Name: Analyse automatisée de dynamique Ca 2 + Signaux de séquences dimages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Découvrez l'analyse automatisée des signaux calciques endothéliaux dans les artères coronaires de porc. Cette méthode réduit les biais utilisateur et améliore la fiabilité des mesures physiologiques en imagerie calcium.

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Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de subventions à la santé HL-085887, HL-092992, S10RR027535, et MOP-93676.

1. Dissection du navire et de l&#39;imagerie <ol><li> tissu de récolte de porcs domestiques mineurs comme décrit dans Martens et al 27. Placez ventricules droit porc récoltés dans un polydiméthylsiloxane (PDMS) plat de dissection fond contenant HEPES solution saline tamponnée physiologique (PSS). <ol><li> A l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope, disséquer et enlever une partie de la descendante antérieure gauche Artère coronaire (~ de longueur 8 mm, diamètre 0,5 mm) dans les tissus adjacents à l&#39;aide des pinces et des ciseaux à ressort en enlevant le segment de vaisseau à partir des couches de tissu cardiaque environnantes. REMARQUE: Prenez soin de ne pas percer la paroi du vaisseau. </li><li> Placez un bloc de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) dans le plat de dissection, et utiliser une aiguille à la broche au fond. Couper un fil de tungstène d&#39;environ 40 um de diamètre en douze segments ~ 0,3 cm de longueur, formant micropointes, et placez-les dans le plat. En utilisant des pinces, fixer une extrémité du segment de vaisseau de la séquence ayant une Micropin. </li><li> Insérez délicatement petits ciseaux à ressort dans la lumière du vaisseau, et couper longitudinalement sur un côté du navire pour l&#39;ouvrir complètement. Orientez le segment de vaisseau ouvert avec l&#39;endothélium haut. </li><li> Utilisez les micropointes restant à sécuriser les frontières du segment de vaisseau ouvert pour bloquer telle que le navire constitue un rectangle plat. NOTE: les dessus de Micropin doivent être pliés à 90 ° et jusqu&#39;à insérés en affleurement avec la surface du bloc. Il faut prendre soin d&#39;étirer la préparation du navire sans surexploiter; largeur finale devrait être ~ 1,5 x la largeur non étirée de départ. </li><li> Préparer un petit volume (environ 1 ml) de Fluo-4 solution AM de chargement par le mélange Fluo-4 AM (10 uM) dissoute dans du DMSO avec Pluronic (0,03%) dans un tampon HEPES tamponné PSS (contenant en mM: 134 NaCl, 6 KCl , une MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), et insérer le bloc entier dans la solution de charge pendant environ 40 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Après le chargement, laver le bloc dans tamponnée HEPESPSS pendant 5-10 min. </li><li> Monter le bloc sur 50-100 um entretoises d&#39;épaisseur dans une chambre inférieure lamelle contenant tamponnée HEPES PSS. NOTE: les repères de métal peuvent être utilisées comme entretoises et assurent le segment de vaisseau est orientée vers le bas et ne se touchant pas les éléments d&#39;espacement. </li><li> Placer la chambre sur la platine d&#39;un microscope inversé équipé pour l&#39;imagerie confocale, et se concentrer sur la couche de cellules endothéliales. </li><li> image laps de temps de capture des séquences de fluorescence relative de base pour ~ 3 min à un grossissement de 20x et un taux de ~ 8 images par seconde en utilisant le logiciel séquence d&#39;aquisition d&#39;image confocale de cadre. </li><li> Après ~ 3 min d&#39;enregistrement fluorescence basale, remplacer une solution tamponnée HEPES PSS avec le même volume (~ 1 ml) de substance P (100 pM) dissous dans tamponnée HEPES PSS, et record pour une addtional 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Analyse automatique <ol><li> Rendre séquence (s) de l&#39;image de l&#39;activité du calcium fluorescent à partir du logiciel d&#39;acquisition en tant que confocal à 8 bits, grayscale fichiers «. tif&quot; format avec aucune information à grande échelle. </li><li> Ouvrir ImageJ, cliquez sur &#39;Ouvrir&#39; dans le menu Fichier, puis sélectionnez la séquence d&#39;image approprié dans la fenêtre de l&#39;explorateur pour voir la séquence (s) de l&#39;image dans ImageJ. </li><li> Déterminer un diamètre approprié de la ROI à l&#39;aide de l&#39;outil de ROI rectangulaire pour estimer des limites supérieure et inférieure de la propagation spatiale de l&#39;activité à l&#39;intérieur de la séquence (s) d&#39;image. REMARQUE: Le diamètre moyen rectangulaire est un choix approprié pour un diamètre de ROI. </li><li> Créez un nouveau dossier sur le disque dur de l&#39;ordinateur, et ajouter la séquence (s) de l&#39;image dans le répertoire du dossier. </li><li> Dans ImageJ, cliquez sur la fenêtre &#39;plugins, puis cliquez sur «LC_Pro&#39; pour lancer l&#39;analyse. </li><li> Entrez la valeur de retour sur investissement de diamètre et sélectionner la valeur de seuil de filtration (soit 0,05 ou 0,01). </li><li> Cliquez sur la case «traitement de la toxicomanie» et entrez les valeurs des points de temps immédiatement avant et après la drogue a été ajouté (en secondes). </li><li> Cliquez sur «OK», etentrer dans le répertoire de séquences d&#39;images dans la fenêtre explorateur de fichiers. </li></ol> 3. Sortie graphique <ol><li> Télécharger la version 3.0.2 de R <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Ouvrez la version 32 bits de R. </li><li> Cliquez sur &quot;Fichier&quot;, puis &quot;scénario ouvert» et sélectionnez le script &#39;traceplot.R&#39; R pour générer des rapports graphiques expérimentales. </li><li> Installez le calibrage, et des paquets de gplots en sélectionnant «paquets», «installer des paquets», et en sélectionnant les paquets justificative utile. </li><li> Cliquez sur «Fichier», puis «répertoire de changement» de commande, et utiliser la fenêtre de l&#39;explorateur pour sélectionner le répertoire qui correspond à la sortie de l&#39;analyse LC_Pro. </li><li> Cliquez sur la fenêtre de script, puis le &#39;exécuter tous »commande pour exécuter le script. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
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<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Décodage Ca 2 + signaux complexes au niveau cellulaire et multicellulaire nécessitera des approches expérimentales et analytiques rigoureux. Ici, une approche est décrite dans laquelle résolus séquences d&#39;images confocale de Ca 2 + fluorescence dépendante sont soumis à une analyse automatisée qui identifie et quantifie Ca 2 + signaux statistiquement pertinentes dans les domaines cellulaires intactes Dans le cas spécifique présentés, un segment d&#39;artère a été isolé de coeur de por...

