Name: Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Apprenez l'extraction de venin d'araignées par stimulation électrique et la microdissection des glandes pour analyses protéomiques et transcriptomiques. Cette méthode permet d'étudier la composition et l'expression génique du venin.

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Je remercie les personnes suivantes pour leur aide dans l&#39;élaboration de ce protocole: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, et Mays Imad. Données de spectrométrie de masse et protéomique ont été acquis par l&#39;Arizona protéomique Consortium soutenu par NIEHS subvention ES06694 à la SWEHSC, NIH / NCI subvention CA023074 à l&#39;AZCC et par l&#39;Institut BIO5 de l&#39;Université de l&#39;Arizona. Le financement de ce travail a été fourni par le National Institutes of Health (Institut national de médecine générale) de subventions 1F32GM83661-01 et 1R15GM097714-01 à Jessica E. Garb.

1. Préparation de l&#39;électro-stimulateur Appareil <ol><li> Connectez électro-stimulateur cordon d&#39;alimentation à la sortie et fixer pédale externe à l&#39;entrée de signal externe. Remarque: Les fils électriques doivent être correctement isolés et de courant délivrant de métal exposé ne devraient pas être touchés. Porter des gants en latex ou en nitrile pour la protection. Interrupteur électro-stimulateur doit être en position OFF lorsque vous fixez le cordon d&#39;alimentation et attacher des fils. </li><li> Connectez électrode positive à la borne de sortie rouge sur électro-stimulateur (lorsque le commutateur de polarité est en mode normal) et connectez l&#39;électrode négative à la borne de sortie noir. Remarque: Chaque fil électrode doit mettre fin à une pince crocodile. </li><li> Réglez stimulateur aux réglages initiaux recommandées suivantes: tension = 7 V, Fréquence = 1 impulsions par seconde, retard = 0 millisecondes, durée = 200 millisecondes, impulsions jumeaux passent = régulier, et commutateur de mode = off. </li><li> Sortie de test d&#39;électrodes en attachant des pinces crocodiles à voltmecordons de test positifs et négatifs ter. Allumez l&#39;interrupteur d&#39;alimentation de stimulateur et fournir du courant à pédale. </li></ol> 2. Préparation d&#39;immobiliser forceps et d&#39;autres matériels <ol><li> Trempez une broche de pince plume en revêtement de plastique liquide et attendre quatre heures pour laisser sécher de revêtement. Envelopper de 15 mm de la pointe de la dent opposée avec une seule couche de fil à coudre de coton, et assurer fil en liant la fin dans un noeud. Remarque: Le fil est utilisé pour absorber une solution saline appliqué qui favorise la conductivité électrique, tandis que le revêtement plastique assure une isolation pour retarder courant. </li><li> Couper l&#39;extrémité de l&#39;aiguille hypodermique émoussé avec des ciseaux pointus et lisser l&#39;ouverture avec du papier de verre. Fixer l&#39;aiguille à un siphon de vide (par exemple, le filtre à vide flacon) via un tube. Remarque: L&#39;aiguille aspirer l&#39;eau loin et régurgiter, et servira à compléter le circuit créé par les électrodes de stimulation. Le mu ouverture de l&#39;aiguillest être assez petit pour ne pas nuire à l&#39;araignée, mais assez grand pour solution de vide sans colmatage (par exemple, 25 G x 1 ½ po jauge, voir liste des matières). </li><li> Forceps Position plume horizontalement dans une position bien fermé à l&#39;aide d&#39;une pince à deux volets recouvert de vinyle fixé à une base magnétique ou un appareil de support fixe sous le champ de vision d&#39;un microscope binoculaire, avec revêtement plastique volet de pince sur le dessus et le fil enduit broches sur le fond. Remarque: La pince à deux volets est maintenu dans une position fixe à la base magnétique par un support de serrage (voir la liste des matériaux). Une bande de caoutchouc peut être fermement fixée autour de griffes de la pince de plume, à côté du support de serrage, une pression supplémentaire à ajouter pour maintenir la pince à plume dans une position fermée autour de l&#39;araignée, une fois mis en place. </li><li> Fixez le collier électrode alligator positif à broche fond de forceps en amont de fil et attacher la pince crocodile négative pour émousser l&#39;aiguille d&#39;aspiration de métal. </li&gt; <li> Circuit avec un voltmètre en plaçant le fil positif sur pince broches entre le fil et pince crocodile et placer le fil négatif sur l&#39;aiguille vide émoussé test. Appuyez sur la pédale pour assurer un courant suffisant est détecté et retirez les cordons si suffisamment de courant est détectée. </li><li> Préparez plusieurs tubes microcapillaires pour la collecte de venin. Tenez un tube microcapillaire unique à une extrémité avec une main gantée et à l&#39;autre extrémité avec une pince en métal stériles, plaçant l&#39;extrémité de pince-tenu horizontalement sur une flamme du bec Bunsen. Tirez sur la micro-capillaire avec la pince en métal loin de la flamme pour créer une pointe allongée, tout en maintenant l&#39;autre extrémité dans une position stationnaire. Remarque: porter des lunettes de protection comme des micro-capillaires se brisent facilement. </li><li> Reste Microcapillaires préparés sur une bande de mastic de montage dans une boîte de Pétri. Examiner les micro-capillaire