Name: siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez une méthode de criblage siRNA ciblée pour identifier de nouveaux régulateurs des systèmes ubiquitine et ubiquitine-like dans la réponse à l'hypoxie HIF1A. Cette approche rapide et économique permet d'étudier des voies biologiques spécifiques.

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Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) et l&#39;Institut écossais pour Signalisation cellulaire (qui fait maintenant partie de la phosphorylation de la protéine MRC et de l&#39;unité de ubiquitylation).

<ol><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458, 422-429 (2009).</li>
<li>Schulman, B. A., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+activation+by+E1+enzymes%3A+the+apex+for+downstream+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).</li>
<li>Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+road+to+reading+the+RNA-interference+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On the road to reading the RNA-interference code.</a> Nature. 457, 396-404 (2009).</li>
<li>Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing+by+metazoans%3A+the+central+role+of+the+HIF+hydroxylase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway.</a> Mol Cell. 30, 393-402 (2008).</li>
<li>Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+remodeler+ISWI+regulates+the+cellular+response+to+hypoxia%3A+role+of+FIH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH.</a> Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).</li>
<li>Bhinder, B., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+analyzing+actives+in+random+RNAi+screens%3A+introducing+the+%26%2334%3BH+Score%26%2334%3B+for+hit+nomination+%26+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the &#34;H Score&#34; for hit nomination & gene prioritization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).</li>
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<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li>
<li>Stagg, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRC8+E3+ligase+ubiquitinates+MHC+class+I+molecules+before+dislocation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER.</a> J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF146+is+a+poly%28ADP-ribose%29-directed+E3+ligase+that+regulates+axin+degradation+and+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).</li>
<li>Jackson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR+seed+matches%2C+but+not+overall+identity%2C+are+associated+with+RNAi+off-targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets.</a> Nat Methods. 3, 199-204 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whither+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whither RNAi.</a> Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;utilisation d&#39;écrans de siRNA du génome dans les cellules de mammifères s&#39;est avérée extrêmement utile dans l&#39;identification de nouveaux régulateurs de voies biologiques distinctes. Ici, nous avons décrit l&#39;utilisation d&#39;un écran de siRNA ciblé ubiquitome pour identifier des régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l&#39;hypoxie. Écrans ciblés sont de plus en plus attrayant car ils sont généralement moins cher, plus rapide, plus facile à gérer et rapport uniquement sur ​​les comp...