Ca 2 + est un second messager ubiquitaire molécule de signalisation et de Ca 2 + cytosolique niveaux sont très réglementés. Ca 2 + intracellulaire signaux sont complexes et comprennent transitoires isolés, oscillations, et la propagation d&#39;ondes 1 - 4. Contrôle spatial et temporel de Ca 2 + est pensé à la base physiologique spécificité du signal, et donc l&#39;analyse de Ca 2 + modèles de signaux est d&#39;un intérêt considérable pour les chercheurs dans de multiples domaines 5. Colorants Ca 2 + d&#39;indicateurs tels que le Fluo-4 et Fura-2 sont couramment utilisés pour mesurer Ca 2 + signaux intracellulaires avec la microscopie à fluorescence 5-12. Typiquement, Ca 2 + signaux temporels sont évalués comme des changements en fonction du temps de fluorescence moyenne dans une zone définie par l&#39;utilisateur, ou de la région d&#39;intérêt (ROI) 5,6,13 - 16. Actuellement, l&#39;analyse manuelle de ROI est à la fois beaucoup de temps et de travail danstensive, car il oblige les utilisateurs à identifier de nombreux ROI et effectuer des calculs répétitifs 17-19. Ces techniques peuvent également faire l&#39;objet d&#39;une erreur d&#39;utilisation considérable, y compris l&#39;introduction de modes de signaux artificiels et l&#39;exclusion de faible amplitude ou signaux diffus 18,20. Des algorithmes de détection de ROI automatisés ont déjà été mises en œuvre en utilisant une variété de méthodes statistiques pour déterminer le placement de ROI optimal, mais ils ont généralement été limitée à l&#39;analyse de balayage de ligne ou pseudo-ligne des images numérisées, ce qui limite l&#39;analyse à une seule dimension spatiale dans le temps 17, 19-22. En outre, de nombreux algorithmes existants ne sont pas suffisants pour couvrir la diversité de Ca 2 + des événements de relâchement qui vont de périodiques, transitoires localisées à des ondes se propageant 23,24. Évaluation complète de Ca 2 + signaux physiologiques est souvent compliquée par la présence d&#39;image significative artifLoi qui confond signal discrimination de bruit dans de nombreux systèmes expérimentaux. Auparavant, une solution de l&#39;algorithme de détection de ROI automatisé de Ca 2 + signal de détection de transitoires, mis en œuvre sous forme de plugin pour le logiciel NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), a été développé et validé 25,26. Cet algorithme, appelé LC_Pro, a été conçu pour identifier et analyser ROI englobant Ca 2 + transitoires du signal en deux dimensions laps de temps des séquences d&#39;images. Voici un protocole expérimental pratique et de démonstration représentant d&#39;une application de l&#39;algorithme dans porcine endothélium des artères coronaires est fourni, avec post-traitement supplémentaire utilisant l&#39;open source logiciel de traitement statistique R pour générer une sortie graphique utilisable.