se termine sous un microscope à dissection et de créer une petite ouverture en biseau à l&#39;extrémité tirée avec une pince en métal stérilisés. </li><li> LaBel nombre variable de tubes de 0,5 ml stériles. Ajouter de l&#39;eau déminéralisée stérile à stériles tubes (par exemple, 5 pi d&#39;eau déminéralisée autoclave). Fermer tubes et place des tubes sur la glace. </li><li> Préparer la solution saline dans un bécher et remplir un deuxième bécher avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave. </li></ol> 3. L&#39;immobilisation de Spider dans Forceps <ol><li> Activer le réservoir de CO 2 et de transférer araignée du flacon en plastique fermé collecte (voir la liste des matériaux) en CO 2 chambre en utilisant des pinces métalliques longues. Remarque: la veuve noire ont du venin dangereux; toujours porter des gants lors de ce protocole. </li><li> Gardez araignée dans la chambre pendant 5-10 minutes ou jusqu&#39;à ce que anesthésié et ne bougeait plus lorsque poussé doucement avec de longues pinces. Utilisez pipette de transfert pour mouiller fil sur une pince avec une solution saline. Remarque: Pour obtenir des instructions sur le CO 2 paramètres d&#39;anesthésie pour les veuves noires, reportez-vous à Spagna et Moore 19. </li><li> Récupérer araignée anesthésié de CO 2chambre en le prenant par ses pattes antérieures en utilisant une pince de dissection émoussés et les mains gantées. Déplacez araignée anesthésiés à plume appareil forceps. Branches distinctes de forceps plume fermés et placent le céphalothorax de l&#39;araignée entre les dents et les griffes permettent de fermer arrêt pour assurer araignée est tenu fermement en place mais ne sera pas écrasé. Assurez-vous que l&#39;araignée est placé côté carapace de dos vers le bas (voir Foelix 20 pour guide araignée anatomie), reposant sur ​​un fil enduit broches, et la face ventrale de la carapace face au revêtement plastique, tandis que l&#39;électrode positive reste attaché à broche bas. Travaillez rapidement lors de la manipulation araignée. </li><li> Réglez loupe binoculaire grossissement, mise au point, et la source lumineuse jusqu&#39;à la chélicères de l&#39;araignée et crocs sont clairement visibles. </li></ol> 4. Venom Collection <ol><li> Mettez vide et pulvériser araignée chélicères avec une solution d&#39;eau à l&#39;aide d&#39;un deuxième à pointe émoussée seringue nEedle. Aspirer l&#39;eau loin avec l&#39;aiguille d&#39;aspiration pour éliminer les impuretés. </li><li> Touchez l&#39;aiguille d&#39;aspiration avec électrode négative attachée à araignée tribune et livrer impulsion avec pédale une ou plusieurs fois. Vide régurgiter immédiatement si nécessaire. Remarque: araignée tribune est à l&#39;intérieur de la bouche postérieure à Chélicères sur la surface dorsale entre chélicères et endites (voir Foelix 20 pour détaillé araignée anatomie). Remarque: A chaque impulsion, les jambes du contrat, et le venin de l&#39;araignée seront visibles sous forme de gouttelettes claires émergents de crocs. </li><li> Recueillir venin gouttelettes avec pointe de micro-capillaire et pointe capillaire de transfert dans 0,5 ml tube avec une solution d&#39;eau ou de tampon (solution sera aspiré dans capillaire). Remarque: éviter de percer araignée avec capillaire qui peut conduire à une contamination de l&#39;hémolymphe et la mort. Aussi éviter la contamination de capillaire avec de la soie et de la colle de filières. </li><li> Fixez transfert seringue avec adaptateur de tube à micro-capillaire (à l&#39;autre extrémité de pointe de collecte) et dispense solution de venin de retour dans le tube. Déposer le tube sur la glace. Remarque: Eliminer capillaires de déchets dans un récipient pour objets tranchants à proximité. </li><li> Placez flacon en plastique de collecte ouvert, avec son chapeau, à proximité de l&#39;araignée. Saisissez délicatement les pattes d&#39;araignée avec une pince de dissection émoussés tenu dans une main et plume soigneusement ouvert forceps dents avec l&#39;autre main, araignée glissant dans la collecte flacon avec pince émoussée et rapidement fermer le bouchon. Continuer avec des tubes contenant de venin d&#39;araignée prochaine et stocker à -80 ° C congélateur lorsque vous avez terminé. Remarque: continuer à faire preuve de prudence lors du déplacement de l&#39;araignée de la pince dans le flacon. Assurez-vous que le flacon de collecte et bouchon est à proximité de l&#39;araignée pour son transfert rapide et porter des gants. </li></ol> 5. Venom Gland dissections <ol><li> Deux à trois jours après le prélèvement de venin, anesthésier araignée en CO 2 chambre (voir l&#39;étape 3.1). Remplissez support de l&#39;azote liquide et place à côté de microscope à dissection. Remarque: when travaillant avec de l&#39;azote liquide, utilisation Protection des yeux et des gants cryogéniques. </li><li> Zone de dissection propre et pinces à disséquer avec une solution qui élimine la contamination RNase et ADN. Remplir un petit boîte de Pétri placée sous loupe binoculaire avec un tampon (par exemple, le citrate de sodium salin 1x (SSC) tampon) dissection. </li><li> Transfert araignée de CO 2 chambre une boîte de Pétri et utiliser des pinces pour séparer rapidement le céphalothorax de l&#39;abdomen. </li><li> Tenez le céphalothorax sous le microscope de