux entités.
Préparez une source de lumière qve en entourant une troisième qve avec du ruban adhésif noir standard ou tout autre matériau opaque capable de bloquer la lumière. Préparez soigneusement deux fenêtres optiques identiques sur des côtés opposés du vete. Ajoutez un aliquot d’un millilitre de Vibrio fii ou d’une autre culture provenant d’une sous-culture fraîche dans le vete de la source lumineuse et recouvrez-le d’un matériau opaque tel que du papier noir afin de réduire toute contamination lumineuse.
Placez ensuite les cuvettes précédemment remplies directement de chaque côté de la source lumineuse vete dans l'appareil d'imagerie. Visualisez les trois Q vets à l'aide des filtres d'émission appropriés, tels que le filtre de lumière totale et les filtres d'émission de 710 à 730 nanomètres, avec des temps d'exposition respectifs de 10, 30 et 30 secondes. Acquérez une image de fluorescence avec une excitation de 450 à 480 nanomètres et une émission de 710 à 730 nanomètres afin de valider la position des QD 7 0 5.
Repositionnez les deux Q vets externes à des distances équivalentes mais plus éloignées du Q vet central. Ensuite, visualisez et acquérez une image de fluorescence avant de répéter ce processus jusqu'à l'obtention d'une distance finale en vis-à-vis de trois centimètres. Remplissez deux cuvettes de volume réduit avec des solutions d'un millilitre contenant, d'une part, un fluoro quatre ou une nanoparticule fluorescente d'intérêt, et, d'autre part, une solution saline physiologique contenant des nanoparticules non fluorescentes servant de contrôle négatif.
Ajoutez un aliquot de un millilitre de Vibrio FII frais ou d'autres bactéries bioluminescentes dans une troisième cuvette assombrie contenant deux fenêtres optiques physiquement identiques situées sur des côtés opposés ; recouvrez la cuvette d'une substance opaque telle qu'un morceau de papier noir à une courte distance, mais égale. Placez les deux cuvettes de volume réduit de chaque côté de la cuvette Q assombrie et observez à l’aide des filtres appropriés ; ici, une distance de 0,7 centimètre a été utilisée. Répétez l’opération avec l’autre paire de forces de la qd 7 0 5 appliquée aux bactéries.
Une augmentation importante du nombre de photons rouges est observée par rapport aux bactéries seules. Le transfert d'énergie de contrôle peut se produire sur de longues distances en l'absence de tout absorbeur. Cette dépendance à la distance peut être caractérisée par la loi de l'inverse du carré.
Pour les sources ponctuelles. Le ciblage des florafours sur la membrane bactérienne semble avoir peu ou pas d'effet sur la quantité totale de signal de carburant générée. Dans ce contexte, le carburant ciblé est maintenu même après plusieurs étapes de lavage.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment reconstituer un carburant selon plusieurs modalités afin de produire des photons rouges à partir d'événements d'émission par excitation radiative.
Aperçu
Cette étude explore la technique de fluorescence par excitation non liée à partir de luminescence (FUEL), démontrant sa compatibilité avec divers fluorophores et conditions ciblées par anticorps. L'expérience illustre la production de photons rouges par l'interaction de bactéries bioluminescentes et de nanoparticules luminescentes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Techniques de fluorescence
- Bioluminescence
- Interactions des nanoparticules
Contexte
- FUEL est une nouvelle technique de fluorescence.
- Elle utilise des bactéries bioluminescentes pour la génération de photons.
- La compatibilité avec divers fluorophores est essentielle pour son application.
- La compréhension de la génération de photons peut influencer la recherche en fluorescence.
Objectif de l'étude
- Montrer la simplicité de la technique FUEL.
- Observer la génération de photons rouges à partir d'interactions bioluminescentes.
- Évaluer les implications de la technique FUEL sur les paradigmes de fluorescence existants.
Méthodes utilisées
- Combinaison de bactéries bioluminescentes et de nanoparticules luminescentes.
- Utilisation d'un lecteur de plaque à bioluminescence pour la mesure des photons.
- Préparation de solutions avec des distances variables pour l'observation des photons.
- Visualisation au moyen de filtres d'émission spécifiques afin de valider les résultats.
Résultats principaux
- Une production importante de photons rouges a été observée.
- La dépendance de la génération de photons par rapport à la distance a été caractérisée.
- Le ciblage des fluorophores vers les membranes bactériennes a montré un effet minimal sur le signal.
- FUEL peut fonctionner efficacement sur de longues distances en l'absence d'absorbants.
