Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

L’objectif général de cette procédure est de mesurer le courant électrique à travers un seul canal ionique. Ceci est accompli en exprimant d’abord de manière hétérologue le canal ionique d’intérêt dans des cellules faciles à travailler et propices aux objectifs expérimentaux. La deuxième étape consiste à utiliser une pipette polie au feu pour obtenir une étanchéité stable sur la membrane cellulaire.

Ensuite, l’expérimentateur doit déterminer le nombre de canaux présents dans le patch, et s’il s’agit d’un enregistrement à canal unique en cours, la dernière étape consiste à traiter et à analyser les données. En fin de compte, l’enregistrement du courant à partir de canaux ioniques uniques est utilisé pour étudier les propriétés biophysiques par lesquelles ces protéines membranaires agissent, ce qui constitue la base de la façon dont les cellules neuronales et autres cellules excitables communiquent. Contrairement aux méthodes qui vous permettent de mesurer des courants à travers plusieurs canaux ioniques actifs, l’avantage de cette approche est que la mesure des courants à travers un canal ionique individuel vous permet de visualiser et de séparer un large éventail de modèles de réponse inhérents à un canal particulier.

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les modulateurs physiologiques et thérapeutiques influencent la communication entre les neurones. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal car il est difficile d’obtenir des enregistrements à faible bruit qui ne contiennent qu’un seul canal ionique. Lorsque vous essayez cette méthode pour la première fois, il est vraiment utile de voir quelqu’un le faire, car pour obtenir une étanchéité vraiment stable, ce qui est la chose la plus importante dans cette méthode, vous devez approcher la cellule doucement à l’angle particulier, et surtout, vous devez être persévérant pour vous préparer à la transfection.

Les cellules HEK 2 93 sont plaquées dans des boîtes de 35 millimètres un jour à l’avance pour les amener à 50 à 60 % de confluence dans un tube stérile. Préparez le mélange de transfection. Ajouter un microgramme de chaque CDNA d’intérêt, 315 microlitres d’eau double distillée et 350 microlitres de tas de 42 millimolaires.

Enfin, ajoutez 35 microlitres de chlorure de calcium goutte à goutte pour former le précipité. Faites tourbillonner le tube pendant cinq secondes et ajoutez 175 microlitres de suspension de transfection dans chacune des quatre paraboles. Assiette la veille.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, retirer le milieu et laver avec du PBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de croissance, complété par deux millimolaires de chlorure de magnésium pour prévenir une excitotoxicité médiée par le récepteur MDA.

Tirez d’abord deux pipettes d’enregistrement symétriques en verre de silicate à l’aide d’un extracteur vertical. Ensuite, un polissage au feu est nécessaire pour obtenir le diamètre et la résistance appropriés. Ensuite, configurez l’enregistrement en ouvrant le logiciel d’acquisition de données QUB et en sélectionnant la fenêtre d’acquisition.

Sous la mise en page. Ouvrez un nouveau fichier de données QUB en cliquant sur nouvelles données et entrez les paramètres expérimentaux à utiliser. Ajustez l’échelle d’amplitude à 0,1 volts par pico ampli en cliquant avec le bouton droit sur le fichier de données, en sélectionnant les propriétés, puis en cliquant sur l’onglet données.

Après avoir remplacé le milieu par deux millilitres de PBS contenant du calcium et du magnésium, montez la boîte de cellules sur la platine du microscope. Concentrez-vous sur le champ cellulaire à l’aide de la microscopie à contraste de phase pour évaluer si les cellules sont saines et bien attachées à la parabole en mode monocouche. Passez à la détection de fluorescence pour vérifier que la transfection a réussi.

Ensuite, définissez les paramètres d’enregistrement sur un seul canal. Réglez le mode sur la pince de tension et la tension appliquée à plus 100 millivolts avec la commande de maintien de tension. En position d’arrêt, sélectionnez le bouton de test d’étanchéité en fonction de la fluorescence et de l’aspect général.

Choisissez une cellule pour le patch, vérifiez sous contraste de phase que la cellule est bien attachée à la parabole, qu’une grande partie de la surface de la cellule est exposée pour le patchage et qu’elle a l’air saine. Remplissez une pipette fraîchement polie avec une solution adaptée aux récepteurs NMDA et aux expériences attachées aux cellules et effleurez doucement pour déloger les bulles d’air. Fixez la pipette d’enregistrement sur la tête de l’amplificateur et assurez-vous que le fil d’argent est immergé dans la solution de la pipette pour éviter que la solution du bain ne pénètre dans la pipette.

Pendant l’approche, utilisez une petite seringue en plastique reliée au porte-pipette pour appliquer doucement une pression positive. Ensuite, utilisez le micromanipulateur pour diriger la pipette dans le bain. En fermant le circuit électrique, positionnez-le directement sur la pile sélectionnée pour le raccordement.

Prenez note de l’oscilloscope à l’entrée dans le bain. La résistance de la pipette doit se situer dans la plage optimale tout en surveillant visuellement la position du tuyau dans le microscope et sa résistance électrique sur l’oscilloscope. Continuez l’approche par petits incréments jusqu’à ce que la pipette frappe doucement la cellule.

Le signal de test diminuera légèrement pour indiquer une résistance accrue. Pour former un joint, prenez la seringue et appliquez doucement une légère pression négative à travers la tubulure latérale. En tirant sur le piston de la seringue, la formation du joint est indiquée par un aplatissement complet de la forme d’onde du signal de test sur l’oscilloscope.

Sur l’amplificateur. Basculez la bascule de la commande externe du test d’étanchéité à la désactivation. Basculez la commande de maintien de tension de off à positive et augmentez le gain de 10 x à 100 x.