dissection avec une pince et positionner les chélicères dans le champ de vue. Utilisez les bouts pointus d&#39;une seconde paire de pinces pour couper cuticule rejoindre la carapace des aspects latéraux de la chélicères. Latéralement saisir les chélicères en utilisant la deuxième paire de pinces, et tirez doucement d&#39;avant en arrière jusqu&#39;à ce que des glandes à venin sont retirés. </li><li> Glandes Séparez les chélicères (ou laissez attachés à Chélicères si désiré) et transférer dans un tube de 0,5 ml cyrosafe. La place closed tube dans l&#39;azote liquide. Remarque: chaque dissection ne devrait pas prendre plus de 15 minutes. </li><li> Répétez dissection d&#39;araignées supplémentaires jusqu&#39;à la fin. tubes de transfert de l&#39;azote liquide dans le congélateur à -80 ° C. </li></ol>

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L&#39;auteur n&#39;a rien à divulguer et aucun intérêt financier concurrents.

Venins représentent une source importante de protéines physiologiquement réactifs, des peptides et autres molécules ayant des applications pour la découverte de médicaments, ainsi que pour les aspects fondamentaux de la recherche cellulaire et écologique 1-3. Toutefois, la collecte de venin, en particulier des animaux dangereux ou petits, est une tâche difficile. Ce protocole montre comment venin et glandes à venin peuvent être collectées à partir de la veuve noire, et confirme le succès de cette approche par une combinaison d&#39;analyse MudPIT du venin et une base de données de protéines dérivées à partir d&#39;ADNc cloné à partir de glandes à venin 21. Bien que ce protocole fonctionne bien pour les veuves noires et les araignées de taille moyenne, d&#39;autres techniques de collecte de venin ont été employées pour agrandir mygalomorphes araignées (tarentule comme), telles que l&#39;aspiration directe du venin des crocs en verre pipettes par exemple, 24. Cette dernière approche, cependant , ne fonctionne pas bien pour les petites entreprises qui ne sont pas des araignées aggressive. Un aspect particulièrement important du protocole de collecte de venin est décrit ici les phases initiales de la préparation et de l&#39;optimisation du processus de collecte de sorte qu&#39;il devient plus systématique, uniforme et plus rapide. Le protocole est d&#39;abord difficile à maîtriser, mais avec des essais répétés, il devient plus facile et plus rapide. La prudence est également demandé à toutes les phases critiques impliquant la manipulation d&#39;araignées dangereuses, l&#39;utilisation du courant électrique, à pointe fine verre micro capillaires et les aiguilles de seringues. Il est important de porter un équipement de protection individuelle approprié comme des gants en nitrile, une blouse de laboratoire, des pantalons longs et des chaussures fermées, ainsi que des lunettes lors de l&#39;élaboration des micro capillaires. Un autre aspect de défis à la collecte de venin est le venin petite quantité de produit par l&#39;une quelconque d&#39;araignée, en particulier des espèces Latrodectus, à partir de laquelle les montants peuvent être collectées limited à 1-2 microlitres par personne au mieux. L&#39;obtention de venin suffisante pour les applications en aval, tels que les gels de protéine ou des essais fonctionnels peuvent nécessiter la combinaison de venin provenant de plusieurs individus dans un tube. Dans ce cas, le venin ne soit accompagnée de personnes du même sexe, le stade ontogénétique, et la population bénéficie de la reconnaissance de la variabilité intersexuelle, développement et géographique dans certains venins 25, 26. Les araignées peuvent également présenter des variations considérables de la quantité de venin produit entre les individus, où des quantités moindres peuvent refléter la diminution récente de la glande. Ainsi, il peut être conseillé de recueillir venin plusieurs jours après leur dernier repas. Si peu de venin est libéré, un courant excessif ne devrait pas appliqué à l&#39;araignée, qui peut causer la cuticule à la rupture, conduisant à la contamination du venin avec hémolymphe ou la mort. La contamination des échantillons de venin avec araignée sisources lk ou droits devraient également être évités grâce à l&#39;utilisation de matériel stérile ou propre. Malgré ces difficultés, la collecte de venin pur, en laissant l&#39;araignée vivant, est préférable aux méthodes qui obtiennent venin à partir d&#39;homogénats de glandes (qui ne se séparent pas des composants de venin provenant d&#39;autres protéines cellulaires) et tuent l&#39;araignée. Il est également essentiel de veiller à ce que les échantillons sont congelés rapidement pour éviter la dégradation des protéines. L&#39;extraction de venin favorise la production de venin ultérieur, stimulant ainsi l&#39;expression du gène de venin dans la glande à venin. Ainsi, parce que ce protocole permet d&#39;araignées pour survivre venin épuisement, leurs glandes peuvent être disséqués quelques jours plus tard (tuer l&#39;araignée) à un point où il est prévu l&#39;expression du gène de venin suffisante pour des études génétiques, tels que la transcription clonage 10,11. Plusieurs précautions doivent également être prises dans les dissections de glandes à venin. L&#39;accent devrait être mis sur l&#39;utilisation laboratoire équipement