Name: Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse à haut débit des récepteurs olfactifs mammifères utilisant un test à la luciférase dans des cellules H three A. Cette technique permet de quantifier l'activation des récepteurs en réponse à diverses odeurs.

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Ce travail a été soutenu par R01 DC013339, R03 DC011373, et Ruth L. Kirschstein Service national de la recherche Prix T32 DC000014. Une partie des travaux a été réalisée en utilisant le Monell Chemosensory signalisation des récepteurs de base, qui est pris en charge, en partie, par le financement de la P30 DC011735 NIH-NIDCD base Grant. Les auteurs remercient C. Sézille de l&#39;aide à la collecte de données.

1. Culture de cellules Hana3A <ol><li> Préparer des milieux M10 en complétant le milieu essentiel minimum (MEM) avec 10% (v / v) de FBS. </li><li> Culture Entretien <ol><li> Maintenir les cellules dans les médias M10. REMARQUE: Les vecteurs d&#39;expression pour RTP1L, RTP2, REEP1, et G αolf confèrent une résistance à la puromycine à cellules Hana3A, mais le maintien des cellules avec cet antibiotique n&#39;affecte pas significativement les résultats du dosage. </li><li> Subculture à un rapport de 1:8 en boîtes de 10 cm tous les 2-3 jours. </li><li> Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Cellules de placage pour la transfection <ol><li> Aspirer le milieu d&#39;une confluence de 10 cm de cellules Hana3A 100%. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 10 ml de PBS, tourner le plat, et aspirer le PBS. </li><li> Ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA et attendre pour que les cellules se dissocient (environ 1 min). </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de M10 et de briser les mottes de cellules par trituration environ 10x &amp;# 160; avec une pipette de 10 ml. Pipette avec précaution pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les médias. </li><li> Pour chaque plaque à 96 puits, le transfert de 1 ml de cellules dans un tube conique de 15 ml, centrifuger à 200 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 6 ml de M10 par 1 ml de cellules transférées à l&#39;étape 2.5. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de cellules à chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 3. Transfection de récepteurs olfactifs <ol><li> Préparation d&#39;ADN plasmidique <ol><li> Préparer l&#39;ADN de plasmide par l&#39;intermédiaire d&#39;un protocole sans endotoxine. NOTE: L&#39;utilisation des kits de préparation d&#39;ADN plasmide désigné «exempt d&#39;endotoxine&quot;, ou ajouter une étape d&#39;extraction au phénol-chloroforme pour le protocole de préparation de l&#39;ADN plasmidique. </li><li> Diluer l&#39;ADN jusqu&#39;à une concentration de 100 ng / ul dans du tampon TE. </li></ol></li><li> Respecter les cellules étalées (étape 2.7) pour assurer une bonne confluence de rapprochementTely 30-50% par puits et retourner à l&#39;incubateur. REMARQUE: Bien que ce confluence n&#39;est pas optimal pour le réactif de transfection lipide, une confluence de 30 à 50% à cette étape est optimale pour la mesure de l&#39;activité de luciférase 24 heures après transfection. </li><li> Préparation du mélange de transfection <ol><li> Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc, et pSV40-RL plasmides dans du milieu MEM par les volumes détaillés dans le tableau 1 pour rendre le mélange plasmide (volumes indiqués sont par plaque de 96 puits). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Plasmide mélange </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> par puits </td><td> par plaque de 96 puits </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 pl </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2,5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> pCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Plasmide composants de mélange. Par puits et par des volumes de plaques à 96 puits de RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc, et pSV40-RL, et MEM. </li><li> Pour chaque plaque à 96 puits, diluer 18 ul de réactif de transfection lipide dans 450 ul de milieu MEM. </li><li> Pipette plasmide mélange (étape 3.3.1), la rhodopsine marqués récepteur olfactif dans pCI plasmide (Rho-OU-PCI), et des lipides mélange de transfection (de l&#39;étape 3.3.2) pour rendre le Complexe détaillée dans <strong&gt; Tableau 2. Mélanger la solution par trituration et incuber à température ambiante pendant 15 min. Arrêter la réaction en ajoutant M10 selon le tableau 2. REMARQUE: cette réaction est sensible au temps et ne devrait pas être autorisé à poursuivre pendant plus de 30 min. Le puits + 10% calcul est important de s&#39;assurer un volume suffisant pour les étapes suivantes. