Name: ADN-ARN combiné Fluorescent In situ Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: Découvrez la technique FISH combinée ADN-ARN pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris femelle. Cette méthode permet la détection simultanée des acides nucléiques dans leur environnement cellulaire natif.

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Les auteurs remercient tous les membres précédents et actuels du département de Reproduction et de Développement du MC Erasmus pour les discussions utiles et stimulantes qui ont eu lieu au cours des dernières années. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Les travaux du laboratoire de Gribnau sont soutenus par un financement du Conseil néerlandais de la recherche (NWO-VICI) et une bourse de démarrage ERC.

1. Induction de la différenciation dans Femme cellules souches embryonnaires à induire des inactivation du chromosome X REMARQUE: Femme de cellules souches embryonnaires de souris (disponible sur demande) sont cultivées dans des conditions de cellules ES standard sur des boîtes de culture gélifiés revêtues de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous supposons ici que le lecteur est familier avec les techniques de culture cellulaire standard 39-41. Pour induire la différenciation, les cellules ES cultivées dans des boîtes de T25 seront séparés des MEF, et seront étalées dans un milieu de différenciation. <ol><li> Retirez le milieu ES de la culture de cellules ES, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. </li><li> Ajouter 1,5 ml de trypsine-EDTA (préchauffée à 37 ° C), et incuber les cellules à 37 ° C pendant 7 min. Après 3,5 min, secouer le plat délicatement pour briser les colonies. </li><li> Inactiver la trypsine-EDTA par addition de 3,5 ml de milieu de différenciation pour les cellules. cellules de pipette de haut en bas pour obtenir une solution d&#39;une seule cellule, et recueillentdans un tube de 15 ml. Spin pendant 5 min à 200 x g, et recueillir les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire à une boîte de culture non-gélatinisé, et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture cellulaire. NOTE: MEF seront capables d&#39;adhérer à la boîte de culture non-gélatinisé, alors que les cellules ES resteront en suspension. </li><li> Dans le même temps, ajouter des lamelles de verre stériles (24 x 24 mm) sur des plaques à 6 puits, ajouter 0,2% de gélatine, et incuber pendant un minimum de 5 min à température ambiante. </li><li> Après 1 heure, recueillir le surnageant de culture de cellules ES pré-plaqué, qui sont principalement des cellules ES non-adhérents. Plate cellules ES à plaques à 6 puits contenant des lamelles. REMARQUE: Utilisez ⅙ e d&#39;un plat confluent T25 pour 6 puits d&#39;une plaque à 6 puits. Ceci permettra une différenciation confluente bien après 3 jours de différenciation. Changer le milieu sur une base quotidienne. Pour plus des cours de temps de différenciation, les cellules ES plaque pré-plaqués en milieu de différenciation dans les plats bactériennes, et Incubmangé sur un agitateur de cellule intégré dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. Cela permettra aux cellules pour former des corps embryoïdes qui peuvent être plaqués à lamelles 1-2 jours avant la fixation. </li></ol> 2. Fixation des cellules différenciées ES pour une analyse ultérieure FISH ADN-ARN <ol><li> Retirez milieu de différenciation des cultures de différenciation, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. NOTE: Ajouter PBS avec soin pour éviter les cellules emportés. </li><li> Retirer culture cellulaire PBS et fixer les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) / PBS, et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: PFA est toxique et peut entraîner un risque important pour la santé lorsqu&#39;il est inhalé ou au contact de la peau ou des yeux. En outre, l&#39;IFP est cancérigène. </li><li> Retirer 4% PFA / PBS, et laver lamelles 3x avec 70% d&#39;éthanol. NOTE: Corriger lavage est importante, car aucune trace de PFA va interférer avec les étapes ultérieures de POISSON. Les lamelles couvre-peuvent être stockés dans 70% d&#39;éthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant Fanalyse de l&#39;ISH. </li></ol> 3. Étiquetage des sondes d&#39;ADN pour les expériences de FISH REMARQUE: Obtenir un fragment d&#39;ADN du gène d&#39;intérêt (longueur