et des réactifs qui sont exempts de RNases qui dégradent l&#39;ARN. Ainsi, il est recommandé d&#39;essuyer des pinces et autres instruments non jetables et les surfaces avec des solutions qui éliminent la contamination de RNase et ADN. Les dissections doivent être effectuées aussi rapidement que possible et directement congelé pour assurer davantage l&#39;intégrité de l&#39;ARN du tissu. Enfin, les dissections ne doivent être effectuées sur les araignées anesthésiés, après son céphalothorax et l&#39;abdomen sont rapidement séparés. En conclusion, cet article fournit un protocole vérifié pour obtenir venin d&#39;araignée et glandes à venin. Venom et glandes à venin permettent l&#39;isolement et la caractérisation de leurs protéines et de peptides composants en utilisant une approche protéomique et transcriptomique. En outre, des échantillons de venin peuvent représenter le point de départ d&#39;analyses fonctionnelles, qui déterminent le potentiel biomédical et pharmacologique de leurs molécules constitutives. Presque toutes les araignées produisent venin, et la large plongeursité des composants du venin synthétisés par espèce suggère une grande diversité de molécules de venin sont encore à découvrir 13. Par conséquent, ce protocole fournit des outils pour étudier la riche source de molécules biologiquement actives présentes dans les venins d&#39;araignée.

Les venins sont sécrétions animales principalement injectées dans un autre animal à des fins de prédation ou de la défense, et avoir également des applications biologiques importantes avec pertinence biomédicale 1-3. Seuls certains animaux synthétisent venin, mais sa production est répandue à travers taxonomique des invertébrés (par exemple, les cnidaires, les escargots de cône, les scorpions et les araignées) et vertébrés (par exemple, des serpents, des poissons et mammifères), car il a évolué indépendamment plusieurs fois 1,4 . La caractérisation biochimique de venins montrent typiquement elles sont composées d&#39;une grande variété de protéines et de peptides, qui agissent principalement sur ​​les systèmes circulatoire et nerveux des animaux injectés de fournir rapidement des toxines constituantes 1. Une petite fraction des animaux venimeux peut constituer une menace pour les êtres humains, en particulier les espèces dont la répartition synanthropes 5. L&#39;étude de la composition du venin et des activités fonctionnelles a joué un rôle important dansla caractérisation fonctionnelle des composants cellulaires de vertébrés (en particulier les canaux ioniques neuronaux 6) et dans la compréhension des processus cellulaires fondamentaux de la neurosécrétion (par exemple 7). En outre, certains peptides de venin ont des propriétés utiles dans des contextes biomédicaux, y compris leurs utilisations comme traitements pour le cancer et la douleur 8,9, et sont exploités à des candidats pistes de développement de médicaments et de sérum antivenimeux. Venins jouent également un rôle de premier plan dans la recherche écologique et évolutive 1,4,10,11, donc la collecte de ces sécrétions dangereux a de nombreux utilitaires. Il ya&gt; 40.000 espèces décrites d&#39;araignées (Araneae d&#39;ordre), et tous sauf un des plus de 100 familles d&#39;araignées possèdent paires glandes à venin qui se terminent dans 12 crocs. La diversité des espèces d&#39;araignées élevé suggère qu&#39;ils représentent le plus grand clade des organismes venimeux. Cependant, la caractérisation biochimique de venins d&#39;araignées a largely concentré sur un petit nombre d&#39;espèces le plus souvent associés à une envenimation humaine. Des études récentes protéomique et transcriptomique de venins d&#39;araignées indiquent qu&#39;ils contiennent généralement beaucoup de protéines et de peptides 2,13,14 uniques. Les progrès dans le séquençage de l&#39;ADNc à haut débit et la spectrométrie de masse peptide empreintes digitales a grandement facilité la découverte de ces protéines de venin 15. Néanmoins, ce travail commence par la collecte de venin suffisante et / ou des glandes à venin des araignées, et de la documentation détaillée de ces techniques sont peu nombreux 16. Cet article présente un protocole pour la collecte de venin et glandes à venin de la veuve noire, qui peut être appliqué à des araignées de taille similaire. La collection de venin séparément à partir des glandes permet l&#39;identification des protéines qui sont sécrétées dans le venin, par opposition à des protéines qui effectuent d&#39;autres fonctions cellulaires. Veuves noires et autres Latrodectus espèces sont largement reconnus comme étant parmi les araignées les plus dangereuses en raison de leur venin neurotoxique très, ce qui provoque des douleurs sévères chez l&#39;homme, qui est parfois accompagnée par une transpiration abondante, des contractions musculaires, hypertension, difficulté à respirer et une paralysie inégale 5. Le protocole de collecte de venin présenté ici utilise des électro-stimulation à fournir du courant électrique à des araignées anesthésiés pour provoquer des contractions et la libération de venin musculaires. gouttelettes de Venom sont rapidement collectées par des micro-capillaires et distribués dans des tubes pour le stockage de congélateur. Parce que le protocole comporte des procédures dangereuses, il ne doit être effectuée par des personnes bien formées et prudence est de mise lors des étapes clés. Le venin recueilli a de nombreuses utilisations, telles que la caractérisation et l&#39;isolement de molécules constitutives 2, pour les expériences ou les essais fonctionnels physiologiques 18, et pour stimuler l&#39;expression du gène de venin 11. Le protocole se termine par une description de glande à venin dissection et conservation utile pour le clonage de gènes spécifiques de venins, a été démontré que l&#39;expression de ce qui se produire à 2-3 jours après l&#39;épuisement du venin d&#39;araignées de différentes 10,11.