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Complexe </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> par puits </td><td> par puits + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Plasmide mélange </td><td> 4,2 pl </td><td> 4,58 pi </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OU-PCI </td><td> 0,05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Transfection lipide mélange </td><td> 4,2 pl </td><td> 4,58 pi </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41,7 pi </td><td> 45.83 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Des composants complexes par puits et par puits + 10% des volumes de mélange plasmide (tableau 1), le plasmide de récepteur olfactif (Rho-OU-pCI), et la transfection lipide mélange.. M10 est ajouté pour arrêter la réaction après une incubation de 15 min à température ambiante. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Appuyez sur les médias sur les plaques de la cellule. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de complexe à chaque puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 4. Odeur Stimulation <ol><li> Respecter les cellules transfectées pour assurer une bonne confluence de 50-80% par puits et retourner à l&#39;incubateur. Remarque: si des cellules sont à moins de 50% Confluentes, la luciférase de luciole et la luciférase de Renilla lectures peuvent être trop faible pour la mesure de l&#39;activation du récepteur. Considérez jeter la plaque. </li><li> Préparer une M d&#39;solutions de chaque odeur dans le DMSO. </li><li> Préparer des solutions de stimulation des odeurs en milieu CD293. <ol><li> Pour les expériences de dépistage, diluer la solution mère de l&#39;odeur à 100 um. Préparer aussi un contrôle sans odeur (CD293 uniquement) afin de contrôler ou de l&#39;activation de fond. NOTE: Pour les expériences de dépistage, chaque paire OU / odeur est testé une seule fois par l&#39;expérience. Parce que certains diffusion des odeurs à travers les puits est possible, il est recommandé de stimuler avec une substance odorante pour chaque plaque. </li><li> Pour les expériences de dose-réponse, préparer sept 10 dilutions en série de solution odeur de stock en trois exemplaires à partir de 1 mM pour chaque récepteur. Préparer également les mêmes dilutions d&#39;odeur, en triple exemplaire pour les cellules transfectées par un vecteur vide, afin de contrôler l&#39;odeur de l&#39;activation d&#39;arrière-plan. NOTE: Pour les expériences de dose-réponse, chaque otraitement de concentration de dor devrait être effectuée en triple. </li></ol></li><li> Appuyez sur les médias sur les plaques de la cellule. </li><li> Pipette 25 ul de solution de stimulation de l&#39;odeur à chaque puits et incuber pendant 4 heures. </li></ol> 5. Mesure ou une activité par dosage de luciférase <ol><li> Remettre en suspension substrat luciférase de luciole par les instructions et magasin du fabricant à -80 ° C. </li><li> Décongeler 1 ml de substrat de la luciférase de luciole par plaque de 96 puits. </li><li> Préparer réaction luciférase de luciole frais quencher et la luciférase de Renilla réactif de substrat (5 ul luciférase quencher / Renilla luciférase de substrat pour 1 ml de tampon). REMARQUE: Environ 1 ml de réactif est nécessaire par plaque de 96 puits. </li><li> Préparer le lecteur luminescent de microplaques. Ouvrez le logiciel de lecteur de microplaques. Dans l&#39;icône du système: <ol><li> Dans le cadre du &quot;pré-chauffage&quot; Tab, cochez la case &quot;ON&quot; et régler la température de la machine à 25 °; C. </li><li> Sous l&#39;onglet «distributeur», le premier de chaque distributeur avec 1000 ul de 70% d&#39;éthanol suivie par 1 000 pi d&#39;eau distillée. REMARQUE: Utilisez des portions séparées de l&#39;alcool et de l&#39;eau pour chaque distributeur. L&#39;éthanol est utilisé pour désinfecter les distributeurs, et de l&#39;eau élimine l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Premier distributeur de chaque 1500 pi de l&#39;air (supprimer les distributeurs de liquide). REMARQUE: amorçage avec de l&#39;air assure que les substrats de luciférase sont pas dilués avec de l&#39;eau résiduelle. </li><li> Premier distributeur 1 avec 1080 ul de substrat de la luciférase de luciole (de l&#39;étape 5.2). Premier distributeur 2 avec Renilla substrat de la luciférase (de l&#39;étape 5.3). REMARQUE: Veillez à ne pas contaminer les substrats de luciférase. Amorçage avec des substrats de luciférase remplit l&#39;espace mort dans les distributeurs de réactifs. </li></ol></li><li> Mettre en place le protocole suivant pour lire à la fois luciole et de Renilla luminescence. Dans le logiciel associé au lecteur de microplaques, nonder le menu &quot;Fichier&quot;, cliquez sur &quot;Nouvelle tâche&quot;. Mettez en surbrillance &quot;Protocoles&quot; et cliquez sur &quot;Créer nouveau&quot;. Dans la fenêtre suivante, le cercle à côté de &quot;protocole standard&quot; doit être sélectionné. Cliquez sur &quot;OK&quot;. Double-cliquez sur «Procédure» sur le côté gauche de l&#39;écran. <ol><li> Distribuer 10 ul de substrat de la luciférase de luciole à tous les puits à l&#39;aide de distributeur 1. Dans le menu &quot;Actions&quot;, cliquez sur &quot;Dispense&quot;. Dans la fenêtre «Distribuer étape&quot;, set: «Distributeur» à 1, &quot;Amorçage&quot; à aucun, &quot;Volume Dispense&quot; à 10 pi et &quot;Rate&quot; à 225 pi / sec. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Agiter la plaque pendant 30 sec. Dans le menu &quot;Actions&quot;, cliquez sur &quot;Shake&quot;. Dans la fenêtre «Secouez étape&quot;, réglez &quot;Intensity&quot; à moyen et «Durée» à 00h30 MM: SS. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Lire la luminescence de tous les puits de 0,5 sec par puits. Dans le menu &quot;Actions&quot;, cliquez sur &quot;Lire&quot;;. Dans la fenêtre &quot;Lire étape&quot;, set: «Méthode de détection&quot; à luminescence, &quot;Lire Type&quot; Endpoint &quot;temps d&#39;intégration&quot; à 00:00:50 MM: SS: ss, &quot;jeux de filtres&quot; à une &quot;émission&quot; Hole, &quot;Optique Position&quot; de la page &quot;Gain&quot; à 135, et &quot;Lire Hauteur&quot; à 1,00 mm. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Distribuer 10 ul de substrat de la luciférase Renilla à tous les puits à l&#39;aide de distributeur 2. Définissez les conditions à l&#39;étape 5.6.1, sauf ensemble &quot;distributeur&quot; à 2. </li><li> Agiter la plaque pendant 30 secondes. Fixer les conditions que l&#39;étape 5.6.2. </li><li> Lire la luminescence de tous les puits de 0,5 sec par puits. Fixer les conditions que l&#39;étape 5.6.3. </li></ol></li><li> Retirez le couvercle de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans le lecteur de microplaques. Démarrez le programme mis en place à l&#39;étape 5.5 pour lire plaque luminescence. </li><li> Nettoyez les pompes de distribution de réactifs. De l&#39;icône du système sous l&#39;onglet «distributeur»: <ol><li> Purger 1000 pi de firefly substrat de la luciférase de la luciole luciférase distributeur dans un tube de récupération. REMARQUE: la luciférase de luciole peut être stocké à -80 ° C, et réutilisés. </li><li> Premier distributeur de chaque 1000 pi d&#39;eau distillée, puis de 1000 pi de 70% d&#39;éthanol, et enfin 1500 pi de l&#39;air (supprimer les distributeurs de liquide). REMARQUE: L&#39;eau élimine les substrats de luciférase des pompes de réactifs, désinfecte d&#39;éthanol et sèche à l&#39;air tout éthanol résiduel. </li></ol></li></ol> 6. Analyse des données <ol><li> Data Export <ol><li> Dans le logiciel de lecteur de microplaques, double-cliquez sur &quot;Rapport / Export constructeurs» sur le côté gauche de l&#39;écran. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Nouveau Exporter vers Excel&quot; et cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Sélectionnez Export1 et cliquez sur &quot;Modifier&quot;. <ol><li> Sous la rubrique «Contenu» cochez la case «Description du système&quot;, &quot;procédure&quot;, &quot;Plate Description», et «disposition de la plaque Matrix&quot;. Inclure un &quot;données brutes&quot;e &quot;Calculé données&quot;. </li><li> Sous &quot;Workflow&quot;, cochez la case &quot;Exécuter automatiquement à l&#39;issue de la procédure&quot;. Sous le mode d&#39;exportation, consultez «Toutes les plaques dans le même classeur» et «En tant que nouvelle feuille de calcul&quot;. </li><li> Sous &quot;Fichier&quot; puis choisissez le format du nom de fichier et l&#39;emplacement du fichier, et cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Fermez la fenêtre &quot;Rapport / constructeurs exportation&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Pour obtenir des valeurs de luciférase normalisées, diviser la luciférase de luciole lecture de luminescence pour chaque puits (étape 5.6.3) par la lecture de luminescence Renilla pour chaque puits (étape 5.6.6). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Identité odorant est codé par des motifs d&#39;activation des récepteurs olfactifs, mais les modèles d&#39;activation des récepteurs, y compris les récepteurs qui sont activées et à quel degré, sont connus pour moins de 6% des récepteurs olfactifs humains 1-11. Les efforts visant à caractériser les récepteurs olfactifs ont été limités par leurs méthodes ou de l&#39;applicabilité de main-d&#39;œuvre à un sous-ensemble de la 17,23,24,33,34 de famille de récepteur olfactif. Le système d&#39;expression...

