Name: Lutilisation des tableaux cibles fluorescentes pour lévaluation des réponses des cellules T In vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Apprenez à générer des tableaux cibles fluorescents pour évaluer les réponses des cellules T in vivo par cytométrie en flux. Cette méthode permet de mesurer simultanément plus de 250 paramètres immunologiques.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du projet # 1010395 (BQ et CP) et # 525431 (CR), et un programme de subventions # 455395 (CP) du Conseil de recherches en santé et médical national de l&#39;Australie, un Centre australien pour l&#39;hépatite et le VIH Virologie EOI 2012 subvention (CR et JJR) et une subvention de la Fondation Gordon Bouvier et Gretel (BQ et CR). Nous tenons à remercier Harpreet Vohra et Michael Devoy pour leur excellent entretien du laboratoire JCSMR FACS, le Fonds australien Cancer Research Foundation biomoléculaire ressources, JCSMR, ANU, pour la synthèse peptidique, et le Dr David Boyle, CSIRO animaux laboratoires de santé, Geelong, Australie pour fournir les mères VIH stocks de vaccins.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
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<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
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<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
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<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;avantage de tests basés sur l&#39;ALE est qu&#39;elles permettent la discrimination de&gt; 250 populations de cellules cibles viable et pleinement fonctionnel à partir d&#39;un seul animal hôte par cytométrie de flux. Cela fournit un niveau de complexité vivo découler des essais in base cytométrie qui n&#39;a pas été possible avant. Cela est mis en évidence dans les deux expériences sur les animaux indiqués ci-dessus, où les réponses à 7 épitopes viraux distincts à 6 concentrations pourraient êtr...

Lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative et sont souvent la cible de la manipulation dans l&#39;immunothérapie. Cellules CD4 + T effecteurs répondent à un antigène étranger en sécrétant des cytokines qui régulent de nombreux aspects de l&#39;immunité et peuvent aussi aider directement les cellules B à fabriquer des anticorps. Cellules T cytotoxiques CD8 + (CTL) peuvent également répondre à un antigène étranger en sécrétant des cytokines ainsi que de jouer un rôle central à tuer directement les cellules exprimant un antigène étranger. L&#39;interaction fondamentale qui initie ces fonctions effectrices des cellules T implique l&#39;interaction du récepteur de lymphocyte T (TCR) avec des peptides étrangers présentés sur les molécules du CMH à la surface des cellules. Cellules T CD4 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe II sur les cellules présentatrices de l&#39;antigène et des cellules T CD8 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe I qui sont habituellement affichées sur les cellules microbiennes infectés. Pourafin d&#39;évaluer le rôle des cellules T jouent dans une réponse immunitaire, il est indispensable que leurs fonctions effectrices sont mesurées par des techniques fiables et sensibles. Des méthodes communes pour l&#39;évaluation de la réponse T cellulaire comprennent; CMH class-I/II/peptide tétramère réactivité; la production de cytokine par ELISPOT et coloration des cytokines intracellulaires; et tuant capacité de 51 Cr-tests de libération. Ces tests, cependant, sont généralement effectuées ex vivo avec une stimulation in vitro, ou donnent un aperçu limité dans la fonction des cellules T. Idéalement, lorsque l&#39;on mesure les réponses des cellules T, il serait bénéfique pour les évaluer in situ, in vivo, car ils se produisent, sans aucune manipulation de cellules T de manière à éviter des changements dans les paramètres de fonctionnement qui peuvent se produire par la stimulation in vitro. Parmi les plus couramment utilisés in vivo de cellules T des tests fonctionnels sont basées sur la mesure de meurtre CTL médiée par les cellules cibles marquées avec des peptides du CMH de classe I-contraignantes, qui sont énumérés in vivovia leur détection par