Profils MicroRNA d'expression de cellules iPS humaines, l'épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

L'objectif général de cette procédure est de comparer l'expression des microARN dans les cellules souches pluripotentes induites. Des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites et des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes fœtales. Ceci est réalisé en cultivant et en amplifiant d'abord les cellules IPS et les cellules RPE fœtales.

La deuxième étape consiste à différencier les cellules IPS en cellules pigmentaires rétiniennes (RPE). Ensuite, l'ARN est extrait des cellules IPS, des cellules I-P-S-R-P-E et des cellules RPE fœtales. La dernière étape consiste à effectuer une analyse par puces à microARN sur les échantillons d'ARN et à analyser les données.

En fin de compte, l'analyse de voies et de réseaux est utilisée pour identifier les microARN exprimés de manière différentielle qui interviennent dans plusieurs réseaux cellulaires, notamment la prolifération et la progression du cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la vision, telles que le rôle des microARN dans la régulation de la différenciation en cellules RPE matures, la progression du cycle cellulaire, la prolifération et la sénescence. Les implications de cette technique s'étendent aux thérapies utilisant l'épithélium pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches pour remplacer les cellules RPE malades ou endommagées, car le numéro de passage Optima des cellules utilisé en thérapie peut être déterminé.

Bien que cette question puisse fournir des informations sur les facteurs régulant la différenciation des PRP à partir des IPS, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes organiques, comme la différenciation d'autres types cellulaires spécifiques aux CT à partir des IPS. Pour commencer cette procédure, ensemencer les cellules souches pluripotentes induites à raison d'environ 350 colonies par puits dans une plaque nouvellement revêtue contenant le milieu M tester one, puis laisser les colonies d'IPS se développer pendant quatre à cinq jours en culture.

Ensuite, tous les trois jours, remplacez le milieu M tesser par quatre millilitres de milieu de différenciation et renouvelez la moitié du milieu par du milieu de différenciation frais. Laissez les foyers pigmentés croître suffisamment pour pouvoir être disséqués manuellement à partir de la culture, ce qui prend environ 40 à 50 jours. Utilisez ensuite une pointe de pipette de 200 microlitres pour découper autour des colonies pigmentées et les soulever.

Prélevez et regroupez les colonies disséquées dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de milieu DMMF 12 aux cellules de RPE regroupées et centrifugez à 300 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le milieu, resuspendez le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu et répétez la centrifugation.

Retirer le milieu du culot cellulaire. Préparer ensuite une solution de cellules individuelles en incubant les I-P-S-R-P-E regroupés avec de la TRIPSINE à 0,25 % EDTA pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius, jusqu'à ce que les agrégats cellulaires soient dissociés en cellules individuelles. Rincer les cellules I-P-S-R-P-E avec le milieu I-P-S-R-P-E, puis ensemencer les cellules recueillies dans une plaque fraîchement revêtue de matrigel contenant quatre millilitres de milieu de culture I-P-S-R-P-E. Incuber les cellules pendant trois semaines avant le repiquage, et renouveler le milieu avec du milieu I-P-S-R-P-E frais tous les trois jours pour l'expérience.

Observer les cellules I-P-S-R-P-E à raison de 100 000 cellules par centimètre carré, puis récolter les cellules 17 jours après le semis afin d'obtenir des cellules souches pluripotentes induites non différenciées. Maintenir les cellules en culture jusqu'à ce que des colonies non différenciées apparaissent denses au centre. Dès que cet état est observé, rincer les colonies dans un milieu D-M-E-M-F 12, puis dissocier les cellules souches pluripotentes induites en cellules individuelles à l'aide d'Accutane.

Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 300 G pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 pour recueillir les cellules fœtales de RPE ; rincer d'abord les cultures de cellules fœtales de RPE avec du D-M-E-M-F 12. Ensuite, dissocier les cultures cellulaires en cellules individuelles à l’aide de TRIPSINE-EDTA 0,25 % pendant cinq à dix minutes, à 37 degrés Celsius.

Recueillir les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes fœtales dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 300 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12.

Collecter les cellules I-P-S-R-P-E au jour 17. Après le troisième et le cinquième passage, rincer les cellules I-P-S-R-P-E deux fois dans du PBS et préparer une suspension unicellulaire par incubation avec un millilitre de trypsine à 0,25 % pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, neutraliser la trypsine avec deux millilitres de milieu I-P-S-R-P-E glacé et recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 300 G, puis aspirer le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans trois millilitres de tampon de marquage provenant du kit de microbilles, puis centrifuger la suspension cellulaire I-P-S-R-P-E dans le tampon de marquage à 300 G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer le surnageant et resuspendre.

