Name: Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Apprenez à isoler des cholangiocytes extra-hépatiques néonataux de souris par dissection méticuleuse et culture sur gels de collagne épais. Cette technique permet d'obtenir des monocouches pures pour étudier le développement des voies biliaires.

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Les auteurs sont reconnaissants à la pathologie moléculaire et imagerie de base du Centre NIDDK UPenn d&#39;études moléculaires dans des maladies digestives et hépatiques (P30 DK50306) pour l&#39;aide à l&#39;imagerie. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (R01 DK-092111) et de Fred et Suzanne Biesecker pédiatrique foie Center (à PBE) et par une bourse de recherche sur les maladies du foie et de l&#39;éducation de la petite enfance réseau (à SK).

Toute la procédure est effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. Tous les travaux des animaux doit être effectué dans des conditions humaines en vertu d&#39;un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection des locaux et l&#39;utilisation des animaux (IACUC). 1. Préparation de l&#39;équipement et Solutions <ol><li> Mettre en place la table chirurgicale de la souris à proximité de la hotte de culture de tissu et l&#39;incubateur (Figure 1A). Remarque: L&#39;équipement nécessaire comprend un microscope de dissection, une source de lumière, de 12,5 cm de long ciseaux iris droites, 6 pouces pince courbe en dents de scie non avec des pointes fines, et 4 pouces de pince dents de scie avec des pointes courbes (figure 1B). </li><li> Placez instruments stérilisés dans un bécher en verre de 70% d&#39;alcool sur la table d&#39;opération. </li><li> Remplir trois 60 mm boîtes de Pétri stériles avec les médias de l&#39;isolement stérile (tableau 1); placer deux sur la table chirurgicale et un dans le capot, le tout sur la glace. </li><li> Placez collagène de queue de rat,stérile 10x tampon phosphate salin (PBS), de l&#39;eau stérile, NaOH stérile 1 et biliaire cellules épithéliales (BEC) des médias (tableau 1) dans la hotte de culture de tissus. Remarque: Le collagène doit être sur la glace. </li></ol> 2. Cholagogue Isolement et culture <ol><li> Euthanasier les souris néonatale entre 0-3 jours de la vie, par exposition au dioxyde de carbone jusqu&#39;à inconscient suivie par dislocation cervicale, conformément aux lignes directrices du IACUC (figure 1C). Remarque: les souris plus âgées peuvent être utilisés en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. </li><li> Placer l&#39;animal en décubitus dorsal et une petite incision horizontale traversant la ligne médiane dans la région du bassin. Étendre cette incision latéralement et vers le haut des deux côtés de l&#39;abdomen, en formant un rabat en forme d&#39;U. Tournez rabat pour exposer les organes abdominaux. Une fois que l&#39;abdomen est ouvert, déplacer soigneusement les intestins hors de la cavité abdominale vers la droite de l&#39;animal pour une meilleure visualisation du foie et de la voie biliaire principale. Remarque: il peut être nécessaire d&#39;étendre les incisions latérales dans la cage thoracique d&#39;obtenir une meilleure identification du foie. </li><li> Utilisation du microscope à dissection, d&#39;identifier la voie biliaire, du foie et des intestins. Identifier le canal cholédoque premier (figure 1D), en utilisant la prudence, car les structures sont très délicates. Avec les pinces dentelées et non dentelées, méticuleusement propre et enlever le tissu conjonctif y compris la graisse autour de la bile. Utiliser une pince pour maintenir le conduit et l&#39;autre pour le nettoyage. </li><li> Utiliser une technique similaire pour nettoyer la vésicule biliaire. </li><li> Placer les conduits nettoyés et la vésicule biliaire dans le premier plat de milieux d&#39;isolement sur la glace. Massez doucement les structures avec les forceps non dentelés tandis que dans les médias pour éliminer davantage le tissu conjonctif et enlever la bile de la vésicule biliaire. </li><li> Transférer les conduits et la vésicule biliaire à la deuxième plat de milieux d&#39;isolement. </li><li> Après isolement de conduites et de la vésicule biliaire à partir de 5 animaux, transférer lepièces à la troisième boîte de Pétri, dans la hotte. Remarque: si les cellules doivent être isolé à partir de plus de cinq animaux, faire en lots, en utilisant des solutions fraîches pour chaque groupe de 5 animaux. </li><li> Préparer des gels de collagène épais dans la hotte de culture de tissus: Remarque: tous les plats de taille peut être utilisé. Une boîte de culture de 60 mm avec un volume final de 3 ml de collagène pour chaque groupe de 5 nouveau-nés fonctionne bien. Ce doit être préparé au moment de l&#39;intégration conduits fraîchement isolés. <ol><li> Placer rat tail collagène, 10x stérile saline tamponnée au phosphate (PBS 10x), dH 2 O stérile, et N NaOH stérile sur de la glace 1. </li><li> Calculer les volumes de dH 2 0, 10x PBS, NaOH, et le collagène nécessaire pour des gels ayant une concentration