<table><tbody><tr><td>Boîte de dissection</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>kit élastomère, doit être moulé dans des boîtes</td></tr><tr><td>HEPES-buffered PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>acid Stereomicroscope</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Pince</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils de science fine</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Fil de tungstène</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Broches métalliques</td><td>Outils de science fine</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Chambre inférieure</td><td></td><td></td> en verre de couverture <td>Conçu sur mesure</td></tr><tr><td>Microscope confocal à disque rotatif</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">télécharger sur : http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin pour imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">télécharger à l’adresse : http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">télécharger sur : http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">télécharger à l’adresse : https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

analyse automatisée de dynamique ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; signaux de séquences d&#39;images

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Ca 2 + intracellulaire signaux sont couramment étudiées avec des colorants fluorescents de Ca2 + de l&#39;indicateur et les techniques de microscopie. Cependant, l&#39;analyse quantitative de Ca 2 + de données d&#39;imagerie prend du temps et soumis à polarisation. Automatisés algorithmes d&#39;analyse de signal selon la région d&#39;intérêt (ROI) de détection ont été mises en œuvre pour les mesures de balayage de ligne unidimensionnelle, mais il n&#39;y a pas de courant algorithme qui intègre l&#39;identification optimisé et l&#39;analyse de ROI dans des séquences d&#39;images en deux dimensions. Voici un algorithme pour l&#39;acquisition rapide et l&#39;analyse de ROI dans des séquences d&#39;images est décrit. Il utilise des ellipses correspondent aux signaux filtrés de bruit afin de déterminer le placement de ROI optimal, et calcule Ca 2 + paramètres de signal d&#39;amplitude, la durée et la diffusion spatiale. Cet algorithme a été mis en œuvre comme un plug-in disponible gratuitement pour ImageJ (NIH) des logiciels. Avec son analyse écrites pour le open source logiciel de traitement statistique R,cette approche fournit un gazoduc à haute capacité pour l&#39;analyse statistique rapide de la production expérimentale. Les auteurs suggèrent que l&#39;utilisation de ce protocole d&#39;analyse conduira à une caractérisation plus complète et impartiale de signalisation physiologique + Ca 2.

Un algorithme personnalisé, LC_Pro, a été développé et mis en œuvre afin d&#39;effectuer une analyse automatisée de Ca 2 + dynamique sur des séquences d&#39;images confocale. Comme le montre la figure 1, l&#39;algorithme utilise des modules de traitement séquentiel que A) détecte et sites piste de dynamique Ca 2 + changer dessus statistique (p &lt;0,01) bruit, B) définir des régions d&#39;intérêt (ROI) automatiquement dans les centres de site actif, et C) calculer l&#39;intensité d...

