Name: ADN-ARN combiné Fluorescent In situ Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: Découvrez la technique FISH combinée ADN-ARN pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris femelle. Cette méthode permet la détection simultanée des acides nucléiques dans leur environnement cellulaire natif.

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Les auteurs remercient tous les membres précédents et actuels du département de Reproduction et de Développement du MC Erasmus pour les discussions utiles et stimulantes qui ont eu lieu au cours des dernières années. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Les travaux du laboratoire de Gribnau sont soutenus par un financement du Conseil néerlandais de la recherche (NWO-VICI) et une bourse de démarrage ERC.

1. Induction de la différenciation dans Femme cellules souches embryonnaires à induire des inactivation du chromosome X REMARQUE: Femme de cellules souches embryonnaires de souris (disponible sur demande) sont cultivées dans des conditions de cellules ES standard sur des boîtes de culture gélifiés revêtues de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous supposons ici que le lecteur est familier avec les techniques de culture cellulaire standard 39-41. Pour induire la différenciation, les cellules ES cultivées dans des boîtes de T25 seront séparés des MEF, et seront étalées dans un milieu de différenciation. <ol><li> Retirez le milieu ES de la culture de cellules ES, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. </li><li> Ajouter 1,5 ml de trypsine-EDTA (préchauffée à 37 ° C), et incuber les cellules à 37 ° C pendant 7 min. Après 3,5 min, secouer le plat délicatement pour briser les colonies. </li><li> Inactiver la trypsine-EDTA par addition de 3,5 ml de milieu de différenciation pour les cellules. cellules de pipette de haut en bas pour obtenir une solution d&#39;une seule cellule, et recueillentdans un tube de 15 ml. Spin pendant 5 min à 200 x g, et recueillir les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire à une boîte de culture non-gélatinisé, et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture cellulaire. NOTE: MEF seront capables d&#39;adhérer à la boîte de culture non-gélatinisé, alors que les cellules ES resteront en suspension. </li><li> Dans le même temps, ajouter des lamelles de verre stériles (24 x 24 mm) sur des plaques à 6 puits, ajouter 0,2% de gélatine, et incuber pendant un minimum de 5 min à température ambiante. </li><li> Après 1 heure, recueillir le surnageant de culture de cellules ES pré-plaqué, qui sont principalement des cellules ES non-adhérents. Plate cellules ES à plaques à 6 puits contenant des lamelles. REMARQUE: Utilisez ⅙ e d&#39;un plat confluent T25 pour 6 puits d&#39;une plaque à 6 puits. Ceci permettra une différenciation confluente bien après 3 jours de différenciation. Changer le milieu sur une base quotidienne. Pour plus des cours de temps de différenciation, les cellules ES plaque pré-plaqués en milieu de différenciation dans les plats bactériennes, et Incubmangé sur un agitateur de cellule intégré dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. Cela permettra aux cellules pour former des corps embryoïdes qui peuvent être plaqués à lamelles 1-2 jours avant la fixation. </li></ol> 2. Fixation des cellules différenciées ES pour une analyse ultérieure FISH ADN-ARN <ol><li> Retirez milieu de différenciation des cultures de différenciation, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. NOTE: Ajouter PBS avec soin pour éviter les cellules emportés. </li><li> Retirer culture cellulaire PBS et fixer les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) / PBS, et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: PFA est toxique et peut entraîner un risque important pour la santé lorsqu&#39;il est inhalé ou au contact de la peau ou des yeux. En outre, l&#39;IFP est cancérigène. </li><li> Retirer 4% PFA / PBS, et laver lamelles 3x avec 70% d&#39;éthanol. NOTE: Corriger lavage est importante, car aucune trace de PFA va interférer avec les étapes ultérieures de POISSON. Les lamelles couvre-peuvent être stockés dans 70% d&#39;éthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant Fanalyse de l&#39;ISH. </li></ol> 3. Étiquetage des sondes d&#39;ADN pour les expériences de FISH REMARQUE: Obtenir un fragment d&#39;ADN du gène d&#39;intérêt (longueur minimale&gt; 2 ko pour l&#39;ARN FISH, ou&gt; 20 kb de l&#39;ADN FISH), ou un BAC couvrant le gène d&#39;intérêt. Pour la détection de l&#39;ARN, une sonde plus petite peut être suffisante par rapport à la détection de l&#39;ADN, la transcription depuis le plus probable se traduira par des transcriptions multiples, qui peuvent être détectés simultanément. Pour un signal fort sur le seul brin d&#39;ADN copie, une sonde plus longue est nécessaire, pour être en mesure de détecter un nombre suffisant d&#39;haptènes incorporés. De préférence, une région génomique non transcrite est choisie pour la conception de la sonde d&#39;ADN. En outre, lors de l&#39;utilisation d&#39;une sonde plus petite pour détecter l&#39;ARN, on a empêché que le locus génomique à partir de laquelle l&#39;ARN est transcrit n&#39;est détecté dans l&#39;approche combinée FISH ADN-ARN, bien que cela ne peut pas être entièrement exclue. Pour détecter les souris Xist, une sonde d&#39;ADNc de 5,5 kb a été utilisé. Pour detection du chromosome X, plusieurs sondes BAC peuvent être utilisés. De bons résultats ont