Modification des protéines avec l&#39;ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules représente un système biochimique expansive qui régule diverses voies biologiques et des réactions de stress. La fixation covalente d&#39;UBL à leurs protéines cibles peut avoir divers effets de régulation de la stabilité, la localisation, la fonction ou interactome du substrat 1. Les étapes enzymatiques sous-jacents UBL modification ont d&#39;abord été établies pour l&#39;ubiquitine, et maintenant servir de paradigme pour la modification avec la plupart des UBL, y compris SUMO, NEDD8, ISG15 et FAT10. Pour la modification de se produire, le groupe carboxylate de la diglycine UBL motif est d&#39;abord activée par une enzyme activant E1 pour former un thiol de haute énergie qui est transférée à la cystéine du site actif d&#39;une enzyme de conjugaison E2. Le E2 interagit ensuite avec une ligase E3 lié au substrat de servir de médiateur de transfert de la LBM sur (habituellement) un résidu de lysine cible création d&#39;une chaîne ramifiée (isopeptidique) 2 tringlerie. Les cycles successifs de modification peuvent se produire pour construire des chaînes isopeptidiques sur le substrat, ce qui peut se produire pour l&#39;ubiquitine à travers l&#39;une de ses sept lysines, ou par l&#39;intermédiaire de sa méthionine N-terminale pour créer des chaînes linéaires d&#39;ubiquitine. Ces modifications font topologies discrètes avec des fins diverses telles que la création de nouveaux motifs d&#39;interaction et le ciblage des protéines pour la dégradation avant l&#39;enlèvement UBL par des protéases spécialisées. Dans le cas de l&#39;ubiquitine E1, il existe deux enzymes, enzymes de conjugaison E2 30 à 40, au moins 600 ligases E3 et environ 100 enzymes deubiquitylating (DUB). Alors que les voies sont moins expansive pour les 10 ou si d&#39;autres UBL, la complexité globale de ubiquitome offre énorme diversité biologique dans le résultat d&#39;une modification UBL particulier. Cependant, alors que des avancées majeures dans UBL biologie ont été faits, les rôles cellulaires précises de la majorité de ces composants ubiquitome restent inconnus. L&#39;utilisation de short interfering acide ribonucléique (siRNA) a émergé comme un outil puissant pour la génétique inverse en raison de la capacité de siRNA pour cibler spécifiquement ARNm cellulaires pour destruction, permettant le rôle des gènes individuels à examiner dans différents contextes biologiques 3. Criblage du génome entier ont été utilisés pour identifier et valider de nouveaux régulateurs de nombreux processus cellulaires, et ont créé une foule de données utiles accessibles à la communauté scientifique au sens large. Cependant, alors que les écrans du génome entier ont révélé extrêmement utile, écrans ciblés sont de plus en plus populaires car ils sont moins chers, plus rapides, moins impliquer la gestion de données et de rapport uniquement sur les membres du génome où le chercheur est le plus intéressé. Par conséquent, afin de mieux comprendre les processus cellulaires UBL composants de la famille sont impliqués, nous avons constitué une bibliothèque siRNA humain ciblant tous connus et prévus des composants de la ubiquitome. Cela inclut les UBL, E1, E2 activation des enzymes conjugaisondes enzymes, des ligases E3, domaine de liaison à l&#39;ubiquitine (DLC) contenant des protéines et des DUBs. Cette bibliothèque peut être utilisée pour l&#39;écran contre un large éventail de lignées cellulaires rapporteurs de problèmes biologiques distinctes, permettant ainsi l&#39;identification objective des nouveaux composants de l&#39;UBL régissant ces voies. Le protocole suivant décrit comment effectuer une rigoureuse siRNA ciblés ubiquitome écran pour identifier de nouveaux régulateurs de la réponse de HIF1A dépendant à l&#39;hypoxie. Sous tension normale d&#39;oxygène, HIF1A est soumise à prolyl hydroxylation qui l&#39;amène à être reconnue et ciblée pour la dégradation par la maladie de Von Hippel Lindau (VHL) E3 complexe ligase 4. L&#39;hypoxie inhibe l&#39;hydroxylation prolyl conduisant à la stabilisation des HIF1A et sa liaison ultérieure à des éléments de réponse à l&#39;hypoxie (HRE) de conduire l&#39;expression du gène. Ici, nous décrivons un écran à l&#39;aide des cellules d&#39;ostéosarcome U20S exprimant de façon stable la luciférase de luciole sous le contrôle de trois copies en tandem de l&#39;HyResponse Element poxia (cellules U20S-EDH) 5. Ce protocole peut être adapté pour n&#39;importe quelle voie biologique si un solide lecture de l&#39;activité du rapporteur est réalisable et peut être couplé avec des témoins positifs et négatifs appropriés.

<table><tbody><tr><td>Distributeur automatique de liquide</td><td>Fluid-X</td><td>XPP-721</td><td>http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td></tr><tr><td>Plaque de dosage à paroi blanche</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td></tr> <tr><td>Film de plaque transparent</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-461</td><td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>On-Target Plus</td><td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td></tr> <tr><td>Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine RNAimax</td><td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td></tr><tr><td>Sérum Réduit Medium</td><td>Invitrogen</td><td>Optimem</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td></tr></tbody></table>