Le système olfactif de mammifère a la capacité de répondre à un grand nombre de stimuli odorants, permettant la détection et la discrimination des milliers de substances odorantes. Les récepteurs olfactifs (RUP) sont les capteurs moléculaires exprimés par les neurones sensoriels olfactifs dans l&#39;épithélium olfactif 12. La reconnaissance de l&#39;odeur de mammifère se produit par l&#39;activation différentielle des RUP par odorants, et la famille ou le gène est vaste, avec environ 1000 murin et 400 récepteurs humains 12-16. Analyses fonctionnelles antérieures de RUP dans les neurones olfactifs et dans les cellules hétérologues ont montré que différentes substances odorantes sont reconnus par unique, mais qui se chevauchent ensembles de RUP 10,17-20. Ligands correspondants à RUP est essentiel pour comprendre le code olfactif et essentiel pour construire des modèles viables de l&#39;olfaction. En raison de la difficulté à exprimer des RUP dans des systèmes hétérologues ainsi que le grand nombre des deux substances odorantes et les RUP, ces données ont été largement absent de la fIELD; en effet, moins de 6% des RUP humains ont un ligand publié 1-11. Ce protocole décrit l&#39;utilisation d&#39;un dosage de la luciférase pour caractériser les interactions odorantes / OU. Ce test permet la caractérisation à haut débit de RUP, une tâche qui est essentielle pour comprendre odorant / OU interactions ainsi que l&#39;élaboration d&#39;un modèle de codage des odeurs. Études à haut débit de RUP sont confrontées à trois défis majeurs. Tout d&#39;abord, RUP exprimés dans des cellules hétérologues ont été retenues dans le RE et ensuite dégradées dans le protéasome 21,22, ce qui empêche les RUP d&#39;interagir avec des substances odorantes dans le système de dosage de 23 à 25. Ce problème a été résolu par la découverte de protéines accessoires qui facilitent l&#39;expression stable à la surface cellulaire d&#39;un large éventail de RUP 19,26,27. Récepteur-transporteur protéines 1 et 2 (RTP1 et 2) promouvoir ou expression à la surface cellulaire et l&#39;activation en réponse à la stimulation odorante 19. Sur la base de ce travail, les cellules étaient HEK293Tmodifiée pour exprimer de manière stable à long RTP1 (RTP1L) et RTP2, améliorant l&#39;expression du récepteur de protéine 1, et G αolf, résultant dans la lignée cellulaire Hana3A 19,27. En outre, le récepteur de l&#39;acétylcholine muscarinique de type 3 (M3-R) interagit avec RUP à la surface des cellules et augmente en réponse à l&#39;activation 26 des agents odorants. La co-transfection d&#39;un OU avec RTP1S et M3-R en Hana3A cellules résulte de l&#39;expression robuste, cohérente et fonctionnelle d&#39;un large éventail de RUP à la surface de la cellule 27. Deuxièmement, mammifères ou répertoires sont assez grandes. Chez les êtres humains, par exemple, le répertoire OR est un ordre de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs gustatifs, et deux ordres de grandeur plus nombreux que le répertoire des récepteurs visuelle. Bien que le clonage d&#39;un simple OU est un protocole relativement simple, important effort initial est nécessaire pour générer une bibliothèque complète. Troisièmement, même si nous savons que dans la vision, la longueur d&#39;onde se traduit par la couleur etla fréquence de l&#39;audition se traduit pas, l&#39;organisation des odeurs est mal comprise, ce qui rend difficile pour les chercheurs d&#39;interpoler à partir d&#39;un échantillon représentatif de substances odorantes. Bien que certains progrès ont été réalisés sur ce front 10,28, la carte du paysage olfactif reste incomplète. Dépistage des dizaines de milliers de molécules contre des centaines de RUP est une tâche ardue; criblages à haut débit dans ce domaine nécessitent des campagnes soigneusement définis. Les principaux défis à relever sont ceux de la logistique et des coûts plutôt que sur les problèmes inhérents à la technique. Bien que le dépistage hétérologue n&#39;a pas été