été obtenus avec un mélange de BAC RP23-100E1 et 474E4 CT7-BAC, qui sont situés à proximité immédiate du locus Xist. Selon le gène ou d&#39;un chromosome d&#39;intérêt, plusieurs sondes différentes peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux. Pour travailler avec des matériaux qui seront utilisés pour l&#39;ARN-FISH, utiliser des embouts stériles de filtre, RNAse H 2 O, et de travailler dans un environnement propre. <ol><li> Prendre 1 pg d&#39;ADN et diluer dans H 2 O dans un volume total de 16 pl. Ajouter 4 pi de la digoxigénine ou solution de marquage à la biotine (voir réactifs), mélanger au vortex et incuber à 16 ° C pendant 90 min. NOTE: La biotine ou nucléotides marquées à la digoxigénine seront désormais intégrés par translation de coupure. </li><li> Dans le même temps, préparer colonnes G50 pour éliminer les nucléotides non-intégrés. Prendre une seringue de 2 ml, enlever la matrice, et ajouter coton stérilisé dans la seringue. Ajouter les boulettes G50 en solution to remplir la seringue, placer la seringue dans un tube de 15 ml et centrifuger à 642 g pendant 1 min. NOTE: Environ 80% de la seringue doit maintenant être rempli avec G50. Répéter au moins G50 est présent. </li><li> Après 90 min, ajouter 40 ul de H 2 O dans le mélange réactionnel de translation de coupure, et à la réaction de la colonne G50. Ajouter un tube vide dans la colonne, et centrifuger à 642 g pendant 2 min. Recueillir dans l&#39;écoulement à travers un tube de réaction. </li><li> Mesurer le volume de l&#39;écoulement au travers d&#39;une pipette, ajouter et H 2 O pour atteindre un volume total de 200 pi. Précipiter l&#39;écoulement à travers en ajoutant 13,3 pi de l&#39;ADN de sperme de saumon (10 mg / ml), 13,3 ARNt ul de levure (10 mg / ml), 26,7 pi de souris Cot-1 de l&#39;ADN (1 mg / ml) et 28 ul de 2 M NaAc, pH 5.6. Mélanger au vortex, et ajouter 533 ul glacée 100% d&#39;éthanol. Agiter le tube et centrifuger à 16 200 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant et laver culot deux fois avec 70% d&#39;éthanol. Centrifuger à 16 200 g pendant 5 min à4 ° C, et le culot sécher à l&#39;air. Ajouter 50 ul de solution d&#39;hybridation 50 +, et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour faciliter la dissolution. REMARQUE: sonde marquée peut être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C. ATTENTION: 50 + solution d&#39;hybridation contient du formamide, qui est toxique, peut irriter la peau, les yeux et le système respiratoire, et est également un tératogène. </li></ol> 4. Perméabilisation, pré-traitement et l&#39;hybridation des cellules fixes pour Combined DNA-ARN FISH <ol><li> Réhydrater les cellules fixées sur des lamelles, en éliminant l&#39;éthanol 70% et l&#39;addition d&#39;une culture de cellules du PBS pour les plaques à 6 puits. Incuber pendant 5 min. Répétez au total trois fois. </li><li> Retirer culture cellulaire PBS, et ajouter 0,2% de pepsine pour les plaques à 6 puits, à perméabiliser les cellules. Incuber les plaques à 6 puits dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 4 min. Retirer la pepsine, et inactiver avec RNAse H 2 O. </li><li> Cellules post-fixes par incubation avec 4% de PFA / PBS pendant 5 min à température ambiante. Après FIXATIsur, laver deux fois avec une culture de cellules du PBS pendant 5 min. </li><li> Déshydrater les cellules par incubation avec de l&#39;éthanol à 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Transfert des lamelles couvre de plaques de 6 puits, et l&#39;air sec des lamelles pendant plusieurs minutes. </li><li> les cellules de l&#39;âge selon l&#39;incubation des lamelles à 65 ° C pendant 1 heure sur une plaque chauffante. </li><li> Pré-hybridation sonde FISH avec la souris Cot-1 DNA en additionnant pour chaque lamelle à analyser, 25 pi de solution 50 + d&#39;hybridation, 0,5 pi souris Cot-1 DNA, 1 pl de sonde Xist marqué à la biotine et 1 pl de la digoxigénine sonde de BAC marqué détecter le chromosome X. Mélanger au vortex, et dénaturer à 99 ° C pendant 5 min. Incuber immédiatement à 37 ° C pendant 45 minutes, pour permettre à l&#39;ADN Cot-1 de s&#39;hybrider aux séquences répétées présentes dans les sondes. </li><li> Après vieillissement, repéré 50 ul de tampon de dénaturation (consistant en 70% de tampon phosphate formamide/2x SSC/10 mM) sur une lame de verre, et les mettre sur le dessus avec des lamelles couvre-face des cellules towards le tampon de dénaturation. Incuber à 65 ° C pendant 2 min. </li><li> Ajouter des lamelles à dos des plaques de 6 puits, et les cellules post-fix par incubation dans la glace froide éthanol à 70% pendant 5 min. </li><li> Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l&#39;éthanol 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l&#39;air pendant plusieurs minutes. </li><li> Repérer sonde pré-hybridée sur une lame de verre, et incuber la lamelle sur le dessus. Placer les lames dans une chambre humide rempli de 50 ml 50% formamide/2x SSC, et incuber une nuit à 37 ° C. </li></ol> 5. Lavage post-hybridation et médiation par les anticorps de détection de la sonde <ol><li> Remplir des plaques 6 puits avec 2 x SSC, et de pré-chauffer jusqu&#39;à 42 ° C. Ajouter des lamelles après une nuit d&#39;incubation, et incuber à 42 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer 2x SSC, et incuber lamelles avec 50% SSC formamide/2x pendant 10 min à 42 ° C. Répétez un total de 3 fois (30 min de lavage au total). </li&gt; <li> Retirer 50% formamide/2x