Name: Analyse automatisée de dynamique Ca 2 + Signaux de séquences dimages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Découvrez l'analyse automatisée des signaux calciques endothéliaux dans les artères coronaires de porc. Cette méthode réduit les biais utilisateur et améliore la fiabilité des mesures physiologiques en imagerie calcium.

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Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de subventions à la santé HL-085887, HL-092992, S10RR027535, et MOP-93676.

1. Dissection du navire et de l&#39;imagerie <ol><li> tissu de récolte de porcs domestiques mineurs comme décrit dans Martens et al 27. Placez ventricules droit porc récoltés dans un polydiméthylsiloxane (PDMS) plat de dissection fond contenant HEPES solution saline tamponnée physiologique (PSS). <ol><li> A l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope, disséquer et enlever une partie de la descendante antérieure gauche Artère coronaire (~ de longueur 8 mm, diamètre 0,5 mm) dans les tissus adjacents à l&#39;aide des pinces et des ciseaux à ressort en enlevant le segment de vaisseau à partir des couches de tissu cardiaque environnantes. REMARQUE: Prenez soin de ne pas percer la paroi du vaisseau. </li><li> Placez un bloc de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) dans le plat de dissection, et utiliser une aiguille à la broche au fond. Couper un fil de tungstène d&#39;environ 40 um de diamètre en douze segments ~ 0,3 cm de longueur, formant micropointes, et placez-les dans le plat. En utilisant des pinces, fixer une extrémité du segment de vaisseau de la séquence ayant une Micropin. </li><li> Insérez délicatement petits ciseaux à ressort dans la lumière du vaisseau, et couper longitudinalement sur un côté du navire pour l&#39;ouvrir complètement. Orientez le segment de vaisseau ouvert avec l&#39;endothélium haut. </li><li> Utilisez les micropointes restant à sécuriser les frontières du segment de vaisseau ouvert pour bloquer telle que le navire constitue un rectangle plat. NOTE: les dessus de Micropin doivent être pliés à 90 ° et jusqu&#39;à insérés en affleurement avec la surface du bloc. Il faut prendre soin d&#39;étirer la préparation du navire sans surexploiter; largeur finale devrait être ~ 1,5 x la largeur non étirée de départ. </li><li> Préparer un petit volume (environ 1 ml) de Fluo-4 solution AM de chargement par le mélange Fluo-4 AM (10 uM) dissoute dans du DMSO avec Pluronic (0,03%) dans un tampon HEPES tamponné PSS (contenant en mM: 134 NaCl, 6 KCl , une MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), et insérer le bloc entier dans la solution de charge pendant environ 40 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Après le chargement, laver le bloc dans tamponnée HEPESPSS pendant 5-10 min. </li><li> Monter le bloc sur 50-100 um entretoises d&#39;épaisseur dans une chambre inférieure lamelle contenant tamponnée HEPES PSS. NOTE: les repères de métal peuvent être utilisées comme entretoises et assurent le segment de vaisseau est orientée vers le bas et ne se touchant pas les éléments d&#39;espacement. </li><li> Placer la chambre sur la platine d&#39;un microscope inversé équipé pour l&#39;imagerie confocale, et se concentrer sur la couche de cellules endothéliales. </li><li> image laps de temps de capture des séquences de fluorescence relative de base pour ~ 3 min à un grossissement de 20x et un taux de ~ 8 images par seconde en utilisant le logiciel séquence d&#39;aquisition d&#39;image confocale de cadre. </li><li> Après ~ 3 min d&#39;enregistrement fluorescence basale, remplacer une solution tamponnée HEPES PSS avec le même volume (~ 1 ml) de substance P (100 pM) dissous dans tamponnée HEPES PSS, et record pour une addtional 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Analyse automatique <ol><li> Rendre séquence (s) de l&#39;image de l&#39;activité du calcium fluorescent à partir du logiciel d&#39;acquisition en tant que confocal à 8 bits, grayscale fichiers «. tif&quot; format avec aucune information à grande échelle. </li><li> Ouvrir ImageJ, cliquez sur &#39;Ouvrir&#39; dans le menu Fichier, puis sélectionnez la séquence d&#39;image approprié dans la fenêtre de l&#39;explorateur pour voir la séquence (s) de l&#39;image dans ImageJ. </li><li> Déterminer un diamètre approprié de la ROI à l&#39;aide de l&#39;outil de ROI rectangulaire pour estimer des limites supérieure et inférieure de la propagation spatiale de l&#39;activité à l&#39;intérieur de la séquence (s) d&#39;image. REMARQUE: Le diamètre moyen rectangulaire est un choix approprié pour un diamètre de ROI. </li><li> Créez un nouveau dossier sur le disque dur de l&#39;ordinateur, et ajouter la séquence (s) de l&#39;image dans le répertoire du dossier. </li><li> Dans ImageJ, cliquez sur la fenêtre &#39;plugins, puis cliquez sur «LC_Pro&#39; pour lancer l&#39;analyse. </li><li> Entrez la valeur de retour sur investissement de diamètre et sélectionner la valeur de seuil de filtration (soit 0,05 ou 0,01). </li><li> Cliquez sur la case «traitement de la toxicomanie» et entrez les valeurs des points de temps immédiatement avant et après la drogue a été ajouté (en secondes). </li><li> Cliquez sur «OK», etentrer dans le répertoire de séquences d&#39;images dans la fenêtre explorateur de fichiers. </li></ol> 3. Sortie graphique <ol><li> Télécharger la version 3.0.2 de R <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Ouvrez la version 32 bits de R. </li><li> Cliquez sur &quot;Fichier&quot;, puis &quot;scénario ouvert» et sélectionnez le script &#39;traceplot.R&#39; R pour générer des rapports graphiques expérimentales. </li><li> Installez le calibrage, et des paquets de gplots en sélectionnant «paquets», «installer des paquets», et en sélectionnant les paquets justificative utile. </li><li> Cliquez sur «Fichier», puis «répertoire de changement» de commande, et utiliser la fenêtre de l&#39;explorateur pour sélectionner le répertoire qui correspond à la sortie de l&#39;analyse LC_Pro. </li><li> Cliquez sur la fenêtre de script, puis le &#39;exécuter tous »commande pour exécuter le script. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
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<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Décodage Ca 2 + signaux complexes au niveau cellulaire et multicellulaire nécessitera des approches expérimentales et analytiques rigoureux. Ici, une approche est décrite dans laquelle résolus séquences d&#39;images confocale de Ca 2 + fluorescence dépendante sont soumis à une analyse automatisée qui identifie et quantifie Ca 2 + signaux statistiquement pertinentes dans les domaines cellulaires intactes Dans le cas spécifique présentés, un segment d&#39;artère a été isolé de coeur de por...