marquage fluorescent avec des colorants vitaux tels que CFSE. Bien que ces types d&#39;essais peuvent surveiller meurtre CTL médiation de cibles quand ils se produisent in vivo, ils ont déjà eu une capacité relativement limitée pour évaluer assassinat de cibles multiples présentant différentes concentrations et différents types d&#39;épitopes peptidiques, qui est nécessaire pour permettre paramètres qualitatifs tels avidité fonctionnelle et comme variante de l&#39;épitope de réactivité croisée à évaluer. Ces essais ne fournissent pas d&#39;informations sur les réponses à médiation cellulaire T CD4 +. Pour surmonter bon nombre des difficultés avec les méthodes actuelles utilisées pour évaluer les réponses des lymphocytes T, nous avons récemment mis au point un test multiplex sur la base de tableaux fluorescentes cibles (ALE), qui permet le suivi des réponses des lymphocytes T contre&gt; 250 cellules cibles simultanément dans un animal par la cytométrie de flux 1, 2. ALE sont constitués de lymphocytes marqués par sevconcentrations et combinaisons sieurs de colorants vitaux comme CFSE, CTV et DPC permettant&gt; 250 groupes de cellules de fluorescence unique à être générés. Étant donné que ces cellules restent viables et totalement fonctionnel, elles peuvent être injectées dans des animaux pour permettre la surveillance de leur interaction avec les cellules in vivo 3 T effectrices. Par exemple, les agrégats de cellules ALE peuvent être puisées avec des peptides de classe I du CMH de liaison pour permettre une évaluation de la mise à mort médiée par des CTL spécifiques de l&#39;antigène des cellules cibles 1. En outre, les agrégats de cellules d&#39;ALE peut également être puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant, ce qui permet l&#39;évaluation de spécifique cellulaire de l&#39;antigène T auxiliaire (T H) de l&#39;activité par l&#39;évaluation de l&#39;activation (par évaluation des marqueurs d&#39;activation tels que CD69, CD44 et / ou CD62L) des cellules B dans l&#39;ALE portant peptide apparenté 2. Depuis plus de 250 cibles peuvent être détectés simultanément, il est possible de mesurer de CTL et T H réponses contre de nombreux amas de cellules cibles puisées avec npeptides ombreux à différentes concentrations et l&#39;inclusion de nombreux répétitions. Le test FTA fournit donc un niveau de T effecteur cellulaire évaluation de la réponse in vivo sans précédent. Ici, nous décrivons en détail la construction d&#39;un ALE et montrons comment ils peuvent être appliqués à l&#39;évaluation des réponses des lymphocytes T in vivo. Le mode opératoire décrit la construction d&#39;un FTA composé de 252 groupes de cellules discernables par l&#39;utilisation de trois colorants vitaux, composés de six répétitions de 42 groupes de cellules puisées avec des peptides de liaison II-CMH de classe I et. L&#39;étiquetage des 42 groupes de cellules se produit dans 10 ml conique à fond des tubes et il est utile de prévoir ceux-ci dans un porte-tube, comme décrit dans le Tableau 1. Cette méthode peut être ajustée pour un plus petit nombre de grappes discernables au besoin, en réduisant la quantité d&#39;étiquetage de chaque colorant a effectué 1. Nous soulignons l&#39;utilité de l&#39;analyse en montrant comment il peut mesurer responsabes générés par la vaccination poxvirus recombinant contre plusieurs épitopes dans une petite cohorte de souris. Ceci montre comment le dosage ALE peut être utilisée pour mesurer les réponses cumulatives et avidité fonctionnelle par le biais, respectivement, l&#39;utilisation de l&#39;aire sous la courbe (AUC) et les évaluations mesure de la concentration de peptide efficace nécessaire pour générer des réponses maximales moitié (CE 50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 violet brillant 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux (Fortessa ou équivalent avec source laser bleue, rouge et violette)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules t<em&gt; in vivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