sirna contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Modification post-traductionnelle des protéines avec l&#39;ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules est en train de devenir un réseau de signalisation cellulaire dynamique qui régule diverses voies biologiques, y compris la réponse à l&#39;hypoxie, proteostasis, la réponse aux dommages de l&#39;ADN et la transcription. Pour mieux comprendre comment UBL réglementer les filières pertinentes à la maladie humaine, nous avons compilé un siRNA humain &quot;ubiquitome&quot; bibliothèque composée de 1186 siARN piscines duplex ciblant tous connus et prévus des composants de voies du système UBL. Cette bibliothèque peut être projeté contre un éventail de lignées cellulaires exprimant journalistes de diverses voies biologiques pour déterminer quels composants UBL agissent comme régulateurs positifs ou négatifs de la voie en question. Ici, nous décrivons un protocole utilisant cette bibliothèque pour identifier ubiquitome-régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l&#39;hypoxie en utilisant un rapporteur de luciférase à base de transcription. Un stade de développement de l&#39;essai initialest effectuée pour établir les paramètres de dépistage appropriés de la lignée cellulaire avant d&#39;effectuer l&#39;écran en trois étapes: dépistage / déconvolution primaire, secondaire et tertiaire. L&#39;utilisation de bibliothèques ciblée sur génome entier de siRNA est de plus en plus populaire car il offre l&#39;avantage de rendre compte uniquement sur les membres de la voie avec laquelle les enquêteurs sont plus intéressés. Malgré les limites inhérentes de dépistage siRNA, en particulier les faux positifs causés par siARN effets hors-cible, l&#39;identification des véritables nouveaux régulateurs des voies en question l&#39;emportent sur ces lacunes, qui peuvent être surmontées par l&#39;exécution d&#39;une série d&#39;expériences de contrôle attentivement entreprises.

Avant le dépistage, l&#39;hypoxie-réponse des cellules U20S-EDH est établi. Cellules U20S-EDH expriment une construction rapporteur constitué de la luciférase de luciole fusionné en aval de trois copies en tandem de l&#39;élément de réponse à l&#39;hypoxie, qui est lié par l&#39;hétérodimère HIF1A/HIF1B lors de l&#39;exposition à l&#39;hypoxie (figure 1A). Les cellules sont placées dans un poste de travail de l&#39;hypoxie pour une plage de temps pour établir laquelle l&#39;exposition à l&#39;hypoxie pr...

Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran &quot;ubiquitome&quot; pour identifier de nouveaux régulateurs de l&#39;ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l&#39;hypoxie. Ceci peut être adapté à n&#39;importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l&#39;activité du rapporteur est disponible.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier l’implication de nouveaux composants de l’ubiquitine et de systèmes modificateurs similaires à l’ubiquitine dans les voies biologiques, en utilisant la réponse hypoxique dépendante de HF un alpha comme exemple. Ceci est accompli en optimisant d’abord la réponse de la lignée cellulaire rapporteuse au stimulus environnemental hypoxie, afin qu’elles soient adaptées au dépistage. La deuxième étape de la procédure consiste à établir les contrôles haut et bas pour donner un facteur Z approprié pour le dépistage.Une fois les paramètres établis, le dépistage primaire de l’ARNi est effectué en trois exemplaires, après quoi les résultats sont confirmés par les écrans de déconvolution secondaires et tertiaires. En fin de compte, les résultats peuvent révéler une nouvelle ubiquitine et des régulateurs du système d’ubiquitine de la voie biologique en question. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le criblage du génome entier de l’ARN, est que le criblage de ciblage est plus rapide, plus facile à réaliser, moins coûteux et ne rend compte que des membres de la voie biochimique que l’investigateur e

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L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en...

La détection des protéines ubiquitination

Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.

Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Méthode de mesure de l&#39;activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à des technologies de sonde pour prédire et valider l’interaction entre de petites molécules de la médecine traditionnelle chinoise et des cibles protéiques.

Criblage de composés de médecine traditionnelle chinoise pour inhiber l’activité d’UCHL3 sur la base de la technologie des sondes enzymatiques d’amarrage moléculaire et de désubiquitination

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Découvrez une méthode de criblage siRNA ciblée pour identifier de nouveaux régulateurs des systèmes ubiquitine et ubiquitine-like dans la réponse à l'hypoxie HIF1A. Cette approche rapide et économique permet d'étudier des voies biologiques spécifiques.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture (Vidéo) | JoVE Journal

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

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