minimale&gt; 2 ko pour l&#39;ARN FISH, ou&gt; 20 kb de l&#39;ADN FISH), ou un BAC couvrant le gène d&#39;intérêt. Pour la détection de l&#39;ARN, une sonde plus petite peut être suffisante par rapport à la détection de l&#39;ADN, la transcription depuis le plus probable se traduira par des transcriptions multiples, qui peuvent être détectés simultanément. Pour un signal fort sur le seul brin d&#39;ADN copie, une sonde plus longue est nécessaire, pour être en mesure de détecter un nombre suffisant d&#39;haptènes incorporés. De préférence, une région génomique non transcrite est choisie pour la conception de la sonde d&#39;ADN. En outre, lors de l&#39;utilisation d&#39;une sonde plus petite pour détecter l&#39;ARN, on a empêché que le locus génomique à partir de laquelle l&#39;ARN est transcrit n&#39;est détecté dans l&#39;approche combinée FISH ADN-ARN, bien que cela ne peut pas être entièrement exclue. Pour détecter les souris Xist, une sonde d&#39;ADNc de 5,5 kb a été utilisé. Pour detection du chromosome X, plusieurs sondes BAC peuvent être utilisés. De bons résultats ont été obtenus avec un mélange de BAC RP23-100E1 et 474E4 CT7-BAC, qui sont situés à proximité immédiate du locus Xist. Selon le gène ou d&#39;un chromosome d&#39;intérêt, plusieurs sondes différentes peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux. Pour travailler avec des matériaux qui seront utilisés pour l&#39;ARN-FISH, utiliser des embouts stériles de filtre, RNAse H 2 O, et de travailler dans un environnement propre. <ol><li> Prendre 1 pg d&#39;ADN et diluer dans H 2 O dans un volume total de 16 pl. Ajouter 4 pi de la digoxigénine ou solution de marquage à la biotine (voir réactifs), mélanger au vortex et incuber à 16 ° C pendant 90 min. NOTE: La biotine ou nucléotides marquées à la digoxigénine seront désormais intégrés par translation de coupure. </li><li> Dans le même temps, préparer colonnes G50 pour éliminer les nucléotides non-intégrés. Prendre une seringue de 2 ml, enlever la matrice, et ajouter coton stérilisé dans la seringue. Ajouter les boulettes G50 en solution to remplir la seringue, placer la seringue dans un tube de 15 ml et centrifuger à 642 g pendant 1 min. NOTE: Environ 80% de la seringue doit maintenant être rempli avec G50. Répéter au moins G50 est présent. </li><li> Après 90 min, ajouter 40 ul de H 2 O dans le mélange réactionnel de translation de coupure, et à la réaction de la colonne G50. Ajouter un tube vide dans la colonne, et centrifuger à 642 g pendant 2 min. Recueillir dans l&#39;écoulement à travers un tube de réaction. </li><li> Mesurer le volume de l&#39;écoulement au travers d&#39;une pipette, ajouter et H 2 O pour atteindre un volume total de 200 pi. Précipiter l&#39;écoulement à travers en ajoutant 13,3 pi de l&#39;ADN de sperme de saumon (10 mg / ml), 13,3 ARNt ul de levure (10 mg / ml), 26,7 pi de souris Cot-1 de l&#39;ADN (1 mg / ml) et 28 ul de 2 M NaAc, pH 5.6. Mélanger au vortex, et ajouter 533 ul glacée 100% d&#39;éthanol. Agiter le tube et centrifuger à 16 200 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant et laver culot deux fois avec 70% d&#39;éthanol. Centrifuger à 16 200 g pendant 5 min à4 ° C, et le culot sécher à l&#39;air. Ajouter 50 ul de solution d&#39;hybridation 50 +, et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour faciliter la dissolution. REMARQUE: sonde marquée peut être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C. ATTENTION: 50 + solution d&#39;hybridation contient du formamide, qui est toxique, peut irriter la peau, les yeux et le système respiratoire, et est également un tératogène. </li></ol> 4. Perméabilisation, pré-traitement et l&#39;hybridation des cellules fixes pour Combined DNA-ARN FISH <ol><li> Réhydrater les cellules fixées sur des lamelles, en éliminant l&#39;éthanol 70% et l&#39;addition d&#39;une culture de cellules du PBS pour les plaques à 6 puits. Incuber pendant 5 min. Répétez au total trois fois. </li><li> Retirer culture cellulaire PBS, et ajouter 0,2% de pepsine pour les plaques à 6 puits, à perméabiliser les cellules. Incuber les plaques à 6 puits dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 4 min. Retirer la pepsine, et inactiver avec RNAse H 2 O. </li><li> Cellules post-fixes par incubation avec 4% de PFA / PBS pendant 5 min à température ambiante. Après FIXATIsur, laver deux fois avec une culture de cellules du PBS pendant 