Conclusions
- FUEL est une technique prometteuse pour les applications de fluorescence.
- Elle remet en question les paradigmes existants en recherche sur la fluorescence.
- Une exploration plus poussée de FUEL peut améliorer les études sur la bioluminescence.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
FUEL étend la distance de travail de l'excitation basée sur la luminescence au-delà des limites nanométriques de la BRET, permettant la génération de signaux sur des échelles allant du micromètre au centimètre en l'absence d'absorbeurs. Cette capacité comble un fossé spatial critique en imagerie moléculaire, soutenant des applications où les méthodes traditionnelles de transfert d'énergie échouent. Pour la recherche et le développement en biopharmacie, FUEL offre une approche évolutible et compatible avec les marqueurs afin d'explorer les interactions biologiques au sein de structures cellulaires ou tissulaires plus étendues, améliorant ainsi la validation des cibles dans des systèmes complexes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des interactions moléculaires à des distances inaccessibles à la BRET, soutenant ainsi la validation de cibles dans des contextes de biomarqueurs rares ou diffus.
- Valeur opérationnelle : Repose sur un simple mélange de sources bioluminescentes et de fluorophores, réduisant la complexité des tests et permettant une compatibilité avec les écrans à haut débit.
- Valeur prédictive : Fournit des signaux quantitatifs en photons rouges corrélés à la proximité des sondes, facilitant l'identification de composés candidats et la réduction des incertitudes mécanistiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Compatible avec divers fluorophores et nanoparticules, permettant une conception souple de tests pour différentes classes de cibles.
- Valeur opérationnelle : La génération du signal persiste après les étapes de lavage, permettant une détection reproductible dans des échantillons hétérogènes.
- Préparation du test : Fonctionne dans une solution saline physiologique standard sans tampons personnalisés, facilitant son intégration dans des plateformes de criblage existantes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet l'imagerie de l'échantillon entier sur de longues distances, facilitant l'extrapolation des modèles in vitro aux modèles in vivo.
- Alignement des biomarqueurs : Le FUEL ciblé par anticorps conserve le signal après liaison, permettant de suivre l'engagement spécifique de la cible à plus grande échelle spatiale.
- Atténuation des risques : Le signal dépendant de la distance suit la loi de l'inverse du carré, offrant un cadre quantitatif prévisible pour la comparaison entre études.
Intégration des pipelines et des flux de travail
FUEL s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage initial d'engagement ciblé à la validation préclinique, notamment lorsque une résolution spatiale allant au-delà de la proximité moléculaire est nécessaire.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant la localisation des cibles et la formation de complexes dans des environnements cellulaires où les sondes peuvent ne pas être en contact direct.
- Écrantage : Permet la standardisation des tests grâce à un signal ajustable en fonction de la distance, améliorant ainsi la reproductibilité entre laboratoires.
- Analytique : Génère un flux photonique rouge quantifiable, mesurable à l’aide d’imageries bioluminescentes standards, permettant l’analyse comparative entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les interactions de liaison in vitro et la détection de signaux au niveau tissulaire, soutenant ainsi la validation de biomarqueurs dans des modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Nécessite uniquement une source bioluminescente et un fluorophore, ce qui en fait une technologie portable et peu coûteuse, transférable à plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Étend la portée spatiale des dosages basés sur la luminescence, réduisant ainsi les faux négatifs dans le cas de cibles peu abondantes ou largement diffuses.
- Valeur opérationnelle : Supprime la nécessité d'une conjugaison moléculaire précise ou d'une proximité étroite, simplifiant la préparation des réactifs et réduisant la variabilité.
- Valeur stratégique : Améliore la confiance dans les décisions d'orientation (go/no-go) en permettant la détection de cibles qui échappent aux dosages basés sur la BRET en raison de contraintes de distance.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque en fournissant une validation orthogonale de l'interaction avec la cible dans des matrices biologiques complexes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite un accès à des cultures bactériennes bioluminescentes ou à des systèmes luminescents conçus par génie génétique.
- Dépend d'un équipement standard d'imagerie par bioluminescence muni de filtres d'émission décalés vers le rouge (par exemple, 710–730 nm).
- Exige une optimisation de la concentration de la sonde et de l'intensité de la source afin d'éviter la saturation du signal à courte distance.
- Doit tenir compte de la décroissance selon la loi en carré inverse lors de l'interprétation de l'intensité du signal en fonction des distances.
- Est limité par la luminescence de fond dans les échantillons autofluorescents ou diffusants, nécessitant des contrôles appropriés.