SSC, et laver les lames avec du Tris-saline-Tween (TST) pour 2 x 5 min à température ambiante. </li><li> Place 50 ul de Tris-saline-BSA (TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour bloquer pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de mouton anti-dig (1:500 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles à l&#39;envers pour la première étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Coin 50 ul d&#39;anticorps de lapin anti-mouton conjugué à FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles tête en bas pour la seconde étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifiée . </li><li> Transfer lamelles couvre-retour à des plaques 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l&#39;étape d&#39;incubation troisième pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Coin 50 pi d&#39;anticorps de souris anti-biotine (1:200 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et des lamelles couvre-incuber à l&#39;envers, pour la quatrième étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps d&#39;âne anti-souris conjugués à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l&#39;étape d&#39;incubation cinquième pendant 30 min à température ambiante dans une chamb sombre TST-humidifiéer. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-cheval conjugué à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour la sixième étape de l&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . REMARQUE: l&#39;anticorps de chèvre anti-cheval de reconnaître l&#39;anticorps d&#39;âne anti-souris; quand à la disposition du chercheur, un anticorps de chèvre anti-âne fonctionnera aussi bien. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. Laver supplémentaire de 5 min avec du Tris-saline (TS). </li><li> Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l&#39;éthanol 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l&#39;air pendant plusieurs minutes. </li><li> Repérer une goutte de milieu de montage avec DAPI (voir réactifs) sur une lame de verre, et ajouter la lamelle à l&#39;envers sur le dessus. Sceller diapositives avec du vernis à ongles etévaluer les résultats du FISH par microscopie à fluorescence (Figure 1). </li></ol>

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<li>Augui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).</li>
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<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
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<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA%2C+DNA%2C+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li>
<li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence%2C+RNA%2C+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
<li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Combiné ADN-ARN FISH peut être techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l&#39;ADN FISH peuvent être trop sévère pour les molécules d&#39;ARN moins stables. Plusieurs approches ont été appliquées pour étudier à la fois l&#39;ADN et l&#39;ARN dans la même cellule, contournant le besoin d&#39;incubation simultanée avec des sondes de détection à la fois l&#39;ADN et l&#39;ARN. Par exemple, dans une approche de superposition, premier poisson d&#39;ARN est réalisée, et les cellules sont imagée, et les coor...

Étudier les cellules et les tissus au moyen d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) a, depuis son introduction à la fin des années 1970 1, a permis aux chercheurs d&#39;étudier les gènes, l&#39;organisation de la chromatine et l&#39;expression des gènes au niveau subcellulaire. ADN FISH est fréquemment utilisée en cytogénétique, caryotype 2, le diagnostic du cancer 3 et pré-implantatoire dépistage génétique 4, et joue un rôle important dans la recherche moléculaire 5-6, car il permet la détection d&#39;acides nucléiques dans leur environnement naturel. Simple analyse d&#39;expression de cellules par l&#39;ARN FISH peut détecter des transcrits primaires indigènes et ARN non codantes étant transcrit à partir de chromosomes, et offre des avantages à d&#39;autres techniques qui évaluent l&#39;expression des gènes au niveau de la population, y compris par exemple RT-PCR quantitative, génome large analyse de l&#39;expression ou Northern blot . En visualisant des transcrits d&#39;ARN provenant directement de leurs sites d&#39;origine, il a par exemple étéa remarqué que l&#39;expression du gène est stochastique 7, et peut être parfois allèle spécifique 8. L&#39;amélioration de la technique ont même permis la détection et la quantification des molécules d&#39;ARNm dans les cellules simples 9-11. Le principe de base de l&#39;hybridation FISH consiste en des acides nucléiques dans la cellule à une sonde d&#39;acide nucléique au moyen de Watson et Crick d&#39;appariement de bases hautement spécifiques. La sonde peut être directement ou indirectement détectée, résultant en un signal qui peut être visualisée au microscope. Les premières tentatives étaient composés de sondes marquées radioactivement, qui avaient inconvénients en fonction des questions de sécurité, la résolution spatiale limitée et la capacité de détecter une seule cible à la fois 12-14. Le développement ultérieur d&#39;étiquettes non radioactives, y compris les fluorochromes, les haptènes, et des enzymes, a permis l&#39;utilisation répandue de FISH comme une technique de biologie moléculaire de routine. La sonde FISH peut être soit