finale de 2 mg / ml de collagène dans du PBS 1x, en utilisant un volume de 1 N de NaOH égale à 0,023 fois le volume de collagène ajoutée. Remarque: Si autre source de collagène est utilisé, suivre les instructions du fabricant pour la neutralisation et la formation de gel. </li><li> Mélanger dH 2 0, 10x PBS, et 1 N NaOH, puis ajouter le collagène et pipette bien pour assurer un mélange homogène. </li></ol></li><li> Une fois que la solution de collagène est épaissie à une consistance de gel à la température ambiante, immédiatement incorporer les conduits dans le collagène. </li><li> Placer à l&#39;étuve à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 30 minutes pour permettre au collagène de se solidifier. </li><li> Une fois gel a solidifié (couleur passe de transparent à blanc), superposition avec 3,5 ml de milieu BEC (tableau 1) et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Retirez le support BEC 3 fois par semaine et le remplacer par 3,5 ml de milieu frais. </li></ol> 3. Cholangiocytes à isolation primaire du collagène épais Gels Remarque: dans les 3 semaines, feuilles de cholangiocytes (cellules avec de gros noyaux s&#39;étendant directement à partir de conduits intégrés) seront visibles dans le collagène d&#39;épaisseur. Si il ya un grand nombre de fibroblastes dans le plat, il doit être jeté. Si quelques régions du plat ontcroissance de fibroblastes, ceux-ci peut être découpé avec un scalpel et enlevée avant le fractionnement des cholangiocytes. <ol><li> Préparer minces gels de collagène: <ol><li> Diluer le collagène à une concentration de 1 mg / ml avec du PBS stérile. Remarque: utiliser 1 ml pour 100 plaque mm; ajuster en conséquence pour d&#39;autres plats de taille. </li><li> Fais la solution de collagène uniformément avec une spatule de cellule (grands plats) ou de la pointe de la pipette (petits plats), puis laisser à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Couvrir la plaque avec DMEM/F12 et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 10 min. </li><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et laver avec du PBS 1X. Aspirer immédiatement 1x PBS. </li><li> Manteau avec une seconde couche mince de collagène, d&#39;étalement par rotation de la plaque ou plaque de placer sur un agitateur. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 10 min. </li><li> Après collagène est solidifié, la plaque de couverture avec DMEM/F12 et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 30 min. </li></ol></li><li> Diviser les cellules de egels ick de collagène: <ol><li> Avec une spatule de culture cellulaire ou d&#39;un grattoir de cellules, gratter doucement gel de collagène de la plaque de sorte qu&#39;elle est flottant. </li><li> Préparer une solution de collagénase en diluant de type XI collagénase (voir la liste des matériaux) à 10 mg / ml avec DMEM/F12. Mélangez bien et filtre stérile. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de collagénase (ci-dessus) par boîte de 60 mm de cellules en collagène d&#39;épaisseur. Ne retirez pas le support BEC (qui devrait être de 3 ml). Incuber plat pendant 30 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Retirer la solution contenant des cellules, et placer dans 15 ml de tube conique. </li><li> Isoler à 2200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre suspendre le culot dans un volume similaire de DMEM/F12. </li><li> Spin nouveau solution à 2200 g pendant 5 min. Retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 3 ml de trypsine à 0,5%, et les incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 5 min. Après incubation, la pipette la solution de haut en bas pour briser les feuilles de cholangiocytes. Ajouter 5 ml de BEC médias unesolution de filage ème à 1500 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot en DMEM/F12, puis tourner solution à 1500 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et re suspendre le culot dans les médias BEC (tableau 1). Cellules de la plaque sur faites précédemment minces gels de collagène. </li></ol></li></ol> 4. Passage et le stockage des cellules Note: les cellules minces sur des gels de collagène peuvent être divisées selon les besoins. <ol><li> Laver les plaques avec du PBS stérile avant l&#39;incubation dans 0,25% de trypsine à 37 ° C pendant 10 à 15 min. </li><li> Neutraliser avec un volume égal de milieu BEC, et un culot à 1500 g pendant 5 min. Rincer culot avec DMEM/F12, alors culot à 1500 g pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans des milieux BEC pour la distribution de collagène revêtu des boîtes de culture cellulaire. Remarque: En variante, les cellules peuvent être remises en suspension dans un support de stockage et stockées dans un congélateur C -80 ° ou de l&#39;azote liquide (tableau 1). </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
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<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
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<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts.