La capacité de surveiller les réponses des lymphocytes T in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire et les immunothérapies. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la matrice cible fluorescente (ALE) de la technologie, qui utilise des colorants vitaux tels que l&#39;ester carboxyfluoroscéine succinimidylique (CFSE), laser violet colorants excitables (CellTrace Violet: CTV) et laser rouge colorants excitables (prolifération cellulaire Dye eFluor 670: DPC ) à combinatoire lymphocytes de souris d&#39;étiquettes dans&gt; 250 discernables amas de cellules fluorescentes. amas de cellules au sein de ces ALE peuvent être puisées avec majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) des peptides de liaison de classe I et du CMH de classe II et ainsi agir comme cellules cibles pour CD8 + et les cellules T CD4 +, respectivement. Ces cellules ALE restent viables et entièrement fonctionnel, et peuvent donc être administrés à des souris pour permettre l&#39;évaluation de CD8 + T meurtre à médiation cellulaire des cellules cibles de l&#39;ALE et T CD4 + hel médité cellulairep B de FTA cellules cibles des cellules en temps réel in vivo par cytométrie de flux. Depuis&gt; 250 cellules cibles peuvent être évaluées à la fois, la technique permet la surveillance des réponses des lymphocytes T contre plusieurs épitopes antigéniques à plusieurs concentrations, et dans de multiples répétitions. En tant que tel, la technique permet de mesurer les réponses des lymphocytes T à la fois quantitative (par exemple, l&#39;ampleur cumulée de la réponse) et un (avidité fonctionnelle par exemple. Épitope et-réactivité croisée de la réponse) qualitative niveau. Ici, nous décrivons comment ces ALE sont construits et donnent un exemple de la manière dont ils peuvent être appliqués afin d&#39;évaluer les réponses des cellules T induites par un vaccin contre le virus de la variole recombinant.

A titre d&#39;exemple de l&#39;utilisation du dosage FTA, une souris BALB / c a été immunisée avec un virus recombinant de la vaccine (VV) exprimant des épitopes du VIH-I (VV-VIH) et les réponses aux épitopes du VIH-I CTL, Gag, mut Gag, Env et Pol, la VV CTL épitopes F2L et F2L mut, et l&#39;épitope du VIH-I T H, Gag Th (comme décrit en 2) ont été évalués à l&#39;aide d&#39;un paramètre 252 ALE essai (figure 1B). variantes d&#39;épitopes de Gag (mut Gag) et F2L (F2L mut) ne sont pa...

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant&gt; 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

L'objectif général de cette procédure est de générer un réseau pouvant atteindre 252 cellules cibles fluorescentes distinctement marquées pour des dosages immunitaires utilisant la cytométrie en flux multiparamétrique. Cette étape est réalisée en marquant d'abord les lymphocytes cibles avec des combinaisons uniques et des intensités variables de colorants vitaux tels que le CFSE et le CTV. L'étape suivante consiste à exposer chaque population distincte de lymphocytes cibles à des épitopes peptidiques candidats se liant aux molécules de classe I et de classe II du CMH.Cela est suivi par un lavage approfondi des cellules afin de préserver la spécificité des épitopes, puis par la mise en commun des cellules et leur injection dans un animal. Les étapes finales consistent à prélever les cellules portant le réseau de marqueurs fluorescents à partir de tissus spécifiques, à les marquer et à évaluer les réponses spécifiques aux peptides du CMH. En définitive, les résultats de cytométrie en flux peuvent révéler des réponses de lymphocytes T cytotoxiques en mesurant la mort des cellules cibles, et peuvent également montrer des réponses des lymphocytes T auxiliaires CD4 positifs en mesurant la surrégulation des marqueurs d'activation sur les cellules B. L'un des principaux avantages de cette technique par rapport aux dosages classiques de CTL in vivo est qu'elle permet la mesure simultanée de plus de 250 cellules cibles chez un seul animal. La démonstration de la procédure sera assurée par Ben Quire, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire.Le protocole nécessite des lymphocytes prélevés à partir de la rate et/ou des ganglions lymphatiques isolés de souris, filtrés et resuspendus à une concentration allant jusqu'à 200 millions de cellules par millilitre dans 11,5 millilitres de RPMI contenant 5 % de sérum de veau fœtal. La préparation de la FDA commence par l'étiquetage. 