directement marqué avec fluorochromes par liaison chimique des molécules fluorescentes de l&#39;acide nucléique et des séquences de 15 nucleotides de l&#39;intégration de 16 à 19 marquées par fluorescence, ou la sonde peut être visualisé indirectement après intégration des haptènes (y compris la biotine et la digoxigénine) et la détection immunologique d&#39;anticorps spécifiques d&#39;haptènes par haptène conjugué à rapporteur fluorescent molécules 20-21. Cette dernière approche permet une amplification du signal à l&#39;aide de plusieurs couches d&#39;anticorps marqués par fluorescence qui sont utilisés pour améliorer le signal d&#39;origine et permet la détection de l&#39;espèce d&#39;ARN qui sont exprimés à des niveaux faibles. En combinant des techniques de marquage direct et indirect et des haptènes différents, plusieurs cibles peuvent être visualisées simultanément dans la même cellule. Une des étapes les plus importantes dans les protocoles de poisson est l&#39;hybridation de la sonde à sa cible. Bien qu&#39;en théorie, une sonde se lier spécifiquement seulement à sa cible, dans la pratique, cette spécificitén&#39;est pas toujours atteint, en tant que sondes peuvent se lier à des régions homologues, des conditions d&#39;hybridation et ne seront pas toujours idéale pour une certaine espèce de la région d&#39;ADN ou d&#39;ARN. Les lavages post-hybridation sont donc d&#39;une importance particulière, car ils peuvent augmenter la rigueur de la procédure de FISH, et peuvent empêcher la liaison non spécifique des sondes FISH, qui se traduirait par un niveau élevé de bruit de fond. Comme les molécules d&#39;ARN sont simple brin, ils peuvent facilement être hybridées à une sonde FISH. En revanche, la molécule d&#39;ADN double brin doit tout d&#39;abord une étape de dénaturation, après quoi, une sonde peut s&#39;hybrider. Ceci est généralement obtenu par chauffage de l&#39;échantillon, ce qui entraîne la dénaturation de l&#39;ADN. Cependant, dans ces conditions difficiles, fragiles, molécules d&#39;ARN simple brin peuvent être perdues. Par conséquent, l&#39;ADN-ARN combiné FISH nécessite l&#39;optimisation des conditions importantes, et il est plus difficile techniquement par rapport à la détection de seulement séparée de l&#39;ARN ou de l&#39;ADN. Ici, nous présentationta protocole détaillé de combinés, simultanée FISH ADN-ARN qui nous a permis d&#39;étudier l&#39;inactivation du chromosome X (XCI) dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris femelle 22-24. XCI est un mécanisme épigénétique cruciale pour le développement embryonnaire femelle 25, et les résultats en hétérochromatinisation et donc faire taire l&#39;un des deux chromosomes X chez les individus de sexe féminin 26-27. Essentiel de ce processus est la non codantes de l&#39;ARN Xist 28-30, qui est réglementée par les 24 protéines RNF12 22-23 et Rex1. Expression de Xist devient régulée à la hausse sur l&#39;avenir chromosome X inactif (Xi) au cours du développement embryonnaire ou sur la différenciation des cellules ES in vitro , et peuvent se répandre le long du chromosome X et d&#39;attirer ainsi remodelage de la chromatine enzymes qui entraînent la fermeture de la transcription du chromosome X 31. Cet étalement de Xist ARN peut être visualisée par FISH ARN en tant que revêtement du chromosome Xcertains, qui est aussi appelé un nuage de Xist. Comme les cellules ES femmes peuvent perdre un de leurs chromosomes X en raison de l&#39;instabilité génomique, nous et d&#39;autres avons utilisé combiné ADN-ARN FISH pour étudier XCI, pour s&#39;assurer que les cellules ne caryotype stables sont évalués dans l&#39;analyse de cet important processus 22,32 -34. Comme avec toutes les techniques de la biologie moléculaire, plusieurs excellents différents protocoles ont été publiés 35-38. Ici, nous présentons notre méthode, à partir de l&#39;induction de la différenciation des cellules ES de souris, la fixation des cellules, l&#39;étiquetage du poisson sondes par Nick-traduction, pré-traitement des cellules fixées pour permettre la perméabilisation et l&#39;utilisation de la sonde suite, l&#39;hybridation de la sonde à l&#39; cible, et enfin la détection de la sonde par des anticorps marqués par fluorescence. Le protocole présenté ici permet la détection de fidèles ARN Xist et le chromosome X dans un délai de deux jours, et les bases de cette technique peut probablement être adapté à otses systèmes et domaines de recherche.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>Les</tr><tr><td>fibroblastes embryonnaires</td><td></td><td></td><td>de souris peuvent être dérivés d’embryons E13.5 ou de sources commerciales par exemple </td></tr><tr><td>milieu de culture cellulaire</td> Millipore ES <td></td><td></td><td>DMEM, 15 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, acides aminés non essentiels, 0,1 mM &#947 ;-mercaptoéthanol et 1 000 U/ml LIF. Filtrer, stériliser et stocker à 4 &#176 ; C pour un maximum de 2 semaines.