Extraction de Venom et Venom Gland Microdissections des araignées pour protéomique et transcriptomique Analyses

L'objectif général de cette procédure est d'extraire du venin et de disséquer les glandes à venin d'araignées pour des études transcriptomiques et protéomiques ; cela est réalisé en préparant d'abord le matériel et les réactifs nécessaires à la collecte du venin par stimulation électrique. La deuxième étape consiste à immobiliser une araignée anesthésiée à l'aide de pinces sous un microscope stéréoscopique. Ensuite, l'araignée est soumise à des impulsions électriques et le venin libéré est recueilli à l'aide d'un capillaire microscopique.

La dernière étape consiste à disséquer les glandes à venin de l'araignée deux à trois jours plus tard. En fin de compte, la spectrométrie de masse ou d'autres analyses protéomiques du venin permettent d'obtenir les séquences des protéines composant le venin. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de collecte du venin sont difficiles à apprendre, impliquant une série d'actions coordonnées qui doivent être effectuées rapidement, mais avec précaution.

Pour commencer, branchez le cordon d'alimentation du stimulateur électrique à une prise et reliez la pédale externe à une entrée de signal externe. Ensuite, assurez-vous que l'interrupteur de polarité est en mode normal, puis reliez l'électrode positive à la borne de sortie rouge du stimulateur électrique et l'électrode négative à la borne de sortie noire. Réglez ensuite le stimulateur selon les paramètres initiaux recommandés suivants.

Testez la sortie de l'électrode en fixant des pinces crocodile aux fils de test positif et négatif du voltmètre. Ensuite, allumez l'interrupteur d'alimentation du stimulateur et délivrez le courant à l'aide de la pédale. Préparez la pince fine en enduisant une branche de plastique liquide et attendez quatre heures pour que le revêtement sèche ; une fois le plastique sec, enroulez étroitement 15 millimètres de l'extrémité de la branche opposée en AP avec une seule couche de fil à coudre en coton, puis fixez le fil en nouant l'extrémité en un nœud.

Ensuite, à l’aide de ciseaux pointus, couper l’extrémité d’une aiguille hypodermique émoussée, suffisamment petite pour ne pas nuire à l’araignée, mais assez grande pour éviter toute obstruction. Limer l’ouverture avec du papier abrasif et fixer l’aiguille à un piège à déchets sous vide. Puis positionner horizontalement la pince de faible masse dans une position fermée serrée à l’aide d’un support biventral recouvert de vinyle fixé sur une base magnétique, sous le champ de vision d’un microscope stéréoscopique, avec la branche revêtue de plastique en haut et la branche recouverte de fil en bas.

Ensuite, fixez une pince crocodile de l'électrode positive à la broche inférieure en amont du fil, et fixez une pince crocodile négative à l'aiguille métallique émoussée du vide. Placez ensuite le fil positif sur la broche de la pince à épiler entre le fil et la pince crocodile, et le fil négatif sur l'aiguille émoussée du vide. Pour tester le courant du circuit du voltmètre, appuyez sur la pédale afin de vous assurer qu'un courant suffisant est détecté, puis retirez les fils en portant des lunettes de protection.

Préparez plusieurs microcapillaires pour la collecte du venin. Ensuite, placez une bande de pâte à modeler dans une boîte de Pétri et posez les microcapillaires sur cette bande. Tenez, avec une main gantée, un seul microcapillaire par une extrémité, tout en maintenant l'autre extrémité avec des pinces métalliques stériles au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen, puis éloignez cette extrémité de la flamme afin de former une pointe allongée, tout en gardant l'autre extrémité immobile. Examinez les extrémités des microcapillaires au microscope stéréoscopique et créez une petite ouverture biseautée à l'extrémité étirée à l’aide de pinces métalliques stérilisées.

Fermez les tubes et placez-les sur de la glace. Pour commencer l'immobilisation de l'araignée, allumez le gaz de la chambre à CO2. Ensuite, transférez l'araignée à l’aide de pinces métalliques longues depuis le flacon de collecte en plastique fermé vers la chambre à CO2.

Gardez l'araignée dans la chambre pendant cinq à dix minutes et vérifiez qu'elle ne bouge plus en la poussant doucement avec des pinces longues. Utilisez ensuite une pipette de transfert avec une solution saline pour humidifier le fil sur les pinces.