5 min. </li><li> Déshydrater les cellules par incubation avec de l&#39;éthanol à 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Transfert des lamelles couvre de plaques de 6 puits, et l&#39;air sec des lamelles pendant plusieurs minutes. </li><li> les cellules de l&#39;âge selon l&#39;incubation des lamelles à 65 ° C pendant 1 heure sur une plaque chauffante. </li><li> Pré-hybridation sonde FISH avec la souris Cot-1 DNA en additionnant pour chaque lamelle à analyser, 25 pi de solution 50 + d&#39;hybridation, 0,5 pi souris Cot-1 DNA, 1 pl de sonde Xist marqué à la biotine et 1 pl de la digoxigénine sonde de BAC marqué détecter le chromosome X. Mélanger au vortex, et dénaturer à 99 ° C pendant 5 min. Incuber immédiatement à 37 ° C pendant 45 minutes, pour permettre à l&#39;ADN Cot-1 de s&#39;hybrider aux séquences répétées présentes dans les sondes. </li><li> Après vieillissement, repéré 50 ul de tampon de dénaturation (consistant en 70% de tampon phosphate formamide/2x SSC/10 mM) sur une lame de verre, et les mettre sur le dessus avec des lamelles couvre-face des cellules towards le tampon de dénaturation. Incuber à 65 ° C pendant 2 min. </li><li> Ajouter des lamelles à dos des plaques de 6 puits, et les cellules post-fix par incubation dans la glace froide éthanol à 70% pendant 5 min. </li><li> Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l&#39;éthanol 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l&#39;air pendant plusieurs minutes. </li><li> Repérer sonde pré-hybridée sur une lame de verre, et incuber la lamelle sur le dessus. Placer les lames dans une chambre humide rempli de 50 ml 50% formamide/2x SSC, et incuber une nuit à 37 ° C. </li></ol> 5. Lavage post-hybridation et médiation par les anticorps de détection de la sonde <ol><li> Remplir des plaques 6 puits avec 2 x SSC, et de pré-chauffer jusqu&#39;à 42 ° C. Ajouter des lamelles après une nuit d&#39;incubation, et incuber à 42 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer 2x SSC, et incuber lamelles avec 50% SSC formamide/2x pendant 10 min à 42 ° C. Répétez un total de 3 fois (30 min de lavage au total). </li&gt; <li> Retirer 50% formamide/2x SSC, et laver les lames avec du Tris-saline-Tween (TST) pour 2 x 5 min à température ambiante. </li><li> Place 50 ul de Tris-saline-BSA (TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour bloquer pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de mouton anti-dig (1:500 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles à l&#39;envers pour la première étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Coin 50 ul d&#39;anticorps de lapin anti-mouton conjugué à FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles tête en bas pour la seconde étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifiée . </li><li> Transfer lamelles couvre-retour à des plaques 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l&#39;étape d&#39;incubation troisième pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Coin 50 pi d&#39;anticorps de souris anti-biotine (1:200 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et des lamelles couvre-incuber à l&#39;envers, pour la quatrième étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps d&#39;âne anti-souris conjugués à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l&#39;étape d&#39;incubation cinquième pendant 30 min à température ambiante dans une chamb sombre TST-humidifiéer. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-cheval conjugué à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour la sixième étape de l&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . REMARQUE: l&#39;anticorps de chèvre anti-cheval de reconnaître l&#39;anticorps d&#39;âne anti-souris; quand à la disposition du chercheur, un anticorps de chèvre anti-âne fonctionnera aussi bien. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. Laver supplémentaire de 5 min avec du Tris-saline (TS). </li><li> Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l&#39;éthanol 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l&#39;air pendant plusieurs minutes. </li><li> Repérer une goutte de milieu de montage avec DAPI (voir réactifs) sur une lame de verre, et ajouter la lamelle à l&#39;envers sur le dessus. Sceller diapositives avec du vernis à ongles etévaluer les résultats du FISH par microscopie à fluorescence (Figure 1). </li></ol>