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline&ndash ; streptomycine (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947 ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES milieu</td><td></td><td></td> de différenciation cellulaire <td>IMDM-Glutamax, 15 % sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, acides aminés non essentiels, 37,8 &#956 ; l/L monothioglycérol et 50 &#956 ; g/ml acide ascorbique</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>monothioglycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire T25</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire 6 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>qualité de culture cellulaire PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25 % (v/v) trypsine/0,2 % (p/v) EDTA dans PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 x 24 mm lamelles de recouvrement</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>gélatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>préparer une solution de gélatine/culture cellulaire à 0,2 % PBS et autoclave</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Diluer à 0,2 % dans 0,01 M HCl (pH 2,0)</td></tr><tr><td>absolu 100 % éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>utiliser de l’eau absolue 100 % éthanol et sans RNAse pour fabriquer des solutions à 70 % et 90</td></tr> % <tr><td>d’éthanol Eau sans RNAse</td><td>Baxter</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>pointes filtrantes stériles</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>kit de marquage à la digoxigénine (traduction DIG-Nick)</td><td>Roche</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>kit de marquage à la biotine (traduction Biotin Nick)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>coton</td><td></td><td></td><td></td>stérilisé</tr><tr><td>Eppendorf tubes Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>ARNt de levure 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïde de saumon 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>souris cot-1 ADN 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de paillasse Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>Modèle 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>Modèle 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ solution</td><td></td><td></td> d’hybridation <td>50 % formamide, 2x SSC, 50 mM tampon phosphate pH 7, 10 % sulfate de dextran pH 7</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Acros organics</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de dextran</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM tampon phosphate, pH 7</td><td></td><td></td><td>ajouter 57,7 ml de 1 M de Na2HPO4 et 42,3 ml de 1 M de NaH2PO4 ; utiliser l’eau traitée DEPC et</td></tr><tr>tampon <td></td><td></td> de<td>dénaturation</td> en autoclave <td>70 % formamide/2x SSC/10 mM tampon phosphate pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7,5 solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-saline-Tween solution de lavage (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#956 ; l Tween-20, ajouter de l’eau libre d’ARNase jusqu’à ce que 1 L</td></tr><tr><td>10x solution</td><td></td><td></td> saline <td>dissolve 85 g de NaCl dans 1 L d’ARNse libre H2O, et autoclave</td></tr><tr><td>Tris-saline-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956 ; l 10x solution saline, 250 &#956 ; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml d’ARNse libre H2O</td></tr><tr><td>BSA, purifié, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr> anticorps <tr><td>anti-creuser</td><td>Roche</td><td></td><td>diagnostics utilise 1:500 dilué dans TSBSA</td></tr><tr><td>Anticorps anti-mouton lapin conjugué avec FITC</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>utilisent 1:250 dilué dans un anticorps anti-lapin TSBSA</td></tr><tr><td>conjugué avec FITC</td><td>Jackson les laboratoires utilisent 1</td><td></td><td>:250 dilué dans</td></tr> un <tr><td>anticorps anti-biotine de souris</td> TSBSA <td>Les diagnostics</td><td></td> de Roche <td>utilisent 1:200 dilués dans</td></tr> un <tr><td>anticorps anti-souris d’âne TSBSA conjugués à de la rhodamine</td><td>Les laboratoires Jackson</td><td>utilisent 1:250 dilué dans un anticorps anti-cheval de chèvre TSBSA</td>conjugué à de la rhodamine Les laboratoires Jackson utilisent 1:250 dilué dans une solution de lavage saline (TS) TSBSA Tris-saline <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10 ml 10x solution saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml sans RNAse H2O</td></tr><tr><td>Vectashield support de montage avec vernis à</td> ongles <td></td><td></td> DAPI Vectorlabs H-1200 <td></td></tr><tr><td>miscroscope</td><td></td><td></td><td></td> fluorescent</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adn-arn combiné fluorescent<em&gt; in situ</em&gt; hybridation (fish) à étudier inactivation du chromosome x dans différencié femme souris cellules souches embryonnaires

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet la détection d&#39;acides nucléiques dans les cellules. ADN FISH est souvent utilisée en cytogénétique et diagnostic du cancer, et peut détecter des aberrations du génome, qui a souvent des implications cliniques importantes. ARN FISH peut être utilisée pour détecter des molécules d&#39;ARN dans les cellules et a fourni des renseignements importants dans la régulation de l&#39;expression génique. La combinaison de l&#39;ADN et de l&#39;ARN FISH dans la même cellule est techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l&#39;ADN poisson pourrait être trop sévère pour fragiles, molécules d&#39;ARN simple brin. Nous présentons ici un protocole facilement applicable qui permet au combiné, la détection simultanée de Xist ARN et l&#39;ADN codé par les chromosomes X. Ce protocole de FISH ADN-ARN susceptible combiné peut être appliquée à d&#39;autres systèmes où à la fois l&#39;ARN et de l&#39;ADN devant être détecté.