<table><tbody><tr><td>Stimulateur nerveux et musculaire (électrostimulateur)</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td></td></tr><tr><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html Voltmètre</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>n’importe quel voltmètre/multimètre générique peut être substitué</td></tr><tr><td>Pince pointue poids plume</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Disponible chez Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&#189 ; en Precision Glide aiguille de seringue hypodermique</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Flacon filtrant sous vide 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>des flacons plus petits peuvent également fonctionner</td></tr><tr><td>Buchner Entonnoir en deux parties, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &#956 ; l Alésages capillaires (micro-capillaires)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Bande de mastic de montage&nbsp ;</td><td>Loctite</td><td></td><td>disponible chez Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pince extra-longue à usage général Longueur : 11-13/16 po.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Tampon SSC, 20x (pH 7,0), qualité moléculaire</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>peut être fabriqué à partir de produits chimiques de base (150 mM de NaCl, 15 mM de citrate de sodium)</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf safe-lock Tubes de 0,5 ml (sans danger cryogénique)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Flacon de paillasse à l’azote liquide</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler ultra fine (pince à dissection)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>Des pinces à pointe fine similaires de haute qualité peuvent être remplacées par</td></tr> une <tr><td>pédale Footswitch/pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Pince d’extension à deux broches, avec manchons recouverts de vinyle, 8,5 pouces</td><td>VWR</td><td>21570-007</td> des <td>modèles similaires pourraient être remplacés</td></tr><tr><td>Support de pince</td><td>VWR</td><td>89084-746</td> des <td>modèles similaires pourraient être remplacés, doit s’adapter au diamètre de la tige de la pince d’extension</td></tr><tr><td>Base magnétique (maintient la pince d’extension via le support de pince)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>un appareil similaire capable de maintenir solidement la pince d’extension en position fixe peut être remplacé</td></tr><tr><td>Flacons collecteurs en plastique (grands/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Fil à coudre en coton</td><td>Joann tissu et magasin d’artisanat</td><td>7245855</td><td>produit similaire pourrait être substitué</td></tr></tbody></table>

extraction de venom et venom gland microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique analyses

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Les venins sont chimiquement sécrétions complexes comprenant typiquement de nombreuses protéines et de peptides ayant des activités physiologiques variés. Caractérisation fonctionnelle des protéines de venin a des applications biomédicales importantes, y compris l&#39;identification de pistes de drogue ou des sondes pour les récepteurs cellulaires. Les araignées sont le plus riche en espèces du clade des organismes venimeux, mais les venins de seulement quelques espèces sont bien comprises, en partie en raison de la difficulté liée à la collecte de quantités infimes de venin de petits animaux. Cet article présente un protocole pour la collecte du venin des araignées à l&#39;aide de la stimulation électrique, décrivant la procédure sur la veuve noire de l&#39;Ouest (de Latrodectus hesperus). Le venin recueilli est utile pour des analyses en aval variés, y compris l&#39;identification directe de la protéine par spectrométrie de masse, analyses fonctionnelles, et la stimulation de l&#39;expression du gène de venin pour les études transcriptomiques. Cette technique a l&#39;avantage sur les protocoles que l&#39;ISOvenin de fin à partir d&#39;homogénats de glande entiers, qui ne séparent pas les composants de venin de véritables protéines cellulaires qui ne sont pas sécrétés dans le cadre du venin. Les résultats représentatifs montrent la détection de peptides de venin connus de l&#39;échantillon prélevé à l&#39;aide de la spectrométrie de masse. La procédure de collecte de venin est suivie d&#39;un protocole pour la dissection des glandes à venin d&#39;araignée, avec des résultats démontrant que cela conduit à la caractérisation de protéines et de peptides venin exprimée au niveau de la séquence.