Décrite ici est une technique pour isoler cholangiocytes pures à partir des voies biliaires extra-hépatiques de souris de souris de tous les âges, y compris les nouveau-nés. La technique offre l&#39;avantage que cholangiocytes extra-hépatiques peuvent être étudiés séparément cholangiocytes intra-hépatiques, et peut faciliter les études pour identifier les principales différences entre ces populations de cellules. Nous avons récemment publié une étude démontrant diminué cils dans cholangiocytes extra-hépatiques isolés pa...

L&#39;origine et le développement de cholangiocytes intra et extra-hépatiques sont nettement différents. Le foie se développe à partir d&#39;un diverticule de l&#39;intestin antérieur endoderme ventral 5. La région caudale du diverticule forme l&#39;arbre biliaire extra-hépatique, tandis que la région crânienne génère l&#39;arbre biliaire intrahépatique 5. Cholangiocytes de conduits intrahépatiques sont dérivées de cellules progénitrices autour de la plaque canalaire dans les régions péri portail 6. Ces cellules ont la capacité de se différencier en hépatocytes ou soit des cholangiocytes 6. Cela a d&#39;importantes implications cliniques étant donné que cholangiopathies peuvent cibler spécifiquement une catégorie de cholangiocytes. Par exemple, l&#39;atrésie biliaire affecte d&#39;abord les canaux extra-hépatiques du nouveau-né, alors que le syndrome d&#39;Alagille affecte voies biliaires intrahépatiques. Il existe des descriptions multiples de l&#39;isolement des cholangiocytes intra-hépatiques et les unités de la voie biliaire à partir des souris et des rats. Dansinvestigateurs ont isolé des cellules individuelles par l&#39;isolement de la gaine et l&#39;excroissance subséquente, ou par digestion du foie et de la tirer vers le bas anticorps cholangiocytes exprimant des marqueurs de surface cellulaire spécifiques 4.1. Les unités des canaux biliaires fonctionnels et polarisés ont été isolées par digestion du foie et de la filtration de la taille 7. Biliaires unités de conduits sont capables de répondre à des stimuli de sécrétion et de démontrer la sécrétion de liquide 7, tandis que il a été démontré cholangiocytes isolés à développer des structures canalaire in vitro 1,2. Limites de ces méthodes comprennent la nécessité d&#39;une expertise technique spécialisée et un équipement spécial pour la perfusion du foie avec des enzymes digestives. En outre, il existe un risque de contamination par des cellules mésenchymateuses 3. Procédé pour isoler extrahépatiques cholangiocytes des canaux biliaires, en particulier de voies biliaires extra-hépatiques néonatales, n&#39;a pas été précédemment décrit. Le présent document décrit une technique simplifiée pour isoler un nouveau-nés ainsi que des cellules des canaux biliaires extra-hépatiques adultes à des niveaux élevés de pureté. Cette technique facilitera l&#39;étude des différences entre cholangiocytes et la recherche sur les mécanismes des maladies comme atrésie des voies biliaires qui impliquent les conduits extra-hépatiques et extra-hépatiques intra.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, utilisé dans les milieux BEC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, utilisé dans les milieux BEC</td></tr><tr><td>MEM avec des acides aminés non essentiels</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, utilisé dans les milieux BEC</td></tr><tr><td>Insuline-transfertrine-sélénium</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, utilisé dans les milieux BEC</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, utilisé dans les milieux BEC</td></tr><tr><td>Concentré de lipides chimiquement définis</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, utilisé dans les milieux BEC</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 &#956 ; l dans l’isolement</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0,2 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 &#956 ; l dans l’isolement</td></tr><tr><td>Éthanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0,13 ml, utilisé dans le milieu BEC</td></tr> Solution <tr><td>vitaminique MEM</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, utilisé dans le milieu BEC</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de soja</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, utilisé dans le milieu BEC. Le solvant est PBS, mélanger à 5 mg/ml concentration de stock</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, utilisé dans le milieu BEC</td></tr><tr><td>Extrait hypophysaire bovin</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1,1 ml, utilisé dans le milieu BEC</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0,5 ml, utilisé dans le milieu BEC, Stock conc 393 &#956 ; g/ml dilué avec</td></tr> de <tr><td>l’éthanol 3 3',5-triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,5 ml, utilisé dans les milieux BEC, Stock conc 3,4 mg/ml dilué avec de l’éthanol</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0,5 ml, utilisé dans les milieux BEC, 25 &#956 ; g/ml dilué avec DMEM F12+1 %BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml, utilisé dans les milieux BEC, à utiliser à une concentration de base de 0,411 mg/ml et dilué avec DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 &#956 ; l dans l’isolement</td></tr><tr><td>Collagène à queue de rat</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variable en fonction de la concentration de collagène</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>utilisation à 10x, sterlie, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration</td></tr><tr><td>de collagène dH2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>stérile, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration de collagène</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Diluer à 1 N, stérile, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration de collagène</td></tr><tr><td>collagénase de type XI de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>diluer dans du DMEM et un filtre stérile avant utilisation</td></tr><tr><td>trypsine-EDTA (1x) 0,25</td> %<td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, incuber max 10 min</td></tr><tr><td>trypsine-EDTA (10x) 0,5 %</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, incubation max 10 min</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Autres modèles acceptables</td></tr><tr><td>Source lumineuse (illuminateur à fibre optique)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Autres modèles acceptables</td></tr><tr><td>12,5 cm ciseaux à iris droits</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Autres modèles acceptables</td></tr><tr><td>Pince incurvée non dentelée 6" avec pointes fines</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td></td><td>Autres modèles</td></tr><tr><td>acceptables Pince en acier inoxydable dentelée de 4 po avec pointes fines</td><td>Sciences de la microscopie</td><td></td> électronique <td>Autres modèles acceptables</td></tr></tbody></table>

isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Les canaux biliaires intra et extra-hépatiques du foie sont distincts de développement, et peuvent être affectés différemment par certaines maladies. Toutefois, les différences entre cholangiocytes intra et extra-hépatiques, et entre les cellules néonatales et adultes, ne sont pas bien comprises. Méthodes pour l&#39;isolement de cholangiocytes de canaux biliaires intra-hépatiques sont bien établis 1-4. Isolement de cellules canalaires extra-hépatiques, en particulier du nouveau-né, n&#39;a pas encore été décrit, bien que ce serait d&#39;une grande utilité dans la compréhension des différences entre les populations de cholangiocytes distinctes et dans l&#39;étude des maladies telles que l&#39;atrésie biliaire qui semblent cibler les canaux extra-hépatiques. Décrit ici est une technique optimisée pour isoler les cellules des voies biliaires extra-hépatiques deux nouveau-nés et de la souris adulte. Cette technique donne une population de cellules avec une contamination minimale pur à partir de cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes. Cette méthod est basé sur l&#39;enlèvement des canaux extra-hépatiques et de la vésicule biliaire, suivie par une dissection minutieuse et gratter pour enlever les couches de graisse et des fibroblastes. Les structures sont noyées dans des couches épaisses de collagène et cultivées pendant 3 semaines environ pour permettre excroissance de cholangiocytes en monocouches, qui peuvent ensuite être traitées à la trypsine et étalées re pour une utilisation expérimentale.

L&#39;utilisation de ce protocole les résultats dans l&#39;isolement d&#39;une population de nouveau-nés cholangiocytes extra-hépatiques de souris avec une excellente pureté, tel que démontré par K19 immunofluorescence (Figures 2A et 2B); nous obtenons des résultats similaires à isoler des cellules de souris adultes. Nous avons observé que cela prend 3 semaines pour les cellules de canaux biliaires fraîchement isolées pour former des monocouches sur des gels de collagène épais. Les cholangiocytes croîtr...

Une technique pour isoler cholangiocytes des voies biliaires extra-hépatiques de souris néonatale est décrite. Les conduits sont méticuleusement disséqués, puis les cellules sont isolées par l&#39;excroissance dans des gels de collagène épaisses. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier extrahépatique bile développement conduit et la pathologie.

Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de cultiver des cholangiocytes extra-hépatiques neuronaux néonatals. Cela est réalisé en exposant d'abord chirurgicalement les organes abdominaux afin d'accéder au foie et aux voies biliaires. La deuxième étape de la procédure consiste à retirer méticuleusement les tissus conjonctifs et les graisses entourant les voies biliaires et la vésicule biliaire.Les voies biliaires et la vésicule biliaire nettoyées sont ensuite placées sur des gels de collagène épais et cultivées pendant trois semaines. Les cholangiocytes migrent à partir des canaux et sont divisés sur des gels de collagène fins pour une culture supplémentaire. En fin de compte, les résultats montrent des monocouches de cholangiocytes purs par microscopie en immunofluorescence.En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent généralement des difficultés dues à des problèmes techniques liés à la technique de dissection, ainsi qu'au nettoyage des petits canaux biliaires. Pour cette procédure, installer une table chirurgicale pour souris près de la hotte de culture tissulaire et de l'incubateur. Placer tous les instruments chirurgicaux stérilisés dans un bécher contenant de l'éthanol à 70 %.Placer trois boîtes de Pétri de 60 millimètres contenant du milieu sur de la glace. Deux boîtes sont nécessaires sur la table chirurgicale, mais garder les autres matériaux dans la hotte. Le collagène doit être conservé sur de la glice.Commencez par placer une souris néonatale euthanasiée âgée de zéro à trois jours en position dorsale sur la planche de dissection. Faites une petite incision horizontale le long de la ligne médiane près du pelvis. Prolongez l'incision vers le haut des deux côtés, formant un lambeau en forme de U, afin d'exposer les organes.Maintenant, déplacez délicatement les intestins vers la droite de l'abdomen. Pour visualiser le foie et le canal cholédoque, prolongez les incisions cutanées afin d'agrandir le lambeau si nécessaire. Sous la loupe binoculaire, identifiez soigneusement le canal cholédoque commun et nettoyez-le. Retirez le tissu conjonctif et la graisse environnante. Ensuite, faites de même. Pour nettoyer la vésicule biliaire, retirez le canal cholédoque et la vésicule biliaire, puis placez-les dans l'un des plats préparés à cet effet.Masser les structures à l’aide de pinces non graduées pour retirer davantage de tissu conjonctif et éliminer la bile. Ensuite, transférer les tissus propres dans la deuxième boîte. Répéter cette procédure jusqu’à ce que le tissu soit collecté à partir exactement de cinq nouveau-nés.Commencez par préparer un gel de collagène épais. Préparez-le toujours frais en premier lieu. Rassemblez toutes les solutions stérilisées sur de la glace. Calculez les volumes nécessaires pour obtenir deux milligrammes de collagène par millilitre d'une XPBS. Ajoutez 0,023 partie d'hydroxyde de sodium à chaque partie de collagène. Mélangez les aliquotes ensemble à température ambiante en pipetant.Il est essentiel de mélanger le phosphate tamponné salin (PBS), l'hydroxyde de sodium et l'eau distillée avant d'ajouter le collagène. Le collagène en solution mère doit être le dernier composant ajouté au gel, et la solution finale doit être pipetée. Cela empêche le collagène de s'agglomérer.Lorsque la solution commence à prendre une consistance proche de celle d'un gel, inclure immédiatement les tissus isolés, puis transférer les tissus inclus dans l'incubateur pendant 30 minutes afin de permettre la solidification. Une fois solidifiés, recouvrir le gel de 3,5 millilitres de milieu BEC et poursuivre l'incubation par la suite. Renouveler le milieu BEC trois fois par semaine. En moins de trois semaines, des feuillets cellulaires présentant de grands noyaux s'étendant à partir des conduits inclus se formeront.Voici les cholangiocytes. Si la boîte contient une population importante de fibroblastes, à moins qu’ils puissent être retirés, la boîte doit être jetée. Préparez maintenant des gels de collagène minces avec un milligramme de collagène par millilitre de PBS, appliquez un millilitre sur une plaque de 100 millimètres, répartissez uniformément le collagène et attendez 10 minutes.Après 10 minutes, recouvrir la plaque avec sept millilitres de DM EMF 12 et l'incuber pendant 10 minutes. Après cette courte incubation, laver rapidement le collagène avec un XPBS. Éliminer tout le PBS par aspiration, puis ajouter une seconde couche de collagène exactement comme cela a été fait pour former la première couche.Une fois solidifié, recouvrir la plaque avec du DMF 12 et l'incuber pendant 30 minutes. Détacher maintenant les cellules des gels épais. Commencer par détacher délicatement la collagène de la plaque à l’aide d'une spatule ou d'un racloir, afin qu'elle flotte librement.Ensuite, préparez une solution filtrée de collagénase et ajoutez un millilitre dans chaque boîte de 60 millimètres contenant du collagène épais. Transférez ensuite les boîtes dans l'incubateur. Après une incubation de 30 minutes, retirez toute la solution contenant les cellules et transférez-la dans un tube de 15 millilitres.Faites centrifuger le tube et retirez le surnageant par aspiration. Resuspendez le culot dans 4,5 millilitres de milieu DMEM/F12 et centrifugez à nouveau. Resuspendez le culot dans trois millilitres de trypsine 0,5 %, puis incubez les cellules à 37 °C pendant cinq minutes, durant lesquelles les feuillets cellulaires se détacheront.Après cinq minutes, faire passer les agrégats à travers une pipette de cinq ou dix millilitres jusqu'à ce qu'ils se disloquent. Ensuite, ajouter cinq millilitres de milieu BEC et centrifuger les cellules. Une troisième reprise. Suspendre le culot dans le milieu DMM F 12 comme étape de lavage, puis recentrifuger les cellules. Resuspendre maintenant les cellules dans le milieu BEC et les mettre en culture sur la couche mince préparée. Les gélatines de collagène permettent la croissance des cellules ; les repiquer sur des gélatines de collagène selon les besoins.En utilisant le protocole décrit, une population de cholédocytes extra-hépatiques de souriceau présentant une excellente pureté a été isolée et marquée par immunofluorescence contre la kératine 19. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode permettant d'isoler une population pure de cholédocytes extra-hépatiques de souriceau par une combinaison de dissection minutieuse des canaux biliaires et de culture sur gel de collagène épais.

