Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d'isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la perméabilité dans des micro-vaisseaux uniques de poumons de rat isolés à l’aide d’une méthode basée sur la fluorescence. Ceci est accompli en isolant d’abord les poumons du rat et en les perfusant avec du sang autologue. La deuxième étape de la procédure consiste à insérer un microcathéter auriculaire gauche dans une petite région du poumon pour perfuser la flore à quatre étiquettes de dextrine.

Ensuite, pendant que la dextrine marquée est perfusée, des images des micro-vaisseaux pulmonaires sont recueillies. La dernière étape consiste à quantifier la perméabilité des microvaisseaux uniques à partir des images à l’aide d’un logiciel. En fin de compte, les résultats peuvent montrer le degré de perméabilité des microvaisseaux pulmonaires dans différentes conditions, comme après un traitement LPS.

La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Kava Kasami, un boursier postdoctoral de mon laboratoire, en effectuant une trachéotomie sur un rat mâle dans un plan chirurgical d’anesthésie confirmé. Utilisez une canule trachéale PE 90 et fixez-la avec des sutures. Ensuite, perfrez le cœur avec 100 à 200 unités d’héparine à l’aide d’une aiguille papillon de calibre 21.

Attendez une minute, puis exsanguez le sang. Récupérez le sang et mettez-le de côté avec une solution saline. Remplissez deux canules faites d’un tube tigon de trois millimètres de quatre centimètres de long et évasé à une extrémité.

Effectuez maintenant une thoracotomie. Faites une incision juste assez grande pour que la canule puisse pénétrer dans le ventricule droit et glissez-la dans la tanière évasée d’une canule vers l’artère pulmonaire. Fixez la canule avec des sutures.

Utilisez la même technique pour insérer l’autre canule dans l’apex du ventricule gauche vers l’oreillette gauche. Fixez-le avec du ruban ombilical de deux millimètres de large. Retirez maintenant les tissus conjonctifs gênants et retirez le long et le cœur avec les canules.

Transférez-les dans une boîte de Pétri avec la surface diaphragmatique du poumon vers le haut et les trois canules toutes alignées. Déplacez la préparation disséquée vers une platine réglable équipée d’un tube tigon numéro 18 fixé à des transducteurs de pression qui servent de tubes d’entrée et de sortie. Mélangez maintenant la collection de sang avec un volume égal de solution d’albumine à 5 %.

Ajoutez ce mélange dans le réservoir de chargement. Démarrez la pompe à 14 millilitres par minute. Assurez-vous que le tube n’a pas de bulles d’air.

Lors de la préparation. Fixez l’artère pulmonaire au tube d’entrée du poumon et la canule auriculaire gauche au tube de sortie. Vérifiez qu’il n’y a pas d’air dans le tube et vérifiez également que le shunt est ouvert.

Connectez la canule trachéale à un troisième transducteur de pression. Gonflez les poumons via la canule trachéale avec 30 % d’oxygène. Maintenez les poumons à cinq centimètres de pression de l’eau.

Fixez maintenant le shunt et démarrez la pompe à 14 millilitres par minute. Pour commencer la perfusion pulmonaire pendant la perfusion, ajustez la pompe pour maintenir la pression pulmonaire à environ 10 centimètres d’eau et maintenir la pression auriculaire gauche à trois centimètres d’eau. Commencez par préparer le poumon infusé de sang.

Tout d’abord, construisez un cathéter de perfusion à partir d’une longueur de 40 centimètres de tube PE 10 insérée dans une longueur de 30 centimètres de tube PE 90. Fixez l’autre extrémité du tube PE 10 à une aiguille de calibre 30 attachée à une seringue d’un cc. Amenez l’extrémité de la tubulure attachée au poumon au-dessus de la préparation et fixez-y le cathéter de perfusion.

Guidez le cathéter de perfusion vers l’oreillette gauche, puis dans le poumon jusqu’à ce qu’il rencontre une résistance. Une force excessive blessera le poumon. Une bonne incision du microcathéter est essentielle, car tout dommage au poumon par le microcathéter réduira le succès du protocole.

Ensuite, remplissez la seringue avec des sonneries et fixez-la à une pompe. Infusez lentement la solution à un rythme de 10 microlitres par minute. Peu à peu, le site de perfusion deviendra pâle par rapport au reste du poumon pour maintenir la surface pulmonaire humide rapidement dans le plastique, à l’exception du site de perfusion.

Maintenant, pour visualiser le poumon, créez une fenêtre d’observation en attachant un joint torique à une lamelle de 22 millimètres. À l’aide de graisse pour robinet d’arrêt, fixez le joint torique à un support de tube à essai. Positionnez ensuite la fenêtre sur le site de perfusion.

Complétez la configuration en balançant un objectif 20x sur la lamelle et en vous concentrant sur le poumon. Aucune distorsion visuelle n’est attendue. Perfuser maintenant le poumon avec une solution de votre choix.

Dans cet exemple, après la solution saline, un millilitre de dextrine conjuguée ZI est perfusé dans le poumon via le pousse-seringue pendant 60 minutes. À l’aide du logiciel d’imagerie, enregistrez une image par minute pendant la perfusion d’une heure et continuez l’enregistrement pendant le lavage suivant. Étape pendant 10 minutes de plus Après la perfusion de la dextrine Fitz, lavez-la en perfusant la solution de résonance pulmonaire pendant au moins 10 minutes supplémentaires au même débit. Plus tard. Lors de l’analyse des images acquises, notez l’intensité maximale de fluorescence dans la région d’intérêt pendant la perfusion.

Ensuite, notez l’intensité de fluorescence maximale de la fluorescence résiduelle après le lavage de 10 minutes. Les modifications de la perméabilité vasculaire ont été étudiées à l’aide de la perfusion de dextrine fitzy après un traitement par lipopolysaccharide bactérien, car il s’agit d’un modèle largement utilisé d’un LI. De plus, par rapport à la perfusion de Ringer, la perfusion LPS a provoqué une réduction significative de l’indice de perméabilité, ce qui suggère une augmentation globale de la perméabilité dans tous les vaisseaux du champ d’image.

De plus, par rapport à la perfusion de Ringer, la perfusion LPS a provoqué une réduction significative de l’indice de perméabilité, ce qui suggère une augmentation globale de la perméabilité dans tous les vaisseaux du champ d’image. Après avoir regardé cette vidéo, il devrait avoir une bonne compréhension de la préparation de poumons de prophylaxie d’oiseaux isolés, de l’insertion d’un microcathéter de la queue gauche et de la définition de la perméabilité en micro.