La collection de venin et glande à venin dissections sont souvent effectuée pour caractériser les protéines et les peptides de venin au niveau de la séquence 10,11,15. Venin recueilli peut également être utilisé dans des tests physiologiques afin de déterminer leurs activités fonctionnelles 18. La collection de venin stimule l&#39;expression du gène de venin de presse-étoupe, ce qui facilite le clonage de produits de transcription spécifiques de la toxine par RT-PCR 10,11. Identification des protéines de venin peut également être réalisée d&#39;une manière à haut débit par l&#39;intégration des techniques de spectrométrie de masse standard avec les bases de données de séquences produites à partir de glande à venin bibliothèques d&#39;ADNc 15,21. Un exemple d&#39;un tel travail, à partir de venin de glandes et recueillies en utilisant le protocole détaillé ci-dessus, ce qui démontre son efficacité, est représenté sur la figure 1. Venom recueillies auprès de L. hesperus femelles adultes ont été digérés avec de la trypsine et on les soumet à une solution deanalyse MudPIT, qui relie HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) à la spectrométrie de masse en tandem (MS / MS). Voici l&#39;analyse de MudPIT a été réalisée par l&#39;Université de l&#39;Arizona protéomique Consortium. Des masses de peptides détectés et leurs fragments dissociés (ions fils, déduites à partir des spectres) ont été comparées à des séquences de peptides prédits théoriquement à partir de traductions des séquences d&#39;ADNc obtenus à partir d&#39;une banque d&#39;expression de gènes construite à partir de L. hesperus glandes à venin (glandes ont été acquises par le protocole de dissection décrites ci-dessus) 21. Dans cette expérience, 36 protéines ont été détectées à partir de tous les spectres collectés, au seuil de probabilité de 99,9%, et contenaient au moins un peptide détecté. L&#39;une des protéines détectées est supportée par les spectres 43 totale (spectres exemple représenté sur la figure 1A), ce qui correspond à trois peptides exclusifs, couvrant 35% de la séquence de la protéine (figure 1B). La protéine détectée (traduit de l&#39;un de Collecte<html> d ADNc) a une BLASTp succès haut en latrodectin de L. tredecimguttatus (GenBank P49125.1), avec un score de e-2e-46, et de part 80% d&#39;identité au niveau de la séquence d&#39;acides aminés avec la protéine détectée dans cette expérience. Latrodectin, qui est également connu comme faible teneur en protéines de poids moléculaire alpha-latrotoxine, est un composant du venin de veuve noire reconnu araignées 22, 23, vérifier l&#39;efficacité du protocole présenté. Certaines protéines identifiées à partir du venin correspondent à des séquences pour lesquelles aucune explosion a frappé se trouve. Il est difficile de savoir si un tel résultat est dû aux ressources génomiques limitées disponibles pour les araignées ainsi que l&#39;information fonctionnelle limitée pour leurs protéines, ou parce que la protéine inconnue représente un contaminant de venin. Néanmoins, le gène ou l&#39;expression des protéines analyse examinant l&#39;abondance de cette nouvelle protéine dans les glandes à venin par rapport à d&#39;autres tissus devrait révéler si elle est un composant de venin authentique. ent &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1: peptide Latrodectin identifié à partir de la veuve noire venin par spectrométrie de masse (A) spectres représentatifs (l&#39;un des 43) détecté par MS / MS partie de l&#39;analyse de L. MudPIT. hesperus venin qui a été affecté à la traduction prédite d&#39;une séquence d&#39;ADNc recueilli représenté sur la partie B. Les spectres montre rapport masse sur charge (m / z) des ions fils détectés sur l&#39;axe horizontal produit par fragmentation de peptide parent (CGEEDFGEEIVK), avec des lettres en haut indiquant la séquence peptidique basé sur les masses d&#39;ions filles. (B) séquence à laquelle les spectres dans la partie A de la protéine a été attribué, montrant en rouge, gras et souligné texte la séquence correspondante à partir des spectres montré dans la partie A, le texte en rouge supplémentaire (non gras) représente un autre peptide dans la protéine détectée avec cette autre sp collectéesectra. La séquence de la protéine est traduite à partir d&#39;une séquence d&#39;ADNc obtenue à partir de glandes à venin disséqués.