Ca 2 + est un second messager ubiquitaire molécule de signalisation et de Ca 2 + cytosolique niveaux sont très réglementés. Ca 2 + intracellulaire signaux sont complexes et comprennent transitoires isolés, oscillations, et la propagation d&#39;ondes 1 - 4. Contrôle spatial et temporel de Ca 2 + est pensé à la base physiologique spécificité du signal, et donc l&#39;analyse de Ca 2 + modèles de signaux est d&#39;un intérêt considérable pour les chercheurs dans de multiples domaines 5. Colorants Ca 2 + d&#39;indicateurs tels que le Fluo-4 et Fura-2 sont couramment utilisés pour mesurer Ca 2 + signaux intracellulaires avec la microscopie à fluorescence 5-12. Typiquement, Ca 2 + signaux temporels sont évalués comme des changements en fonction du temps de fluorescence moyenne dans une zone définie par l&#39;utilisateur, ou de la région d&#39;intérêt (ROI) 5,6,13 - 16. Actuellement, l&#39;analyse manuelle de ROI est à la fois beaucoup de temps et de travail danstensive, car il oblige les utilisateurs à identifier de nombreux ROI et effectuer des calculs répétitifs 17-19. Ces techniques peuvent également faire l&#39;objet d&#39;une erreur d&#39;utilisation considérable, y compris l&#39;introduction de modes de signaux artificiels et l&#39;exclusion de faible amplitude ou signaux diffus 18,20. Des algorithmes de détection de ROI automatisés ont déjà été mises en œuvre en utilisant une variété de méthodes statistiques pour déterminer le placement de ROI optimal, mais ils ont généralement été limitée à l&#39;analyse de balayage de ligne ou pseudo-ligne des images numérisées, ce qui limite l&#39;analyse à une seule dimension spatiale dans le temps 17, 19-22. En outre, de nombreux algorithmes existants ne sont pas suffisants pour couvrir la diversité de Ca 2 + des événements de relâchement qui vont de périodiques, transitoires localisées à des ondes se propageant 23,24. Évaluation complète de Ca 2 + signaux physiologiques est souvent compliquée par la présence d&#39;image significative artifLoi qui confond signal discrimination de bruit dans de nombreux systèmes expérimentaux. Auparavant, une solution de l&#39;algorithme de détection de ROI automatisé de Ca 2 + signal de détection de transitoires, mis en œuvre sous forme de plugin pour le logiciel NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), a été développé et validé 25,26. Cet algorithme, appelé LC_Pro, a été conçu pour identifier et analyser ROI englobant Ca 2 + transitoires du signal en deux dimensions laps de temps des séquences d&#39;images. Voici un protocole expérimental pratique et de démonstration représentant d&#39;une application de l&#39;algorithme dans porcine endothélium des artères coronaires est fourni, avec post-traitement supplémentaire utilisant l&#39;open source logiciel de traitement statistique R pour générer une sortie graphique utilisable.