largement utilisé pour identifier des ligands par des groupes universitaires, une société privée a utilisé la même technique pour identifier des ligands pour 100 RUP humaines 29. Malheureusement, ces données restent propriétaires. Le dosage de la luciférase à haut débit décrit ici présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives utilisées pour évaluer ou d&#39;activation. Bien que la responsabilitésession de neurones sensoriels olfactifs indigènes ont été mesurées à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie et d&#39;imagerie calcique, ces techniques ont des difficultés à taquiner à part qui OU conduit à la réponse d&#39;un neurone en raison du chevauchement dans les propriétés de réponse des neurones olfactifs. Bien que dans un cognement-GFP-étiqueté du récepteur de type 30,31, délivrant par l&#39;intermédiaire de récepteurs spécifiques de l&#39;adénovirus murins neurones olfactifs 32,33, ou d&#39;effectuer une RT-PCR après enregistrements 17,24,33 peuvent lier des enregistrements de types de récepteurs individuels, ces méthodes sont faible débit et ne convient pas pour les écrans de grande envergure. Systèmes de contrôle hétérologues sont plus évolutive, et deux formes principales se trouvent dans la littérature: les journalistes de la voie de l&#39;AMPc et l&#39;inositol triphosphate (IP3) journalistes de la voie. Lors de la stimulation de l&#39;odeur, RUP activent une cascade de signalisation αolf G de transduction qui conduit à la production d&#39;AMP cyclique (AMPc) 12. Par co-transfection d&#39;un gène rapporteur de luciférase de luciole sous le contrôle d&#39;acÉlément de réponse à l&#39;AMP (CRE), la production de la luciférase peut être mesurée en fonction de la réponse de l&#39;odeur, ce qui permet la quantification de l&#39;activation OU. Ou l&#39;activation peut également être lié à la voie IP3 par la co-expression des protéines G telles que G α15/16 ou un G α15-olf chimère 24,25,34. Nous avons choisi le test présenté ici repose sur trois facteurs: (1) la co-expression de RTP1 avec récepteurs olfactifs Rho-marqués améliore l&#39;expression des récepteurs olfactifs à la surface des cellules 19,27; (2) l&#39;utilisation d&#39;un gène rapporteur AMPc-sensible permet la mesure de OU activation par la voie de second messager canonique; et (3) le test est bien adaptée aux écrans à haut débit. Ce dosage de la luciférase à haut débit est applicable à une variété d&#39;études de grande valeur dans le domaine de l&#39;olfaction. Premièrement, un grand nombre de RUP peut être criblée contre une seule substance odorante en vue de déterminer le motif de l&#39;activation du récepteur pendant une spodorant ecific. Ce type d&#39;étude a identifié OR7D4 comme le OU chargé de répondre à l&#39;androsténone odorant stéroïde 8. Inversement, un ou peut être projeté contre un panneau de substances odorantes afin de déterminer le profil de la réponse du récepteur 10. Lorsque candidat olfactif odorant / OU paires sont identifiés par ces écrans, l&#39;interaction peut être confirmé par la réalisation d&#39;une expérience de dose-réponse examiner la réponse de la salle d&#39;opération à des concentrations croissantes de substance odorante. courbes dose-réponse peuvent également évaluer la variation génétique dans une OU affecte en réponse odorant vitro 8,9,11,35, et ces études peuvent être étendues à interspécifique OU variation, permettant à l&#39;examen de l&#39;évolution des récepteurs à travers les espèces et les mutations causales dans l&#39;évolution 36,37, Enfin, ce dosage peut être utilisé pour cribler des antagonistes d&#39;odeurs qui sont capables d&#39;antagoniser ou une réponse à une substance odorante particulier pour une paire odorant / récepteur connue 38,39. En résumé, cette hauteDosage de la luciférase-débit est applicable à une série d&#39;études qui aideront à caractériser ou des motifs d&#39;activation et de fournir une meilleure compréhension du codage des odeurs dans le système olfactif.