Cet article fournit un protocole pour l&#39;extraction du venin des araignées à l&#39;aide de la stimulation électrique pour 1) procéder à la caractérisation protéomique, 2) stimuler venin expression du gène de la glande, et 3) réaliser des études fonctionnelles des venins. Ceci est suivi par une description de microdissections de la glande à venin pour des études d&#39;expression génique.

Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

L'objectif général de cette procédure est d'extraire du venin et de disséquer les glandes à venin d'araignées pour des études transcriptomiques et protéomiques ; cela est réalisé en préparant d'abord le matériel et les réactifs nécessaires à la collecte du venin par stimulation électrique. La deuxième étape consiste à immobiliser une araignée anesthésiée à l'aide de pinces sous un microscope stéréoscopique. Ensuite, l'araignée est soumise à des impulsions électriques et le venin libéré est recueilli à l'aide d'un capillaire microscopique.La dernière étape consiste à disséquer les glandes à venin de l'araignée deux à trois jours plus tard. En fin de compte, la spectrométrie de masse ou d'autres analyses protéomiques du venin permettent d'obtenir les séquences des protéines composant le venin. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de collecte du venin sont difficiles à apprendre, impliquant une série d'actions coordonnées qui doivent être effectuées rapidement, mais avec précaution.Pour commencer, branchez le cordon d'alimentation du stimulateur électrique à une prise et reliez la pédale externe à une entrée de signal externe. Ensuite, assurez-vous que l'interrupteur de polarité est en mode normal, puis reliez l'électrode positive à la borne de sortie rouge du stimulateur électrique et l'électrode négative à la borne de sortie noire. Réglez ensuite le stimulateur selon les paramètres initiaux recommandés suivants.Testez la sortie de l'électrode en fixant des pinces crocodile aux fils de test positif et négatif du voltmètre. Ensuite, allumez l'interrupteur d'alimentation du stimulateur et délivrez le courant à l'aide de la pédale. Préparez la pince fine en enduisant une branche de plastique liquide et attendez quatre heures pour que le revêtement sèche ; une fois le plastique sec, enroulez étroitement 15 millimètres de l'extrémité de la branche opposée en AP avec une seule couche de fil à coudre en coton, puis fixez le fil en nouant l'extrémité en un nœud.Ensuite, à l’aide de ciseaux pointus, couper l’extrémité d’une aiguille hypodermique émoussée, suffisamment petite pour ne pas nuire à l’araignée, mais assez grande pour éviter toute obstruction. Limer l’ouverture avec du papier abrasif et fixer l’aiguille à un piège à déchets sous vide. Puis positionner horizontalement la pince de faible masse dans une position fermée serrée à l’aide d’un support biventral recouvert de vinyle fixé sur une base magnétique, sous le champ de vision d’un microscope stéréoscopique, avec la branche revêtue de plastique en haut et la branche recouverte de fil en bas.Ensuite, fixez une pince crocodile de l'électrode positive à la broche inférieure en amont du fil, et fixez une pince crocodile négative à l'aiguille métallique émoussée du vide. Placez ensuite le fil positif sur la broche de la pince à épiler entre le fil et la pince crocodile, et le fil négatif sur l'aiguille émoussée du vide. Pour tester le courant du circuit du voltmètre, appuyez sur la pédale afin de vous assurer qu'un courant suffisant est détecté, puis retirez les fils en portant des lunettes de protection.Préparez plusieurs microcapillaires pour la collecte du venin. Ensuite, placez une bande de pâte à modeler dans une boîte de Pétri et posez les microcapillaires sur cette bande. Tenez, avec une main gantée, un seul microcapillaire par une extrémité, tout en maintenant l'autre extrémité avec des pinces métalliques stériles au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen, puis éloignez cette extrémité de la flamme afin de former une pointe allongée, tout en gardant l'autre extrémité immobile. Examinez les extrémités des microcapillaires au microscope stéréoscopique et créez une petite ouverture biseautée à l'extrémité étirée à l’aide de pinces métalliques stérilisées.Fermez les tubes et placez-les sur de la glace. Pour commencer l'immobilisation de l'araignée, allumez le gaz de la chambre à CO2. Ensuite, transférez l'araignée à l’aide de pinces métalliques longues depuis le flacon de collecte en plastique fermé vers la chambre à