Observez l’activité des canaux de l’oscilloscope, qui, le cas échéant, sera affichée sous forme de déviations carrées vers le bas par rapport à la ligne de base précédemment plate. Si l’activité du canal est affichée sur l’oscilloscope, commencez à acquérir des données dans le fichier numérique précédemment ouvert dans QUB en appuyant sur le bouton de lecture, puis sur le bouton d’enregistrement. Pour arrêter l’acquisition de données, appuyez sur le bouton d’arrêt dans QUB et enregistrez dans le fichier QDF un signal qui ne s’aplatit pas complètement, ou une ligne de base qui devient bruyante et instable peut indiquer une étanchéité faible.

Dans ce cas, retirez et jetez la pipette et répétez les étapes précédentes avec une pipette neuve jusqu’à l’obtention d’une étanchéité adéquate. Pour commencer le processus d’analyse des données, ouvrez le fichier de données enregistré dans QUB et inspectez la trace actuelle dans la pré-interface. Sous la mise en page.

Retirez le filtre numérique pour afficher la trace enregistrée sur toute la bande passante en décochant la case fc. Scannez visuellement la trace pour repérer les irrégularités et les artefacts. Les pics de courant peuvent être corrigés en mettant en évidence une région propre adjacente de la même classe de conductance.

En cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant d’abord définir la mémoire tampon d’effacement, zoomez sur le pic jusqu’à ce que des points d’échantillonnage individuels soient visibles. Sélectionnez la région à remplacer en mettant en surbrillance uniquement cette région. Faites un clic droit et sélectionnez Effacer pour corriger la ligne de base de l’ensemble de l’enregistrement.

Définissez la ligne de base actuelle zéro en sélectionnant une première partie de l’enregistrement où la ligne de base est stable. Mettez en surbrillance le clic droit et sélectionnez définir la ligne de base. Lorsque la ligne directrice de base apparaît, vérifiez par une inspection visuelle qu’elle représente fidèlement le niveau de référence.

Identifiez les points de l’enregistrement où la référence des données brutes s’écarte visiblement de la référence définie. Corrigez cela en sélectionnant une petite section de la ligne de base dans la région déviante. Cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez la commande Ajouter un nœud de base.

Lorsque l’enregistrement contient des périodes occasionnelles avec un excès de bruit ou d’artefacts, qui ne peuvent pas être facilement corrigés, ces parties doivent être supprimées, mais doivent d’abord être divisées en segments consécutifs. Mettez en surbrillance immédiatement avant la région à jeter. Faites un clic droit et sélectionnez Segment de rupture.

Ensuite, mettez en surbrillance la section à supprimer : cliquez avec le bouton droit, sélectionnez, supprimez et appuyez sur Entrée pour idéaliser les enregistrements. Passez à l’interface MOD sous la mise en page. Dans le panneau d’affichage des données, sélectionnez une petite partie de l’enregistrement contenant à la fois des événements fermés et ouverts.

Déplacez le curseur dans le panneau haute résolution ci-dessous et, dans la trace sélectionnée, mettez en surbrillance un segment propre représentatif de la ligne de base. Déplacez le curseur sur le panneau du modèle ci-dessous, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le carré noir, qui représentera l’état fermé et sélectionnez Saisir. Répétez la procédure pour les ouvertures de canal en mettant en évidence une partie des traits qui représente la conductance ouverte.

Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le carré rouge dans le panneau du modèle et sélectionnez Saisir. Effectuez l’idéalisation de la partie sélectionnée de l’enregistrement en sélectionnant le bouton SEL sous Source de données. Faites ensuite un clic droit sur l’onglet idéalisé sous la section de modélisation dans le panneau contextuel.

Vérifiez que les paramètres d’analyse souhaités sont corrects, puis cliquez sur Exécuter. Le résultat de l’idéalisation ainsi que l’histogramme d’amplitude de la partie sélectionnée sont superposés aux données pour permettre une inspection visuelle de l’idéalisation. Si nécessaire, ajustez les paramètres d’idéalisation pour obtenir le meilleur résultat et répétez l’opération, effectuez l’idéalisation pour l’ensemble du fichier en sélectionnant le bouton Fichier sous Source de données.

Faites ensuite un clic droit sur l’onglet idéalisé et cliquez sur Exécuter. Les résultats de l’ensemble du fichier s’affichent. Superposé aux données, inspectez soigneusement la correspondance entre la trace idéalisée et les données enregistrées.

Parfois, des événements sont faussement identifiés qui peuvent être exclus de la trace idéalisée. Sélectionnez l’événement false, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Rejoindre l’IDL. On voit ici les courants d’ions calcium uniquement à travers un seul récepteur NMDA dans une cellule HEK 2 93.

En utilisant la technique du patch clamp attaché à la cellule, l’idéalisation des données produit des histogrammes d’amplitude, qui s’intègrent parfaitement dans deux classes de conductance distinctes dans cette cellule. Enregistrement joint à partir de cellules HEK 2 93, un canal sensible méno est activé par moins 20 millimètres. Pression du mercure à travers la pipette patch lors de l’application constante de la tension.

La ligne pointillée rouge indique le niveau de courant zéro. Ces enregistrements à partir de canaux natifs montrent une activité continue du récepteur NMDA enregistrée à partir du soma d’un neurone qui a été dissocié du cortex préfrontal d’un embryon de rat et maintenu en culture pendant cinq ou 27 jours. Une fois masterisée, cette procédure peut être effectuée en 30 minutes à une heure selon la durée de l’enregistrement.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse cinétique et la modélisation d’état peuvent être effectuées pour déterminer le mécanisme de déclenchement d’un canal et pour estimer les taux de réaction. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une assez bonne compréhension de la façon d’enregistrer et de commencer à analyser les courants à travers une protéine de canal ionique.