Suspendre le culot cellulaire à une concentration de deux fois 10⁶ cellules par 100 microlitres du tampon de marquage provenant du kit de microbilles. Ajouter 10 microlitres d'anticorps anti-TRA1-60 PE par deux fois 10⁶ cellules. Bien mélanger, puis incuber à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Lavez les cellules dans un millilitre de tampon de marquage par deux fois 10⁶ cellules. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 300 ×g. Puis, aspirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans 80 microlitres de tampon de marquage par deux fois 10⁶ cellules.

Ensuite, ajouter 20 microlitres de microbilles marquées à l'anti-PE par deux fois 10 puissance 6 cellules. Mélanger soigneusement et incuber 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter un millilitre de tampon de marquage par deux fois 10 puissance 6 cellules, centrifuger pendant 10 minutes à 300 ×g et aspirer le surnageant.

Ensuite, reprendre le culot cellulaire dans 500 microlitres de tampon de marquage et trier les cellules TRA-1-60 négatives à l’aide d’un séparateur cellulaire magnétique, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Lyser les cellules en faisant passer chaque échantillon à travers une colonne mini-spin d’homogénéisation pour microcentrifugeuse, disponible commercialement, conçue pour les mini-préparations d'acides nucléiques. Ensuite, extraire l'ARN total des cellules IPS, I-P-S-R-P-E et de l'épithélium pigmentaire rétinien fœtal à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN disponible commercialement, conçu pour préserver les petites molécules d’ARN.

Utilisez un spectrophotomètre NanoDrop pour déterminer les concentrations totales en ARN ; créez un fichier Excel contenant la liste des microARN qui présentaient des niveaux d'expression différents d'au moins deux fois entre les groupes d'échantillons. Connectez-vous ensuite au programme en ligne d'analyse des voies de l'ARN et téléversez le fichier Excel. Sélectionnez le format flexible pour le format de fichier et choisissez Agilent dans la liste déroulante pour l'identifiant.

Saisissez sous l'en-tête des données brutes. Attribuez l'ID à la colonne ID de la sonde et attribuez l'observation un et le rapport logarithmique à la colonne rapport logarithmique. Sélectionnez ignorer pour toutes les autres colonnes.

Sélectionnez les paramètres d'analyse comme suit : confiance, uniquement les relations observées expérimentalement, incluant les relations directes et indirectes, ainsi que les produits chimiques endogènes. Sélectionnez la base de connaissances Ingenuity comme jeu de référence. Ensuite, choisissez la base de données des molécules de référence.

Cela inclut les données provenant de toutes les espèces, de toutes les lignées cellulaires et tissus, ainsi que de toutes les mutations. Après avoir sélectionné tous les paramètres, lancez l'analyse du réseau en choisissant réseaux. Ensuite, sélectionnez les réseaux superposés, puis cliquez sur un réseau d'intérêt pour visualiser les résultats.

Les cellules IPS différenciées en cellules I-P-S-R-P-E ont présenté le phénotype classique des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) : une morphologie hexagonale pigmentée, similaire à celle des cellules RPE fœtales. La comparaison des profils d'expression des microARN entre les cellules IPS non différenciées et les cellules I-P-S-R-P-E a révélé une surexpression de 47 microARN et une sous-expression de 36 microARN. En revanche, les cellules RPE fœtales présentaient 61 microARN surexprimés par rapport aux cellules I-P-S-R-P-E et 49 microARN sous-exprimés. L'analyse des voies biologiques à l'aide du logiciel Ingenuity IPA a indiqué que les gènes cibles des microARN exprimés de manière différentielle étaient impliqués dans des processus cellulaires tels que le développement cellulaire, la croissance et le cycle cellulaire. Cette analyse a également montré que les microARN exprimés dans les tissus oculaires in vivo étaient enrichis dans les cellules I-P-S-R-P-E et les cellules RPE fœtales par rapport aux cellules IPS. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de prévenir la contamination et la dégradation des échantillons d'ARN.

D'autres méthodes, telles que la R-T-P-C-R, peuvent être réalisées afin de confirmer le niveau d'expression des microARN dans chaque type cellulaire après leur mise en œuvre. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la vision pour explorer le rôle des microARN dans la différenciation et la progression du cycle cellulaire dans le rrp. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir de cellules IPS et de comparer le profil d'expression des microARN des cellules I-P-S-R-P-E aux cellules IPS et aux cellules RPE fœtales.