42 tubes en plastique coniques de 10 millilitres, numérotés de 1 à 42, seront utilisés ; toutes les cellules seront pulsed avec sept épitopes peptidiques différents à six concentrations distinctes, répétées six fois, afin de générer 252 groupes cellulaires discernables.Maintenant, resuspendre soigneusement les lymphocytes en retournant plusieurs fois le tube. Ensuite, ajouter 1,9 millilitre de suspension cellulaire dans les tubes de 10 millilitres étiquetés de 37 à 42, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes.Ouvrez maintenant le tube 38 et placez-le horizontalement au-dessus du tube 38. Ajoutez 83 microlitres de PBS. Puis ajoutez 17 microlitres du stock approprié de CTV, comme indiqué dans le tableau deux du protocole écrit.Une fois le tube chargé, vortexez-le. Répétez cette opération avec les tubes 39 à 42, en veillant à ce que chaque tube reçoive un stock différent de CTV, comme indiqué dans le tableau deux.Incubez maintenant les cellules pendant au moins cinq minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite cinq millilitres de RPMI contenant 5 % de FCS à chaque tube. Ressuspendez soigneusement les cellules par vortexage dans chaque tube. Transférez un millilitre de suspension vers six autres tubes selon le schéma de chargement suggéré décrit dans le protocole écrit ; à chaque transfert, il est important de ne pas mouiller la partie supérieure du tube chargé. Pour marquer les cellules avec du CFSE, retirez les bouchons des tubes 31 à 36 contenant un millilitre de cellules et placez horizontalement les tubes à côté de chacun des tubes.Tout d'abord, ajoutez 103 microlitres de PBS en l'éjectant sur la paroi supérieure sèche. Ensuite, ajoutez sept microlitres du stock approprié de CFSE selon le tableau trois du protocole écrit, puis vortexez immédiatement le tube. Répétez cette procédure avec les tubes regroupés comme indiqué dans le tableau trois.S'assurer que chaque tube reçoit un stock différent de CFSE. Incuber tous les tubes pendant au moins cinq minutes à température ambiante. Après avoir attendu cinq minutes, laver les cellules pour terminer le marquage.Diluez chaque suspension avec neuf millilitres de RPMI à température ambiante contenant 5 % de FCS. Hémolysé les cellules à 300 ×g pendant 10 minutes à température ambiante et retirez les surnageants par aspiration à l’aide d’une pipette de transfert. La préparation des peptides se liant à la classe I du CMH et à la classe II du CMH est décrite dans le protocole textuel. Cette section montre comment marquer les cellules de manière pulsée avec ces peptides.Tout d'abord, resuspendre le culot cellulaire dans le milieu résiduel, par exemple en faisant glisser les tubes sur une grille. Ensuite, porter le volume total de la suspension cellulaire à 250 microlitres dans notre PMI contenant 5 % de FCS. Chaque culot cellulaire devrait nécessiter environ 200 microlitres de milieu.Ensuite, ajoutez 250 microlitres des stocks de peptides préparés au préalable, énumérés dans le tableau cinq, dans les tubes désignés. Suivez le schéma indiqué dans le tableau un et veillez à inclure un tube témoin contenant uniquement du PBS afin de calculer les réponses des lymphocytes T. Il est essentiel que chaque épitope peptidique et chaque concentration de peptide soit attribué à un tube unique, et que cela soit clairement noté en fonction de la fluorescence attendue des cellules dans ce tube.Étant donné que la signature fluorescente de cet agrégat définira ce peptide, mélanger chaque suspension cellulaire par vortexage, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, procéder au lavage des cellules. Ajouter d'abord cinq millilitres de RPMI glacé contenant 5 % de FCS à chaque suspension cellulaire et resuspendre les cellules en retournant les tubes.Ensuite, superposer délicatement à chaque suspension cellulaire trois millilitres de sérum de veau fœtal (FCS) glacé ; conserver les cellules en centrifugeant 10 minutes à 300 G à quatre degrés Celsius. Utiliser une accélération et un freinage lents afin de préserver l'interface des solutions dans chaque tube. Aspirer soigneusement le RPMI, puis aspirer le FCS en laissant intact le culot cellulaire lavé.Après avoir isolé les