CO2.Gardez l'araignée dans la chambre pendant cinq à dix minutes et vérifiez qu'elle ne bouge plus en la poussant doucement avec des pinces longues. Utilisez ensuite une pipette de transfert avec une solution saline pour humidifier le fil sur les pinces.Ensuite, retirez l'araignée anesthésiée de la chambre à CO2 en la prenant par ses pattes antérieures. À l'aide de pinces de dissection effilées et les mains gantées, déplacez l'araignée anesthésiée vers l'appareil à pinces de précision. Puis écartez les branches des pinces de précision fermées et placez le céphalothorax de l'araignée entre les branches.Fermez rapidement les pinces pour s'assurer que l'araignée est maintenue fermement en place sans être écrasée. Vérifiez aussitôt que l'araignée est positionnée avec le carapace dorsale vers le bas, reposant sur la pince recouverte de fil, tandis que la face ventrale est tournée vers le revêtement plastique et que l'électrode positive reste fixée à la pince inférieure. Ensuite, ajustez le grossissement, la mise au point et la source lumineuse du microscope stéréoscopique jusqu'à ce que les yeux et les crochets de l'araignée soient clairement visibles. Pour commencer la collecte du venin, allumez l'aspiration et vaporisez de l'eau sur le collier de l'araignée.À l’aide d’une deuxième aiguille de seringue à extrémité émoussée, aspirez l’eau avec une aiguille sous vide afin d’éliminer les impuretés. Ensuite, touchez le rostre de l’araignée avec l’aiguille sous vide connectée à l’électrode négative et délivrez une impulsion à l’aide de la pédale. Les pattes de l’araignée se contracteront et le venin sera visible sous forme de gouttelettes claires émergeant des crochets.Aspirez le régurgitat si nécessaire. Ensuite, collectez les gouttelettes de venin à l’aide de la microcapillaire et transférez la microcapillaire dans un tube de 0,5 millilitre contenant de l’eau, qui sera aspirée dans la capillaire. Évitez de percer l’araignée avec la capillaire et toute contamination de la capillaire par la soie ou la colle provenant des filières.Ensuite, fixez la seringue de transfert munie de l'adaptateur de tube au capillaire microscopique à l'extrémité opposée à la pointe de prélèvement, et réexpulsez la solution de venin dans le tube. Placez le tube sur de la glace, puis conservez les tubes contenant le venin à moins 80 degrés Celsius. Une fois terminé, après avoir fini la collecte du venin, placez un flacon de collecte en plastique ouvert, accompagné de son bouchon, à proximité de l'araignée. Pour un transfert rapide, saisissez délicatement les pattes de l'araignée avec des pinces de dissection émoussées tenues d'une main, et ouvrez soigneusement des pinces légères de l'autre main.Ensuite, faites glisser l'araignée dans le flacon de collecte à l'aide de pinces contondantes. Et refermez rapidement le bouchon. Deux à trois jours après la collecte du venin, anesthésiez l'araignée dans une chambre à CO2, puis remplissez un récipient d'azote liquide et placez-le à côté d'un microscope stéréoscopique. Nettoyez la zone de dissection et les pinces avec de l'ARN away.Ensuite, remplir une petite boîte de Pétri avec un x de saline au citrate de sodium, et la placer sous le microscope stéréoscopique. Puis, transférer l'araignée de la chambre à CO2 vers la boîte de Pétri et utiliser une pince pour séparer rapidement le céphalothorax de l'abdomen. Ensuite, maintenir le céphalothorax sous le microscope stéréoscopique à l’aide d’une pince et positionner le collier dans le champ de vision.Utilisez les extrémités pointues d'une deuxième paire de forceps pour couper la cuticule reliant le carabase aux régions latérales du collier latéralement. Saisissez le collier avec la deuxième paire de forceps et tirez doucement en avant et en arrière jusqu'à ce que les glandes à venin soient extraites. Ne pas dépasser 15 minutes.Séparez les glandes du collier et transférez-les dans un tube cryogénique sécurisé de 0,5 millilitre. Placez le tube fermé dans de l'azote liquide, en intégrant des techniques de spectrométrie de masse avec des bases de données de séquences générées à partir de l'ADNc des glandes de venin. Les bibliothèques ont permis l'identification de protéines du venin. Le peptide laro inept était l'une des 36 protéines identifiées dans le venin de veuve noire à l'aide de la spectrométrie de masse.N'oubliez pas que travailler avec des araignées comme les veuves noires peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses

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