<table><tbody><tr><td>Boîte de dissection</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>kit élastomère, doit être moulé dans des boîtes</td></tr><tr><td>HEPES-buffered PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>acid Stereomicroscope</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Pince</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils de science fine</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Fil de tungstène</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Broches métalliques</td><td>Outils de science fine</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Chambre inférieure</td><td></td><td></td> en verre de couverture <td>Conçu sur mesure</td></tr><tr><td>Microscope confocal à disque rotatif</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">télécharger sur : http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin pour imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">télécharger à l’adresse : http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">télécharger sur : http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>R traceplot script</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">télécharger à l’adresse : https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

analyse automatisée de dynamique ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; signaux de séquences d&#39;images

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Ca 2 + intracellulaire signaux sont couramment étudiées avec des colorants fluorescents de Ca2 + de l&#39;indicateur et les techniques de microscopie. Cependant, l&#39;analyse quantitative de Ca 2 + de données d&#39;imagerie prend du temps et soumis à polarisation. Automatisés algorithmes d&#39;analyse de signal selon la région d&#39;intérêt (ROI) de détection ont été mises en œuvre pour les mesures de balayage de ligne unidimensionnelle, mais il n&#39;y a pas de courant algorithme qui intègre l&#39;identification optimisé et l&#39;analyse de ROI dans des séquences d&#39;images en deux dimensions. Voici un algorithme pour l&#39;acquisition rapide et l&#39;analyse de ROI dans des séquences d&#39;images est décrit. Il utilise des ellipses correspondent aux signaux filtrés de bruit afin de déterminer le placement de ROI optimal, et calcule Ca 2 + paramètres de signal d&#39;amplitude, la durée et la diffusion spatiale. Cet algorithme a été mis en œuvre comme un plug-in disponible gratuitement pour ImageJ (NIH) des logiciels. Avec son analyse écrites pour le open source logiciel de traitement statistique R,cette approche fournit un gazoduc à haute capacité pour l&#39;analyse statistique rapide de la production expérimentale. Les auteurs suggèrent que l&#39;utilisation de ce protocole d&#39;analyse conduira à une caractérisation plus complète et impartiale de signalisation physiologique + Ca 2.

Un algorithme personnalisé, LC_Pro, a été développé et mis en œuvre afin d&#39;effectuer une analyse automatisée de Ca 2 + dynamique sur des séquences d&#39;images confocale. Comme le montre la figure 1, l&#39;algorithme utilise des modules de traitement séquentiel que A) détecte et sites piste de dynamique Ca 2 + changer dessus statistique (p &lt;0,01) bruit, B) définir des régions d&#39;intérêt (ROI) automatiquement dans les centres de site actif, et C) calculer l&#39;intensité d...