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus pour la combinaison de l&#39;ADN-ARN FISH, nous avons pu visualiser inactivation du chromosome X dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de sexe féminin. Figure 1 montre un exemple représentatif d&#39;une expérience FISH ADN-ARN, où nous avons détecté la fois Xist (qui est visible en tant que dite ARN Xist nuage sur le chromosome X inactif et une transcription basale ponctuelle sur le chromosome X actif), et une région du...

Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d&#39;acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l&#39;ARN et de l&#39;ADN à l&#39;aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l&#39;inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'inactivation du chromosome X dans des cellules souches embryonnaires de souris femelles différenciées à l'aide d'une hybridation in situ fluorescente combinée simultanément ADN et ARN, ou FISH ADN-ARN. Ceci est réalisé en induisant d'abord la différenciation de cellules souches embryonnaires de souris femelles. En effet, au cours de ce processus, qui simule le développement embryonnaire post-implantation normal, l'inactivation du chromosome X est initiée, entraînant une transcription accrue et une accumulation d'ARN-Xist codant pour le futur chromosome X inactif.La deuxième étape consiste à fixer les cellules souches embryonnaires différenciées à l'aide de paraldéhyde. Ensuite, préparez les sondes destinées à la détection de l'ADN du chromosome X et de l'ARN de la kyste en marquant des fragments d'ADN avec de la biotine ou de la digoxigénine, par traduction de brèche.La dernière étape consiste à réaliser la procédure FISH ADN-ARN. Les cellules souches embryonnaires différenciées sont perméabilisées, dénaturées, puis hybridées avec les sondes FISH marquées, qui sont ensuite détectées à l'aide d'anticorps conjugués à une fluorochrome et reconnaissant la biotine ou la digoxigénine dans les haptènes. Enfin, la microscopie immunofluorescente est utilisée pour montrer la localisation des deux chromosomes dans les cellules femelles et pour visualiser l'expression de l'ARN cyst du chromosome X qui subit une inactivation.Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que les méthodes FISH, où l'ARN et l'ADN sont détectés successivement, est qu'avec notre protocole, nous sommes en mesure de détecter simultanément les deux types d'acides nucléiques sur le même échantillon en moins de deux jours. Bien que la combinaison de la FISH ADN et ARN puisse être difficile à réaliser, car les conditions optimales pour détecter l'ADN ou l'ARN diffèrent sensiblement. En utilisant le protocole présenté ici, nous sommes capables de détecter l'ARN et l'ADN existants provenant des deux chromosomes X dans pratiquement toutes les cellules analysées.Cela nous a permis d'étudier l'inactivation du chromosome X au moment où elle se produit lors de la différenciation de cellules souches embryonnaires de souris femelles ou lors d'un développement anormal de la souris femelle. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le processus d'inactivation du chromosome X, un phénomène important et fascinant qui se déroule au cours du développement embryonnaire précoce de la souris, elle pourrait également être appliquée à d'autres systèmes biologiques dans lesquels il est essentiel de détecter des transcrits d'ARN provenant de la chromatine native, car l'importance des ARN non codants dans les systèmes biologiques est de plus en plus reconnue, et des approches à cellule unique sont souvent privilégiées par rapport à d'autres méthodes où des populations entières de cellules sont analysées. Nous pensons que ce protocole sera utile pour une vaste communauté scientifique.Des cellules souches embryonnaires de souris femelles, ou CSE, sont cultivées dans des conditions standard de CSE sur des boîtes de culture recouvertes de gélatine et de fibroblastes embryonnaires de souris (FES) afin d'initier la procédure d'induction de la différenciation. Retirer le milieu CSE de la culture de CSE et rincer deux fois avec du PBS pour culture cellulaire. Ajouter 1,5 millilitre de TRYPsin-EDTA préchauffé à 37 degrés Celsius et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant sept minutes. Après 3,5 minutes, agiter doucement la boîte pour fragmenter les colonies.Inactiver la trypsine EDTA en ajoutant 3,5 millilitres de milieu de différenciation aux cellules, puis prélever les cellules à la pipette en montant et descendant afin d'obtenir une solution monocellulaire, et les recueillir dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger pendant cinq minutes à 200 G. Après avoir recueilli les cellules dans 10 millilitres de milieu de différenciation, ajouter la suspension cellulaire dans une boîte de culture non gélatinisée de 10 centimètres et incuber pendant une heure. Dans l'incubateur de culture cellulaire, les cellules MES seront capables d'adhérer à la boîte de culture non gélatinisée, tandis que les cellules ES resteront en suspension.Entre-temps, placez des