Voici une nouvelle région d&#39;intérêt protocole d&#39;analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d&#39;analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l&#39;utilisateur et de partialité.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'activité calcique endothéliale dans les artères coronaires de porc à l'aide d'une analyse automatisée de régions d'intérêt (ROI). Pour ce faire, on dissèque et on ouvre les artères coronaires de porc afin de mesurer l'activité calcique endothéliale dans un deuxième temps. Une analyse automatisée de ROI est ensuite réalisée sur les mesures calciques obtenues, ce qui produit un résultat résumé de l'activité calcique.Les scripts logiciels suivants sont ensuite exécutés sur les résultats afin d'analyser statistiquement et de représenter graphiquement les données d'activité calcique. On obtient ainsi des résultats qui montrent les paramètres des transitoires du signal calcique, basés sur l'analyse automatisée des régions d'intérêt (ROI) et le traitement statistique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse manuelle des régions d'intérêt, est que l'analyse automatisée est plus rapide, plus complète et moins sujette aux erreurs de l'utilisateur. Dans cette procédure, placez les ventricules droits de porc récoltés dans la cuve de dissection A-P-D-M-S contenant un excès de solut

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Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Dans les myocytes cardiaques, les structures membranaires tubulaires forment des réseaux intracellulaires. Nous décrivons les protocoles pour i) l'isolement des myocytes du cœur de souris, y compris le contrôle de qualité, ii) la coloration de cellules vivantes pour la microscopie de fluorescence état-of-the-art optimisé, et iii) l'analyse d'image directe de quantifier la complexité des composants et la plasticité de la membrane intracellulaire réseaux.

Analyse de la membrane tubulaire Networks cardiaque myocytes de oreillettes et les ventricules

Nous présentons ici des techniques d’imagerie des événements Ca2+ médiés par IP3 locaux à l’aide de la microscopie à fluorescence dans des cellules de mammifères intactes chargées d’indicateurs Ca2+ ainsi qu’un algorithme qui automatise l’identification et l’analyse de ces événements.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Nous présentons une solution logicielle pour le suivi semi automatisé de la concentration relative de protéines sur toute la longueur des protrusions cellulaires dynamiques.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Nous présentons un protocole pour la détection optique en temps réel des protéines sans étiquette simples car elles sont sécrétées par les cellules vivantes. Celle-ci repose sur la microscopie interférométrique diffusion (iSCAT), qui peut être appliquée à une variété de configurations et différents systèmes biologiques.

Label-Free Imaging d’unique protéines sécrétée par les cellules vivant via iSCAT microscopie

Ca2 + indicateurs génétiquement encodés (GECIs) ont radicalement changé comment in situ Ca2 + imagerie est réalisée. Pour optimiser la récupération de données de ces enregistrements, il faut une analyse appropriée des signaux de Ca2 + . Les protocoles dans le présent document facilitent la quantification de Ca2 + des signaux enregistrés sur place à l’aide de la cartographie spatio-temporelle et analyse axée sur les particules.

Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Ce protocole présente des étapes pour acquérir et analyser des images fluorescentes de calcium à partir de péricytes ensanglant le cerveau et des données de flux sanguin provenant de vaisseaux sanguins voisins chez des souris anesthésiées. Ces techniques sont utiles pour l’étude de la physiologie cellulaire murale et peuvent être adaptées pour étudier les transitoires de calcium dans n’importe quel type de cellule.

Calcium péricyte cérébral et imagerie hémodynamique chez des souris transgéniques in vivo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) est un plugin ImageJ open-source pour l’analyse 3D de l’imagerie calcique qui examine le mouvement sur l’axe z et identifie la valeur maximale de chaque pile z pour représenter l’intensité d’une cellule au point de temps correspondant. Il peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais sur des plans z différents.

TACI : un plugin ImageJ pour l’analyse d’imagerie calcique 3D

Dans ce protocole, nous présentons une nouvelle technique d’enregistrement et d’analyse des signaux Ca2+ dans les veines intrapulmonaires (petites veines pulmonaires ou PV) à des pressions intraluminales physiologiques. La technique consiste à isoler de petits PV, à les incuber avec un indicateur Ca2+ , à les canuler et à les pressuriser, à l’imagerie confocale des signaux Ca2+ et à l’analyse des données.

Imagerie des signaux Ca2+ dans les petites veines pulmonaires à des pressions intraluminales physiologiques

Dans ce rapport, nous proposons une nouvelle application de résines photopolymérisables dentaire pour la base de montage des électrodes ou des sondes de microdialyse dans des expériences chroniques. Ce matériel permet un collage direct sur le crâne.

Application de résine photopolymérisable adhésif dentaire pour les électrodes de montage ou des sondes de microdialyse dans les expériences chroniques

Découvrez l'analyse automatisée des signaux calciques endothéliaux dans les artères coronaires de porc. Cette méthode réduit les biais utilisateur et améliore la fiabilité des mesures physiologiques en imagerie calcium.

Analyse automatisée de dynamique Ca

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