Voici une nouvelle région d&#39;intérêt protocole d&#39;analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d&#39;analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l&#39;utilisateur et de partialité.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'activité calcique endothéliale dans les artères coronaires de porc à l'aide d'une analyse automatisée de régions d'intérêt (ROI). Pour ce faire, on dissèque et on ouvre les artères coronaires de porc afin de mesurer l'activité calcique endothéliale dans un deuxième temps. Une analyse automatisée de ROI est ensuite réalisée sur les mesures calciques obtenues, ce qui produit un résultat résumé de l'activité calcique.Les scripts logiciels suivants sont ensuite exécutés sur les résultats afin d'analyser statistiquement et de représenter graphiquement les données d'activité calcique. On obtient ainsi des résultats qui montrent les paramètres des transitoires du signal calcique, basés sur l'analyse automatisée des régions d'intérêt (ROI) et le traitement statistique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse manuelle des régions d'intérêt, est que l'analyse automatisée est plus rapide, plus complète et moins sujette aux erreurs de l'utilisateur. Dans cette procédure, placez les ventricules droits de porc récoltés dans la cuve de dissection A-P-D-M-S contenant un excès de solution saline physiologique tamponnée.Sous le microscope stéréo, retirer un segment de l'artère coronaire descendante antérieure gauche en le disséquant des couches tissulaires cardiaques environnantes. Prendre soin de ne pas percer la paroi du vaisseau. Ensuite, placer le bloc de PDMS dans la cuve de dissection et utiliser une aiguille pour l'attacher au fond.Ajoutez du tampon dans la boîte. Ensuite, coupez un fil de tungstène d'environ 40 micromètres de diamètre en 12 segments de 0,3 centimètre de longueur pour former des micro-épingles, puis placez-les dans la boîte. Utilisez la pince pour fixer une extrémité du segment de vaisseau au bloc à l’aide d’une micro-épingle.Insérez soigneusement les petites ciseaux à ressort dans la lumière du vaisseau et incisez longitudinalement un côté du vaisseau afin de l'ouvrir complètement. Ensuite, positionnez le segment de vaisseau ouvert avec l'endothélium vers le haut. Utilisez les broches micro restantes pour fixer les bords du segment de vaisseau ouvert sur le bloc de manière à former un rectangle plat.Ensuite, préparez un millilitre de solution de chargement flu oh 4:00 AM. Placez le bloc entier dans la solution de chargement pendant environ 40 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Après le chargement, lavez le bloc et le tampon PSS pendant cinq à dix minutes. Par la suite, montez le bloc sur des entretoises de 50 à 100 microns d'épaisseur dans une chambre à fond en verre couvre-objet contenant du PSS tamponné.Placer la chambre sur la platine d’un microscope inversé équipé pour l’imagerie confocale et focaliser sur la couche de cellules endothéliales à l’aide d’un logiciel d’acquisition séquentielle d’images confocales afin d’obtenir des séquences d’images en fonction du temps de la fluorescence relative de base pendant trois minutes, avec un grossissement de 20 x et une fréquence d’images de huit images par seconde. Après trois minutes d’enregistrement de la fluorescence de base, remplacer la solution PSS tamponnée heaps par le même volume de substance P à 100 picomolaire dissoute dans la solution PSS tamponnée heaps et enregistrer pendant trois minutes supplémentaires. Dans cette procédure, exporter la séquence d’images de l’activité calcique fluorescente provenant du logiciel d’acquisition confocale sous forme d’un fichier TIFF en niveaux de gris 8 bits sans information d’échelle.Ensuite, ouvrez l’image dans ImageJ. Cliquez sur Ouvrir dans le menu Fichier et sélectionnez la séquence d’images appropriée dans la fenêtre de l’explorateur. Pour visualiser la séquence d’images dans ImageJ, déterminez une région d’intérêt (ROI) appropriée en utilisant l’outil ROI rectangulaire afin d’estimer les limites supérieure et inférieure de l’étendue spatiale de l’activité au sein de la séquence d’images. Ensuite, créez un nouveau dossier sur le disque dur de l’ordinateur et ajoutez-y la séquence d’images dans le répertoire du dossier.Dans ImageJ, cliquez sur la fenêtre Plugins, puis cliquez sur LC Pro. Pour démarrer l'analyse, saisissez la valeur du diamètre de la région d'intérêt (ROI) et sélectionnez la valeur du seuil de filtration après le mot.Cliquez sur la case d'option du traitement médicamenteux et saisissez les valeurs des points temporels immédiatement avant et après l'ajout du médicament. Ensuite, cliquez sur OK et saisissez le répertoire de la séquence d'images dans la fenêtre de l'explorateur de fichiers. Dans cette étape, téléchargez la version 3.0 0.2 de R et installez-la.Ensuite, ouvrez la version 32 bits de R. Cliquez ensuite sur Fichier. Puis ouvrez le script et sélectionnez le script de tracé RR pour générer des rapports expérimentaux graphiques. Installez les packages calibrate et gpls en sélectionnant Packages.Installez les paquets, puis sélectionnez les paquets appropriés. Cliquez sur Fichier, puis sur la commande Changer le répertoire et utilisez la fenêtre de l'explorateur pour sélectionner le répertoire correspondant aux résultats d'analyse de lc pro. Cliquez ensuite sur la fenêtre de script, puis sur la commande Exécuter tout pour exécuter le script ici.Les images en lapse de temps d'une séquence d'images d'entrée, avec un intervalle d'échantillonnage basal suivi d'un intervalle d'échantillonnage stimulé par la substance P, sont présentées en séquences d'images en niveaux de gris. Les meilleures lysses pour les intervalles basal et stimulé ont été rendues à l'aide de lc Pro, et les courbes d'intensité normalisées dépendantes du temps, issues de chaque ROI positionné automatiquement, sont affichées ici. Des histogrammes de l'amplitude maximale, de la durée à demi-maximum et de l'étendue spatiale maximale, pour les événements contrôle et stimulés par la substance P, provenant d'une expérience représentative, ont été générés en utilisant R pour le traitement graphique des données de sortie de lc Pro.Notamment, la stimulation par la substance P a augmenté le nombre d'événements et entraîné un décalage significatif vers la droite de l'amplitude médiane et de la durée, selon un test U de Mann-Whitney. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de minimiser les artefacts d'image dus au déplacement du plan focal ou à des réglages de contraste incorrects, car cela pourrait fortement affecter les résultats de l'analyse.

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