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<li>Augui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).</li>
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<li>Brockdorff, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+position+and+exclusive+expression+of+mouse+Xist+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 329-331 (1991).</li>
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<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
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<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA%2C+DNA%2C+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li>
<li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence%2C+RNA%2C+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
<li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Combiné ADN-ARN FISH peut être techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l&#39;ADN FISH peuvent être trop sévère pour les molécules d&#39;ARN moins stables. Plusieurs approches ont été appliquées pour étudier à la fois l&#39;ADN et l&#39;ARN dans la même cellule, contournant le besoin d&#39;incubation simultanée avec des sondes de détection à la fois l&#39;ADN et l&#39;ARN. Par exemple, dans une approche de superposition, premier poisson d&#39;ARN est réalisée, et les cellules sont imagée, et les coor...

Étudier les cellules et les tissus au moyen d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) a, depuis son introduction à la fin des années 1970 1, a permis aux chercheurs d&#39;étudier les gènes, l&#39;organisation de la chromatine et l&#39;expression des gènes au niveau subcellulaire. ADN FISH est fréquemment utilisée en cytogénétique, caryotype 2, le diagnostic du cancer 3 et pré-implantatoire dépistage génétique 4, et joue un rôle important dans la recherche moléculaire 5-6, car il permet la détection d&#39;acides nucléiques dans leur environnement naturel. Simple analyse d&#39;expression de cellules par l&#39;ARN FISH peut détecter des transcrits primaires indigènes et ARN non codantes étant transcrit à partir de chromosomes, et offre des avantages à d&#39;autres techniques qui évaluent l&#39;expression des gènes au niveau de la population, y compris par exemple RT-PCR quantitative, génome large analyse de l&#39;expression ou Northern blot . En visualisant des transcrits d&#39;ARN provenant directement de leurs sites d&#39;origine, il a par exemple étéa remarqué que l&#39;expression du gène est stochastique 7, et peut être parfois allèle spécifique 8. L&#39;amélioration de la technique ont même permis la détection et la quantification des molécules d&#39;ARNm dans les cellules simples 9-11. Le principe de base de l&#39;hybridation FISH consiste en des acides nucléiques dans la cellule à une sonde d&#39;acide nucléique au moyen de Watson et Crick d&#39;appariement de bases hautement spécifiques. La sonde peut être directement ou indirectement détectée, résultant en un signal qui peut être visualisée au microscope. Les premières tentatives étaient composés de sondes marquées radioactivement, qui avaient inconvénients en fonction des questions de sécurité, la résolution spatiale limitée et la capacité de détecter une seule cible à la fois 12-14. Le développement ultérieur d&#39;étiquettes non radioactives, y compris les fluorochromes, les haptènes, et des enzymes, a permis l&#39;utilisation répandue de FISH comme une technique de biologie moléculaire de routine. La sonde FISH peut être soit directement marqué avec fluorochromes par liaison chimique des molécules fluorescentes de l&#39;acide nucléique et des séquences de 15 nucleotides de l&#39;intégration de 16 à 19 marquées par fluorescence, ou la sonde peut être visualisé indirectement après intégration des haptènes (y compris la biotine et la digoxigénine) et la détection immunologique d&#39;anticorps spécifiques d&#39;haptènes par haptène conjugué à rapporteur fluorescent molécules 20-21. Cette dernière approche permet une amplification du signal à l&#39;aide de plusieurs couches d&#39;anticorps marqués par fluorescence qui sont utilisés pour améliorer le signal d&#39;origine et permet la détection de l&#39;espèce d&#39;ARN qui sont exprimés à des niveaux faibles. En combinant des techniques de marquage direct et indirect et des haptènes différents, plusieurs cibles peuvent être visualisées simultanément dans la même cellule. Une des étapes les plus importantes dans les protocoles de poisson est l&#39;hybridation de la sonde à sa cible. Bien qu&#39;en théorie, une sonde se lier spécifiquement seulement à sa cible, dans la pratique, cette spécificitén&#39;est pas toujours atteint, en tant que sondes peuvent se lier à des régions homologues, des conditions d&#39;hybridation et ne seront pas toujours idéale pour une certaine espèce de la région d&#39;ADN ou d&#39;ARN. Les lavages post-hybridation sont donc d&#39;une importance particulière, car ils peuvent augmenter la rigueur de la procédure de FISH, et peuvent empêcher la liaison non spécifique des sondes FISH, qui se traduirait par un niveau élevé de bruit de fond. Comme les molécules d&#39;ARN sont simple brin, ils peuvent facilement être hybridées à une sonde FISH. En revanche, la molécule d&#39;ADN double brin doit tout d&#39;abord une étape de dénaturation, après quoi, une sonde peut s&#39;hybrider. Ceci est généralement obtenu par chauffage de l&#39;échantillon, ce qui entraîne la dénaturation de l&#39;ADN. Cependant, dans ces conditions difficiles, fragiles, molécules d&#39;ARN simple brin peuvent être perdues. Par conséquent, l&#39;ADN-ARN combiné FISH nécessite l&#39;optimisation des conditions importantes, et il est plus difficile techniquement par rapport à la détection de seulement séparée de l&#39;ARN ou de l&#39;ADN. Ici, nous présentationta protocole détaillé de combinés, simultanée FISH ADN-ARN qui nous a permis d&#39;étudier l&#39;inactivation du chromosome X (XCI) dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris femelle 22-24. XCI est un mécanisme épigénétique cruciale pour le développement embryonnaire femelle 25, et les résultats en hétérochromatinisation et donc faire taire l&#39;un des deux chromosomes X chez les individus de sexe féminin 26-27. Essentiel de ce processus est la non codantes de l&#39;ARN Xist 28-30, qui est réglementée par les 24 protéines RNF12 22-23 et Rex1. Expression de Xist devient régulée à la hausse sur l&#39;avenir chromosome X inactif (Xi) au cours du développement embryonnaire ou sur la différenciation des cellules ES in vitro , et peuvent se répandre le long du chromosome X et d&#39;attirer ainsi remodelage de la chromatine enzymes qui entraînent la fermeture de la transcription du chromosome X 31. Cet étalement de