culots, lavez à nouveau les cellules pour obtenir les culots cellulaires lavés deux fois. Suspendez-les dans 10 millilitres de RPMI glacé contenant 5 % de FCS et répétez la centrifugation ; après la rotation, éliminez les surnageants. Ensuite, rassemblez toutes les populations dans un nouveau tube de 10 millilitres contenant six millilitres de RPMI glacé avec 5 % de FCS, sédimentez les cellules regroupées par centrifugation et aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette de transfert à ce stade de l’ensemble du protocole.On peut générer six réplicats intra-essai en marquant les cellules soumises à l'impulsion peptidique avec six concentrations différentes du CPD. Premièrement, ajoutez 11,4 millilitres de RPMI à température ambiante contenant 5 % de FCS au culot cellulaire regroupé et resuspendez soigneusement à l’aide d’une pipette. Deuxièmement, ajoutez 1,9 millilitre de suspension cellulaire dans six nouveaux tubes de 10 millilitres étiquetés de A à F, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure du tube.Pour commencer, étiquetez les cellules avec le tube B CPD non bouchonné et placez le tube horizontalement le long du mur sec. Ajoutez d'abord 92 microlitres de PBS, puis un volume de solution mère CPD selon le tableau quatre. Vortexez ensuite une fois le mélange obtenu. Répétez cette étape avec le tube C deux F, en veillant à ce que chaque tube reçoive une solution mère CPD différente, comme indiqué dans le tableau quatre.Une fois tous les tubes mélangés, laissez-les incuber cinq minutes à température ambiante. Lavez ensuite les cellules deux fois : premièrement, resuspendez-les dans 10 millilitres de milieu à température ambiante. Deuxièmement, centrifugez-les, puis troisièmement, aspirez les surnageants à l’aide d’une pipette de transfert.Ensuite, répétez le processus. Rassemblez maintenant toutes les cellules des tubes A à F dans un seul tube contenant huit millilitres de milieu froid sur glace.Recueillir les cellules par centrifugation et procéder à l'injection des cellules dans des animaux, suivie d'une analyse par cytométrie en flux. Les détails sont fournis dans le protocole écrit. Une souris BC a été immunisée avec un virus vaccinia recombinant exprimant les épitopes V1 du VIH, et les réponses à divers épitopes ont été évaluées à l'aide d'un test FTA à 252 paramètres.Deux variants d'épitope, gag mute et FTL mute, n'ont pas été exprimés dans le vecteur, et des souris naïves ont également été injectées avec le FTA. Le TA a été discriminé par rapport aux cellules hôtes de la souris par marquage au PKH26, et les cellules FTAB ont été discriminées par coloration à l'anticorps B220 en cytométrie en flux. Chacun des six réplicats intranimaux a été sélectionné en fonction de la fluorescence du CPD ; les cibles FTA exprimant différentes concentrations d'épitopes ont été sélectionnées en fonction de la fluorescence du CFSE et du CTV.La fraction de lyse spécifique de chaque réplicat a été évaluée en comparant la mort cellulaire des agrégats FTA chez les animaux primés par rapport aux agrégats FTA correspondants chez les animaux naïfs. L'activité des lymphocytes T auxiliaires a été évaluée en comparant la surexpression de CD69 sur les cellules B FTA chez les animaux primés par rapport aux agrégats correspondants de cellules B FTA chez les animaux naïfs. D'après cette analyse, l'infection V-V-H-I-V a induit les réponses CTL les plus fortes contre l'épitope immunodominant F deux L du VV, 100 % des cellules cibles FDA chargées avec 0,001 micromolaire ou plus de l'épitope ayant été éliminées de la rate.En plus des réponses CTL, le test FTA a également mesuré les réponses des lymphocytes T auxiliaires en évaluant l'activation des cellules FTAB, exprimant l'épitope de liaison de la classe II du CMH-H-I-V HIV gag th. Cela a montré qu'une activation spécifique des lymphocytes B s'est produite chez les animaux préimmunisés, suggérant la génération d'effecteurs lymphocytaires T auxiliaires spécifiques du gag du VIH. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer un réseau cible fluorescent composé de plus de 250 cellules cibles.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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