lamelles en verre stériles dans des plaques à six puits, ajoutez de la gélatine à 0,2 % et incubez pendant au moins cinq minutes. À température ambiante, après une heure, récupérez le surnageant de la culture pré-ESL, qui consistera principalement en eESL non adhérents. Après dilution des eESL, ensemencez-les dans des plaques à six puits contenant des lamelles.Commencez cette procédure en éliminant le milieu de différenciation des cultures de différenciation et en effectuant deux lavages avec du PBS pour culture cellulaire. Veillez à ajouter le PBS soigneusement afin d'éviter que les cellules ne soient emportées. Fixez les cellules en ajoutant du PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde et en incubant pendant 10 minutes à température ambiante.Après 10 minutes, retirez le paraformaldéhyde et rincez les lamelles trois fois avec de l'éthanol à 70 %. Pour préparer les sondes d'ADN pour le marquage, diluez d'abord un microgramme de chaque ADN respectif dans de l'eau, pour un volume total de 16 microlitres. Ajoutez ensuite quatre microlitres de solution de marquage à l'oxgénine ou à la biotine, mélangez par vortexage et incubez à 16 degrés Celsius pendant 90 minutes.Cela permettra d'incorporer les nucléotides marqués à la biotine ou à l'oxygène dig par traduction NIC. Pendant ce temps, préparez les colonnes G 50. Pour éliminer les nucléotides non intégrés, prenez une seringue de deux millilitres, retirez le poussoir et ajoutez du coton stérilisé dans la seringue.Ajouter des billes G 50 et de la solution pour remplir la seringue. Puis placer la seringue dans un tube de centrifugation de 15 millilitres à 642 ×g pendant une minute. Après la centrifugation, environ 80 % du volume de la seringue doit être occupé par les billes G 50. Après 90 minutes, ajouter 40 microlitres d'eau à chaque mélange réactionnel de traduction NIC et transférer la réaction sur la colonne G 50.Ajouter un tube vide sous la colonne et centrifuger à 642 G pendant deux minutes. Recueillir l'écoulement dans un tube à réaction. Mesurer le volume de l'écoulement à l'aide d'une pipette, puis ajouter de l'eau pour obtenir un volume total de 200 microlitres.Pour précipiter le flux traversant, ajouter du sperme de saumon, de l'ADN d'ARNt de levure, de l'ARNt de souris capturé par 1D NA et de l'acétate de sodium à deux molaire, puis mélanger par vortexage. Ajouter 533 microlitres d'éthanol glacé à 100 %, agiter le tube, puis centrifuger à 16 200 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de la centrifugation, retirer le surnageant et laver le culot deux fois avec de l'éthanol à 70 %, en centrifugant à 16 200 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis sécher le culot à l'air. Lorsque le culot est sec, ajouter 50 microlitres d'une solution d'hybridation 50 plus et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour faciliter la dissolution avant la perméabilisation, réhydrater les cellules fixées en retirant les lames de couverture, éliminer l'éthanol à 70 % et ajouter du PBS pour culture cellulaire sur les cellules.Incuber pendant cinq minutes, répéter un total de trois fois afin de permettre la mobilisation des cellules. Retirer le PBS du milieu de culture et ajouter 0,2 % de pepin dans les plaques à six puits. Incuber les plaques dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant quatre minutes.Après cela, retirez le pepin et inactiver avec de l'eau sans ARN. Fixez les cellules en les incubant avec du PBS contenant du paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes à température ambiante ; après la fixation, rincez deux fois avec du milieu de culture cellulaire ou du PBS pendant cinq minutes. Déshydratez les cellules en les incubant avec de l'éthanol à 70 % pendant trois minutes, de l'éthanol à 90 % pendant trois minutes et de l'éthanol à 100 % pendant trois minutes.Après cela, transférez les lamelles à partir des plaques à six puits et faites-les sécher pendant plusieurs minutes. Vieillissez les cellules en incubant les lamelles à 65 degrés Celsius pendant une heure sur un bloc chauffant. Pendant ce temps, pré-hybridisez les sondes FISH avec le manteau 1D AD de souris en ajoutant, pour chaque lamelle à analyser, les réactifs ensemble.25 microlitres de solution d'hybridation 50 plus. Un microlitre de sonde cyst marquée à la biotine, un microlitre de sonde BAC marquée à la digoxygénine détectant le chromosome X et 0,5 microlitre d'ADN cot 1D de souris, mélangés par vortexage et dénaturés à 99 degrés Celsius pendant cinq minutes. Incuber immédiatement à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes afin de permettre à l'ADN cot 1D de s'hybrider aux séquences répétées présentes dans la sonde.Une fois que les cellules sur les lamelles ont vieilli, déposer 50 microlitres de tampon de dématuration sur une lame de verre et placer les lamelles par-dessus, les cellules étant orientées vers le tampon de dématuration. Incuber à 65 degrés Celsius pendant deux minutes. Fixer les cellules en transférant les lamelles dans les plaques à six puits préremplies avec de