Xist ARN peut être visualisée par FISH ARN en tant que revêtement du chromosome Xcertains, qui est aussi appelé un nuage de Xist. Comme les cellules ES femmes peuvent perdre un de leurs chromosomes X en raison de l&#39;instabilité génomique, nous et d&#39;autres avons utilisé combiné ADN-ARN FISH pour étudier XCI, pour s&#39;assurer que les cellules ne caryotype stables sont évalués dans l&#39;analyse de cet important processus 22,32 -34. Comme avec toutes les techniques de la biologie moléculaire, plusieurs excellents différents protocoles ont été publiés 35-38. Ici, nous présentons notre méthode, à partir de l&#39;induction de la différenciation des cellules ES de souris, la fixation des cellules, l&#39;étiquetage du poisson sondes par Nick-traduction, pré-traitement des cellules fixées pour permettre la perméabilisation et l&#39;utilisation de la sonde suite, l&#39;hybridation de la sonde à l&#39; cible, et enfin la détection de la sonde par des anticorps marqués par fluorescence. Le protocole présenté ici permet la détection de fidèles ARN Xist et le chromosome X dans un délai de deux jours, et les bases de cette technique peut probablement être adapté à otses systèmes et domaines de recherche.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>Les</tr><tr><td>fibroblastes embryonnaires</td><td></td><td></td><td>de souris peuvent être dérivés d’embryons E13.5 ou de sources commerciales par exemple </td></tr><tr><td>milieu de culture cellulaire</td> Millipore ES <td></td><td></td><td>DMEM, 15 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, acides aminés non essentiels, 0,1 mM &#947 ;-mercaptoéthanol et 1 000 U/ml LIF. Filtrer, stériliser et stocker à 4 &#176 ; C pour un maximum de 2 semaines.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline&ndash ; streptomycine (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947 ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES milieu</td><td></td><td></td> de différenciation cellulaire <td>IMDM-Glutamax, 15 % sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, acides aminés non essentiels, 37,8 &#956 ; l/L monothioglycérol et 50 &#956 ; g/ml acide ascorbique</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>monothioglycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire T25</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire 6 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>qualité de culture cellulaire PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25 % (v/v) trypsine/0,2 % (p/v) EDTA dans PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 x 24 mm lamelles de recouvrement</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>gélatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>préparer une solution de gélatine/culture cellulaire à 0,2 % PBS et autoclave</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Diluer à 0,2 % dans 0,01 M HCl (pH 2,0)</td></tr><tr><td>absolu 100 % éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>utiliser de l’eau absolue 100 % éthanol et sans RNAse pour fabriquer des solutions à 70 % et 90</td></tr> % <tr><td>d’éthanol Eau sans RNAse</td><td>Baxter</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>pointes filtrantes stériles</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>kit de marquage à la digoxigénine (traduction DIG-Nick)</td><td>Roche</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>kit de marquage à la biotine (traduction Biotin Nick)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>coton</td><td></td><td></td><td></td>stérilisé</tr><tr><td>Eppendorf tubes Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>ARNt de levure 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïde de saumon 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>souris cot-1 ADN 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de paillasse Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>Modèle 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>Modèle 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ solution</td><td></td><td></td> d’hybridation <td>50 % formamide, 2x SSC, 50 mM tampon phosphate pH 7, 10 % sulfate de dextran pH 7</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Acros organics</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de dextran</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM tampon phosphate, pH 7</td><td></td><td></td><td>ajouter 57,7 ml de 1 M de Na2HPO4 et 42,3 ml de 1 M de NaH2PO4 ; utiliser l’eau traitée DEPC et</td></tr><tr>tampon <td></td><td></td> de<td>dénaturation</td> en autoclave <td>70 % formamide/2x SSC/10 mM tampon phosphate pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7,5 solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-saline-Tween solution de lavage (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#956 ; l Tween-20, ajouter de l’eau libre d’ARNase jusqu’à ce que 1 L</td></tr><tr><td>10x solution</td><td></td><td></td> saline <td>dissolve 85 g de NaCl dans 1 L d’ARNse libre H2O, et autoclave</td></tr><tr><td>Tris-saline-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956 ; l 10x solution saline, 250 &#956 ; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml d’ARNse libre H2O</td></tr><tr><td>BSA, purifié, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr> anticorps <tr><td>anti-creuser</td><td>Roche</td><td></td><td>diagnostics utilise 1:500 dilué dans TSBSA</td></tr><tr><td>Anticorps anti-mouton lapin conjugué avec FITC</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>utilisent 1:250 dilué dans un anticorps anti-lapin TSBSA</td></tr><tr><td>conjugué avec FITC</td><td>Jackson les laboratoires utilisent 1</td><td></td><td>:250 dilué dans</td></tr> un <tr><td>anticorps anti-biotine de souris</td> TSBSA <td>Les diagnostics</td><td></td> de Roche <td>utilisent 1:200 dilués dans</td></tr> un <tr><td>anticorps anti-souris d’âne TSBSA conjugués à de la rhodamine</td><td>Les laboratoires Jackson</td><td>utilisent 1:250 dilué dans un anticorps anti-cheval de chèvre TSBSA</td>conjugué à de la rhodamine Les laboratoires Jackson utilisent 1:250 dilué dans une solution de lavage saline (TS) TSBSA Tris-saline <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10 ml 10x solution saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml sans RNAse H2O</td></tr><tr><td>Vectashield support de montage avec vernis à</td> ongles <td></td><td></td> DAPI Vectorlabs H-1200 <td></td></tr><tr><td>miscroscope</td><td></td><td></td><td></td> fluorescent</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adn-arn combiné fluorescent<em&gt; in situ</em&gt; hybridation (fish) à étudier inactivation du chromosome x dans différencié femme souris cellules souches embryonnaires