Ensuite, retirez l'araignée anesthésiée de la chambre à CO2 en la prenant par ses pattes antérieures. À l'aide de pinces de dissection effilées et les mains gantées, déplacez l'araignée anesthésiée vers l'appareil à pinces de précision. Puis écartez les branches des pinces de précision fermées et placez le céphalothorax de l'araignée entre les branches.

Fermez rapidement les pinces pour s'assurer que l'araignée est maintenue fermement en place sans être écrasée. Vérifiez aussitôt que l'araignée est positionnée avec le carapace dorsale vers le bas, reposant sur la pince recouverte de fil, tandis que la face ventrale est tournée vers le revêtement plastique et que l'électrode positive reste fixée à la pince inférieure. Ensuite, ajustez le grossissement, la mise au point et la source lumineuse du microscope stéréoscopique jusqu'à ce que les yeux et les crochets de l'araignée soient clairement visibles. Pour commencer la collecte du venin, allumez l'aspiration et vaporisez de l'eau sur le collier de l'araignée.

À l’aide d’une deuxième aiguille de seringue à extrémité émoussée, aspirez l’eau avec une aiguille sous vide afin d’éliminer les impuretés. Ensuite, touchez le rostre de l’araignée avec l’aiguille sous vide connectée à l’électrode négative et délivrez une impulsion à l’aide de la pédale. Les pattes de l’araignée se contracteront et le venin sera visible sous forme de gouttelettes claires émergeant des crochets.

Aspirez le régurgitat si nécessaire. Ensuite, collectez les gouttelettes de venin à l’aide de la microcapillaire et transférez la microcapillaire dans un tube de 0,5 millilitre contenant de l’eau, qui sera aspirée dans la capillaire. Évitez de percer l’araignée avec la capillaire et toute contamination de la capillaire par la soie ou la colle provenant des filières.

Ensuite, fixez la seringue de transfert munie de l'adaptateur de tube au capillaire microscopique à l'extrémité opposée à la pointe de prélèvement, et réexpulsez la solution de venin dans le tube. Placez le tube sur de la glace, puis conservez les tubes contenant le venin à moins 80 degrés Celsius. Une fois terminé, après avoir fini la collecte du venin, placez un flacon de collecte en plastique ouvert, accompagné de son bouchon, à proximité de l'araignée. Pour un transfert rapide, saisissez délicatement les pattes de l'araignée avec des pinces de dissection émoussées tenues d'une main, et ouvrez soigneusement des pinces légères de l'autre main.

Ensuite, faites glisser l'araignée dans le flacon de collecte à l'aide de pinces contondantes. Et refermez rapidement le bouchon. Deux à trois jours après la collecte du venin, anesthésiez l'araignée dans une chambre à CO2, puis remplissez un récipient d'azote liquide et placez-le à côté d'un microscope stéréoscopique. Nettoyez la zone de dissection et les pinces avec de l'ARN away.

Ensuite, remplir une petite boîte de Pétri avec un x de saline au citrate de sodium, et la placer sous le microscope stéréoscopique. Puis, transférer l'araignée de la chambre à CO2 vers la boîte de Pétri et utiliser une pince pour séparer rapidement le céphalothorax de l'abdomen. Ensuite, maintenir le céphalothorax sous le microscope stéréoscopique à l’aide d’une pince et positionner le collier dans le champ de vision.

Utilisez les extrémités pointues d'une deuxième paire de forceps pour couper la cuticule reliant le carabase aux régions latérales du collier latéralement. Saisissez le collier avec la deuxième paire de forceps et tirez doucement en avant et en arrière jusqu'à ce que les glandes à venin soient extraites. Ne pas dépasser 15 minutes.

Séparez les glandes du collier et transférez-les dans un tube cryogénique sécurisé de 0,5 millilitre. Placez le tube fermé dans de l'azote liquide, en intégrant des techniques de spectrométrie de masse avec des bases de données de séquences générées à partir de l'ADNc des glandes de venin. Les bibliothèques ont permis l'identification de protéines du venin. Le peptide laro inept était l'une des 36 protéines identifiées dans le venin de veuve noire à l'aide de la spectrométrie de masse.

N'oubliez pas que travailler avec des araignées comme les veuves noires peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.