Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses

L’objectif global de cette procédure est d’extraire le venin et de disséquer les glandes à venin des araignées pour des études transcriptomiques et protéomiques, ceci est accompli en préparant d’abord l’équipement et les réactifs nécessaires pour collecter le venin par stimulation électrique. La deuxième étape consiste à immobiliser une araignée anesthésiante à l’aide d’une pince sous un microscope à dissection. Ensuite, l’araignée est pulsée avec du courant et le venin libéré est recueilli avec un tube

La dernière étape consiste à disséquer les glandes à venin de l’araignée deux à trois jours plus tard. En fin de compte, la spectrométrie de masse ou d’autres analyses protéomiques du venin sont utilisées pour montrer les séquences des protéines constitutives du venin. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de collecte du venin sont difficiles à apprendre car elles impliquent une séquence d’actions coordonnées qui doivent être effectuées rapidement, mais avec soin.

Pour commencer, connectez un cordon d’alimentation d’électrostimulateur à une prise et fixez la pédale externe à une entrée de signal externe. Ensuite, assurez-vous que le commutateur de polarité est en mode normal et connectez l’électrode positive à la borne de sortie rouge de l’électrostimulateur et connectez l’électrode négative à la borne de sortie noire. Réglez ensuite le stimulateur sur les réglages initiaux recommandés suivants.

Testez la sortie de l’électrode en fixant des pinces crocodiles aux cordons de test du voltmètre positif et négatif. Allumez ensuite l’interrupteur d’alimentation du stimulateur et délivrez le courant avec la pédale. Préparez la pince poids plume en enduisant une broche de plastique liquide et attendez quatre heures que le revêtement sèche une fois que le plastique a séché, enveloppez hermétiquement 15 millimètres de la pointe de la broche opposée AP avec une seule couche de fil à coudre en coton et fixez le fil en attachant l’extrémité dans un nœud.

Ensuite, à l’aide de ciseaux tranchants, coupez la pointe d’une aiguille hypodermique émoussée, suffisamment petite pour ne pas blesser l’araignée, mais suffisamment grande pour éviter de se boucher. Lissez l’ouverture avec du papier de verre et fixez l’aiguille à un piège à déchets sous vide. Positionnez ensuite la pince poids plume horizontalement dans une position bien fermée à l’aide d’une pince à deux dents recouverte de vinyle fixée à une base magnétique sous le champ de vision d’un microscope à dissection avec la broche recouverte de plastique sur le dessus et la broche recouverte de fil sur le dessous.

Ensuite, fixez une pince crocodile à électrode positive à la broche inférieure en amont du filetage, et fixez une pince crocodile négative à l’aiguille à vide en métal émoussé. Placez ensuite le fil positif sur la broche de la pince entre le fil et la pince crocodile et le fil négatif sur l’aiguille à vide émoussée. Pour tester le courant du circuit du voltmètre, appuyez sur la pédale pour vous assurer qu’un courant suffisant est détecté et retirez les fils tout en portant des lunettes de protection.

Préparez plusieurs microtubes capillaires pour la collecte du venin. Ensuite, placez une bande de mastic de montage dans une boîte de Pétri et posez les microcapillaires sur la bande. Avec une main gantée, tenez un seul tube microcapillaire à une extrémité et tenez l’autre extrémité avec une pince métallique stérile au-dessus d’une flamme de bec Bunsen et éloignez l’extrémité de la flamme pour créer une pointe allongée tout en tenant l’autre extrémité en position stationnaire, examinez les extrémités microcapillaires sous un microscope de dissection et créez une petite ouverture biseautée à l’extrémité tirée avec une pince métallique stérilisée.

Fermez les tubes et placez-les sur de la glace. Pour commencer l’immobilisation de l’araignée, allumez le gaz de la chambre à CO2. Transférez ensuite l’araignée à l’aide d’une longue pince métallique du flacon collecteur en plastique fermé dans la chambre à CO2.

Gardez l’araignée dans la chambre pendant cinq à 10 minutes et vérifiez qu’elle ne se déplace plus. En le poussant doucement avec de longues pinces. Ensuite, utilisez une pipette de transfert avec une solution saline pour mouiller le fil sur la pince.

