Méthodes pour caractériser spontanée et induite par Locomotion sursaut dans un modèle de la maladie de Parkinson induite de la roténone-de

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer la locomotion induite par un sursaut et la locomotion spontanée à long terme dans un modèle de maladie de Parkinson induit par la roténone chez la drosophile, ce qui est réalisé en élevant des drosophiles sur un milieu alimentaire enrichi en roténone afin d'induire le phénotype. Dans un deuxième temps, les mouches sont soumises à un test de réponse au sursaut et à un test de locomotion spontanée à long terme utilisant un appareil constitué de deux flacons. Dans un moniteur d'activité de drosophile, les résultats montrent que l'exposition à la roténone provoque des défauts de locomotion chez la drosophile, basés sur la quantification de la réponse au sursaut et de la locomotion spontanée à long terme.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la drosophile, notamment dans les modèles de troubles neurodégénératifs et de troubles de la locomotion, tels que les défauts de locomotion induite par un sursaut ou la locomotion spontanée à long terme. Pour commencer, ajoutez 1,5 gramme de milieu instantané pour drosophiles. Dans un flacon standard pour mouches, constituez le milieu avec cinq millilitres d'eau déionisée contenant la dose appropriée de roténone.

Ensuite, anesthésiez huit à douze mouches mâles âgées d'un à trois jours à l'aide de dioxyde de carbone et transférez-les dans des flacons contenant le médicament. Laissez les mouches se remettre de l'anesthésie pendant 20 minutes avec le flacon en position horizontale, grâce à la nourriture supplémentée. Puis placez le flacon en position verticale dans un incubateur à cycle lumineux de 12 heures par jour, à 25 degrés Celsius, pour la durée restante de l'expérience.

Ensuite, retournez un flacon standard à mouches sur un autre flacon et scellez la jointure avec du ruban adhésif afin de créer un dispositif composé de deux flacons. Puis, divisez ce double flacon en trois sections égales de 6,33 centimètres en traçant des cercles autour des flacons à l’aide d’un marqueur indélébile. Après trois jours d’exposition au médicament, transférez les mouches dans le dispositif double flacon.

Remplacer le ruban adhésif sur la jointure permet aux mouches de s'acclimater au nouvel environnement pendant 15 minutes. Ensuite, placer les tubes sur un fond blanc et installer l'appareil photo numérique. S'assurer que l'appareil entier est visible dans un seul cadre d'image, que l'appareil double de tubes et le chronomètre sont en vue, et que toutes les mouches sont nettes.

Marquez l'emplacement de la caméra et du flacon afin de maintenir des cadres cohérents entre les essais, et affichez clairement le numéro de l'essai et le traitement médicamenteux dans le champ de la caméra. Ensuite, tapez fermement trois fois l'appareil à double flacon contre le plan de travail et assurez-vous que toutes les mouches tombent au fond du flacon, puis démarrez immédiatement le chronomètre. Prenez une photo de l'appareil toutes les cinq secondes pendant une minute.

Ensuite, laisser les mouches se rétablir sans perturbation pendant une minute. Répéter le test deux fois supplémentaires avec des périodes de récupération d'une minute entre chaque essai. Examiner les images et noter le nombre de mouches dans chaque section au fil du temps afin d'effectuer les calculs permettant de reconstituer trois grammes d'oph instantané, un milieu contenant 15 millilitres d'eau déionisée et la dose appropriée de roténone.

Après cinq minutes, placez soigneusement les tubes verticalement dans des vials transparents et chargez la nourriture ferme à une hauteur d'un centimètre en tournant le tube. Ensuite, poussez délicatement le bouchon en plastique à l'extrémité du tube, en évitant la formation de bulles d'air. Sédez des mouches mâles âgées d'un jour à l'aide de dioxyde de carbone et insérez soigneusement une mouche dans chaque tube à l'aide d'un pinceau.

Ensuite, boucher l'extrémité du tube avec une petite boule de coton. Laisser les mouches se remettre du dioxyde de carbone en maintenant les tubes en position horizontale pendant 15 minutes, et s'assurer que toutes les mouches sont vivantes et actives. Insérer les tubes dans le moniteur d'activité des drosophiles (DAM) et vérifier que tous les tubes sont placés dans la même position par rapport au DAM.

Placer le DAM dans un incubateur lumineux de 12 heures sur 12 d'obscurité à 25 degrés Celsius. Ensuite, connecter le DAM au système de collecte de données. Puis ouvrir le logiciel du DAM dans les préférences.

Sélectionnez une durée de tranche de 10 minutes pour commencer la collecte de données, puis laissez le programme recueillir les données pendant sept jours. Ensuite, ouvrez le programme de numérisation du fichier DAM et accédez aux données du moniteur en cliquant sur « sélectionner les données d'entrée ». Puis, sélectionnez la plage de moniteur appropriée et réglez la durée des tranches sur des intervalles de 10 minutes.

Ensuite, dans le type de fichier de sortie, choisissez les fichiers de canal et laissez tous les autres paramètres à leurs valeurs par défaut. Cliquez ensuite sur analyser les données et enregistrez les fichiers dans un dossier désigné. Enfin, importez les données dans un logiciel d'analyse de données circadiennes pour obtenir les impulsions par minute.

Après trois jours d'exposition à différentes doses de roone, les mouches de type sauvage Canton s exposées à des doses croissantes ont montré un déficit de réponse au sursaut. Un pourcentage plus faible de mouches se trouvait dans la section supérieure et un pourcentage plus élevé dans la section inférieure de l'appareil après 30 secondes, ce qui indique un déficit de la réponse saral ; une tendance similaire a été observée pour les mouches dans le test de locomotion spontanée. Le nombre de passages par minute a été mesuré dans le moniteur d'activité des drosophiles (DAM).

Quatre jours après l'exposition, les mouches exposées à 250 micromolaires et 500 micromolaires de rotenone présentent une réduction significative des impulsions par minute. Ces tests peuvent être facilement adaptés pour caractériser les défauts de locomotion dans d'autres modèles œsophagiens de maladie et l'efficacité d'agents thérapeutiques.