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JoVE Journal

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Biologie

Nous décrivons ici l'isolement des cellules souches CD133 exprimer foie et les cellules souches du cancer du foie murin ensemble, un processus qui nécessite la digestion des tissus, l'enrichissement des cellules, et l'isolement de cytométrie en flux. Nous incluent des méthodes pour l'isolement cellulaire de pointe unique et l'expansion clonale.

Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l&#39;expansion clonale

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.

Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Ce protocole décrit la production d’une souris biliaires extrahépatiques organoïde 3-dimensions. Ces organoïdes biliaires peuvent être maintenues en culture pour étudier la biologie cholangiocyte. Organoïdes biliaires expriment des marqueurs des cellules biliaires et géniteur et sont composées de cellules épithéliales polarisées.

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Présenté ici est un protocole pour l'isolement des hépatocytes de souris des foies adultes de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la culture à long terme des hépatocytes dans un arrangement 3D de sandwich de collagène aussi bien que l'immunolabeling des composants cytosquelettiques pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse au traitement.

Isolement et 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Ce protocole détaille l’utilisation d’un cathéter intraveineux spécial, d’un tube jetable stérile standardisé, d’un contrôle de la température complété par une surveillance en temps réel et d’un système d’alarme pour la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes afin d’améliorer la cohérence de la viabilité, du rendement et de la fonctionnalité des hépatocytes primaires isolés chez le rat.

Isolement des hépatocytes primaires de rat avec contrôle de perfusion multiparamétrique

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Pour l’observation des troubles des voies biliaires néonatales murines, un canal biliaire intact et une préparation efficace sont nécessaires. Par conséquent, une nouvelle approche pour isoler l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques chez les nouveau-nés murins a été développée avec succès tout en maintenant l’intégrité des voies biliaires.

Dissection des canaux biliaires extrahépatiques et de la vésicule biliaire chez les nouveau-nés de souris âgés de neuf jours

Les hépatocytes chargés de lipides sont inhérents à la régénération du foie, mais sont généralement perdus lors de la centrifugation par gradient de densité. Ici, nous présentons un protocole d’isolement cellulaire optimisé qui conserve les hépatocytes stéatotiques, produisant des populations représentatives d’hépatocytes en régénération après hépatectomie partielle chez la souris.

Isolement des hépatocytes régénérants après hépatectomie partielle chez la souris

Apprenez à isoler des cholangiocytes extra-hépatiques néonataux de souris par dissection méticuleuse et culture sur gels de collagne épais. Cette technique permet d'obtenir des monocouches pures pour étudier le développement des voies biliaires.

Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

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