Ensuite, récupérez l’araignée anesthésiée de la chambre de CO2 en la ramassant par ses pattes antérieures. À l’aide d’une pince à dissection émoussée et de mains gantées, déplacez l’araignée anesthésiée vers l’appareil de pince poids plume. Séparez ensuite les griffes de la pince poids plume fermée et placez le thax céphalique araignées entre les griffes.

Laissez les broches se fermer pour vous assurer que l’araignée est bien maintenue en place mais qu’elle n’est pas écrasée Assurez-vous rapidement que l’araignée est placée côté dos de la carpace vers le bas, reposant sur la broche revêtue de fil, et que la face ventrale de la voiture fait face au revêtement en plastique tandis que l’électrode positive reste attachée à la broche inférieure. Ensuite, ajustez le grossissement du microscope de dissection, la mise au point et la source de lumière jusqu’à ce que la flèche et les crocs des araignées soient clairement visibles. Pour commencer la collecte du venin, allumez l’aspirateur et vaporisez de l’eau dans la mine d’araignée.

À l’aide d’une deuxième seringue à embout émoussé, aspirez l’eau avec une aiguille à vide pour éliminer les impuretés. Ensuite, touchez l’aiguille à vide avec l’électrode négative sur le rostre de l’araignée et délivrez une impulsion avec la pédale. Les pattes de l’araignée se contracteront et le venin sera visible sous forme de gouttelettes claires émergeant des crocs.

Aspirez les régurgitations si nécessaire. Ensuite, collectez les gouttelettes de venin avec l’embout microcapillaire et transférez l’embout capillaire dans un tube de 0,5 millilitre avec de l’eau, qui sera aspiré dans le capillaire. Évitez de percer l’araignée avec le capillaire et de contaminer le capillaire avec de la soie et de la colle des filons.

Ensuite, fixez la seringue de transfert avec l’adaptateur de tube au microcapillaire à l’extrémité opposée à l’embout collecteur et versez la solution de venin dans le tube et placez le tube sur de la glace stockez le venin contenant des tubes à moins 80 degrés Celsius. Lorsque vous avez terminé, lorsque vous avez terminé la collecte du venin, placez une fiole de collecte en plastique ouverte avec son capuchon près de l’araignée. Pour un transfert rapide, saisissez soigneusement les pattes de l’araignée à l’aide d’une pince à dissection émoussée tenue dans une main et ouvrez soigneusement la pince poids plume de l’autre main.

Ensuite, glissez l’araignée dans le flacon collecteur à l’aide d’une pince émoussée. Et fermez rapidement le capuchon deux à trois jours après la collecte du venin, anesthésez l’araignée dans une chambre à CO2, puis remplissez un transporteur d’azote liquide et placez-le à côté d’un microscope de dissection. Nettoyez la zone de dissection et la pince avec l’ARN.

Remplissez ensuite une petite boîte de Pétri avec un citrate de sodium salin et placez-la sous le microscope à dissection. Ensuite, transférez l’araignée de la chambre à CO2 dans la boîte de Pétri et utilisez une pince pour séparer rapidement le thax céphalique de l’abdomen. Tenez ensuite le thax céphalique sous le microscope de dissection à l’aide d’une pince et positionnez la mine dans le champ de vision.

À l’aide des extrémités pointues d’une deuxième paire de pinces, couper latéralement la cuticule qui relie la carabase aux aspects latéraux de la mine. Saisissez la mine avec la deuxième paire de pinces et tirez doucement d’avant en arrière jusqu’à ce que les glandes à venin soient retirées. Ne prend pas plus de 15 minutes.

Séparez les glandes de la mine et transférez-les dans un tube cryogénique de 0,5 millilitre. Placer le tube fermé dans de l’azote liquide, en intégrant des techniques de spectrométrie de masse avec des bases de données de séquences générées à partir de la glande à venin CD NA. Les banques ont permis d’identifier les protéines du venin. Le peptide inepte Laro était l’une des 36 protéines identifiées à partir du venin de veuve noire à l’aide de la spectrométrie de masse.

N’oubliez pas que travailler avec des araignées comme les veuves noires peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.