l'éthanol glacé à 70 % et incuber pendant cinq minutes.Déshydratez les cellules par une incubation successive dans de l'éthanol à 70 % pendant trois minutes, dans de l'éthanol à 90 % pendant trois minutes et dans de l'éthanol à 100 % pendant trois minutes. Retirez les lamelles des plaques à six puits et laissez-les sécher à l'air pendant plusieurs minutes. Déposez le sonde pré-hybride sur une lame de verre et placez une lamelle par-dessus en incubation.Placer les lames dans une chambre humidifiée remplie de 50 millilitres de 50 % IDE deux XSSC et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Après l'incubation nocturne, transférer les lamelles des lames en verre vers des plaques à six puits qui ont été remplies avec deux XSSC préchauffé à 42 degrés Celsius. Incuber à 42 degrés Celsius pendant cinq minutes.Retirer deux XSSC et ajouter 50 % de formule MI deux XSSC. Incuber pendant 10 minutes à 42 degrés Celsius. Laver avec 50 % de formule IDE deux X-S-S-C-A, pour un total de trois fois pendant 10 minutes à 42 degrés Celsius par lavage.Après le troisième lavage, retirez la 50 % form de deux XSSC et lavez les lames avec du tris salin tween ou TST deux fois pendant cinq minutes à température ambiante pour le blocage. Ajoutez 50 microlitres de tris salin BSA ou T-S-P-S-A. Placez la lame couvre-objet sur de nouvelles lames de verre et disposez les lames couvre-objets à l’envers sur la lame de verre. Incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans une chambre humide obscure contenant du TST. Après 30 minutes, transférez les lames couvre-objets de nouveau dans les plaques à six puits et lavez-les deux fois pendant cinq minutes avec du TST. Pour l’incubation avec le premier anticorps, déposez 50 microlitres d’anticorps antigène de mouton par lame couvre-objet sur de nouvelles lames de verre, puis placez les lames couvre-objets à l’envers sur la lame de verre. Incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans une chambre humide obscure contenant du TST.Ensuite, les lamelles sont incubées avec une série d'anticorps marqués par fluorescence afin d'amplifier le signal initial, comme décrit dans le manuscrit associé. Après l'incubation avec une série d'anticorps marqués par fluorescence, déshydrater les cellules par incubation de trois minutes chacune dans de l'éthanol 70 %, de l'éthanol 90 % et de l'éthanol 100 %. Retirer les lamelles des plaques à six puits et les laisser sécher à l'air pendant plusieurs minutes.Enfin, déposez une goutte de milieu de montage avec une pipette sur chaque lame. Placez une lamelle par-dessus, côté ouvert vers le bas, et scellez les lames avec du vernis à ongles. En utilisant ce protocole de FISH combiné ADN-ARN pour l'inactivation du chromosome X, on peut visualiser l'inactivation du chromosome X dans des cellules souches embryonnaires féminines en cours de différenciation.Cette figure montre un exemple représentatif d'expérience ADN-ARN FISH, dans laquelle l'ARN des cystes et une région du chromosome X sont détectées simultanément. L'ARN des cystes est un ARN non codant essentiel au processus d'inactivation du chromosome X. Chez les cellules souches embryonnaires féminines en différenciation, l'ARN des cystes est détecté à l'aide d'une sonde ADN marquée à la biotine, visualisée par des anticorps conjugués à la rhodamine et apparaissant en rouge.Le chromosome X est détecté à l'aide d'une sonde BAC marquée par un xigène, visualisée à l'aide d'anticorps conjugués au FITC indiqués en vert. Les noyaux sont contre-colorés avec le DPI indiqué en bleu. Dans presque toutes les cellules, deux chromosomes X sont détectés. On observe à la fois de grandes accumulations de cyst sur les chromosomes X inactifs, ou nuages de cyst, et une expression basale de cyst provenant du chromosome X actif, ou points précis de cyst.Les points ponctuels de la cystéine ne sont pas détectés dans chaque noyau, car lors de la différenciation, cette expression basale de la cystéine cesse sur le chromosome X futur actif. Remarquez que certains des signaux ponctuels provenant du chromosome X se situent à l'intérieur des nuages de cystéine, ce qui montre effectivement que le nuage de cystéine se localise le long du chromosome X et le code. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux jours et donne un résultat fiable si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire la différenciation de cellules souches embryonnaires de souris femelles, comment fixer ces cellules et comment les préparer afin de réaliser une hybridation in situ combinée ADN-ARN. N'oubliez pas qu'il est important pour la réussite de vos expériences de maintenir les températures et les durées d'incubation constantes, comme indiqué dans ce protocole. De plus, il est essentiel de travailler dans un environnement propre.Si vous utilisez un type cellulaire différent ou étudiez un système biologique différent, une certaine optimisation pourrait être nécessaire pour vous fournir un résultat optimal. Bonne chance avec vos expériences.

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