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet la détection d&#39;acides nucléiques dans les cellules. ADN FISH est souvent utilisée en cytogénétique et diagnostic du cancer, et peut détecter des aberrations du génome, qui a souvent des implications cliniques importantes. ARN FISH peut être utilisée pour détecter des molécules d&#39;ARN dans les cellules et a fourni des renseignements importants dans la régulation de l&#39;expression génique. La combinaison de l&#39;ADN et de l&#39;ARN FISH dans la même cellule est techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l&#39;ADN poisson pourrait être trop sévère pour fragiles, molécules d&#39;ARN simple brin. Nous présentons ici un protocole facilement applicable qui permet au combiné, la détection simultanée de Xist ARN et l&#39;ADN codé par les chromosomes X. Ce protocole de FISH ADN-ARN susceptible combiné peut être appliquée à d&#39;autres systèmes où à la fois l&#39;ARN et de l&#39;ADN devant être détecté.

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus pour la combinaison de l&#39;ADN-ARN FISH, nous avons pu visualiser inactivation du chromosome X dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de sexe féminin. Figure 1 montre un exemple représentatif d&#39;une expérience FISH ADN-ARN, où nous avons détecté la fois Xist (qui est visible en tant que dite ARN Xist nuage sur le chromosome X inactif et une transcription basale ponctuelle sur le chromosome X actif), et une région du...

Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d&#39;acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l&#39;ARN et de l&#39;ADN à l&#39;aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l&#39;inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'inactivation du chromosome X dans des cellules souches embryonnaires de souris femelles différenciées à l'aide d'une hybridation in situ fluorescente combinée simultanément ADN et ARN, ou FISH ADN-ARN. Ceci est réalisé en induisant d'abord la différenciation de cellules souches embryonnaires de souris femelles. En effet, au cours de ce processus, qui simule le développement embryonnaire post-implantation normal, l'inactivation du chromosome X est initiée, entraînant une transcription accrue et une accumulation d'ARN-Xist codant pour le futur chromosome X inactif.La deuxième étape consiste à fixer les cellules souches embryonnaires différenciées à l'aide de paraldéhyde. Ensuite, préparez les sondes destinées à la détection de l'ADN du chromosome X et de l'ARN de la kyste en marquant des fragments d'ADN avec de la biotine ou de la digoxigénine, par traduction de brèche.La dernière étape consiste à réaliser la procédure FISH ADN-ARN. Les cellules souches embryonnaires différenciées sont perméabilisées, dénaturées, puis hybridées avec les sondes FISH marquées, qui sont ensuite détectées à l'aide d'anticorps conjugués à une fluorochr

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

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Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

Combinant colorant lipophile, In situ</emHybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l'apparition de tissu-spécifique l'expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l'étude de l'activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Nous décrivons ici un ensemble de montage...

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Nous décrivons un protocole robuste et polyvalent pour l'analyse de l'architecture nucléaire par FISH d'ADN 3D à l'aide de sondes fluorescentes directement marqués.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

Nous avons développé un protocole d’hybridation in situ fluorescente (FISH) spécifique au brin facilement personnalisable combiné à l’immunofluorescence. Cela permet un examen détaillé de la dynamique de l’ARN avec un aperçu simultané de la structure de la chromatine, de l’organisation nucléaire et de la régulation transcriptionnelle au niveau de la cellule unique.

Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

Ici, nous présentons une méthode simple pour effectuer une hybridation in situ de l’ADN en fluorescence (DNA ISH) pour visualiser des séquences hétérochromatiques répétitives sur des chromosomes montés sur lame. La méthode nécessite un minimum de réactifs et elle est polyvalente pour une utilisation avec des sondes courtes ou longues, différents tissus et la détection avec des signaux basés sur la fluorescence ou non.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.

Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.

Utilisation d’unique molécule fluorescente hybridation In Situ (FISH-SM) afin de quantifier et Localize ARNm dans les ovocytes murin

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Découvrez la technique FISH combinée ADN-ARN pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris femelle. Cette méthode permet la détection simultanée des acides nucléiques dans leur environnement cellulaire natif.

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