<table><tbody><tr><td>Cellules Hana3A</td><td>Disponibles auprès du Laboratoire Matsunami sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>Disponibles auprès du Laboratoire Matsunami sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>Disponibles auprès du Laboratoire Matsunami sur demande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp ; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044 ? ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (sans Ca2+ et Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Trypsine (0,05 % de trypsine EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054 ? ICID=search-product">Trypsine</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019 ? ICID=search-11913019">CD293</a</td></tr><tr><td>>96-well PDL blanc/transparent</td><td>plaque BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plaques</a></td></tr><tr><td>Réactif de transfection lipidique : Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019 ? ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td></tr><tr><td>Substrat de luciférase Firefly, quencher luciferase Firefly luciferase/Renilla substrat de luciférase : Dual-Glo Assay</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp ;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr><tr><td>Logiciel de lecture de microplaques : Gen5 Logiciel d’analyse de données</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956 ; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956 ; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956 ; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">pointes XYZ</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956 ; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html"> pointes XYZ</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp ; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants créer des motifs uniques et se chevauchant de l&#39;activation du récepteur olfactif, ce qui permet une famille d&#39;environ 1000 et 400 murin récepteurs humains de reconnaître des milliers de substances odorantes. Ligands odorants ont été publiés pour moins de 6% des récepteurs humains 1-11. Ce manque de données est dû en partie à la difficulté à exprimer fonctionnellement ces récepteurs dans des systèmes hétérologues. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer la majorité de la famille des récepteurs olfactifs dans des cellules Hana3A, suivi d&#39;une évaluation à haut débit de l&#39;activation du récepteur en utilisant un test olfactif rapporteur de la luciférase. Ce dosage peut être utilisé pour (1) des panneaux d&#39;écran de substances odorantes contre les panneaux de récepteurs olfactifs; (2) confirmer interaction odorant / récepteur via des courbes dose-réponse; et (3) comparer les niveaux d&#39;activation du récepteur entre les variants du récepteur. Dans nos données d&#39;exemple, 328 récepteurs olfactifs ont été projetés contre 26 odorants. Paires odorant / récepteurs avec des scores variant de réponse étaient de sélectionted et testé en réponse à la dose. Ces données indiquent que l&#39;écran est une méthode efficace pour enrichir en paires odorant / récepteurs qui vont passer d&#39;une expérience de dose-réponse, à savoir les récepteurs qui ont une réponse de bonne foi à une substance odorante. Par conséquent, ce dosage de la luciférase à haut débit est une méthode efficace pour caractériser les récepteurs-une étape essentielle olfactif vers un modèle de codage d&#39;odeur dans le système olfactif de mammifère.

Un écran primaire testé 328 RUP contre 26 odeurs à une concentration de 100 uM. Cette concentration d&#39;odeur a été démontrée pour activer efficacement une grande proportion des RUP avec des ligands connus 10. Tout d&#39;abord, l&#39;activité de la luciférase normalisée a été calculée en divisant la lecture de la luciférase de luciole par la luciférase de Renilla lecture. Ensuite, les valeurs baselined ont été calculées en soustrayant les lectures de la luciférase normalisée pour la commande de pas...

Modèles d&#39;activation des récepteurs olfactifs codent l&#39;identité de l&#39;odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d&#39;un modèle complet de codage de l&#39;odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l&#39;identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l&#39;activation du récepteur.

Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’effectuer une mesure à haut débit de l’activation des récepteurs olfactifs via un test de luciférase. Ceci est réalisé en transectant des cellules H trois A avec des vecteurs contenant des protéines accessoires, des luciférases et des récepteurs olfactifs de luciférase et de vanille afin d’exprimer un récepteur olfactif différent. Dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.Dans un deuxième temps, les cellules sont stimulées par des odeurs. Ensuite, un substrat de luciférase est ajouté, provoquant la luminescence des cellules qui ont produit l’enzyme luciférase, fonctionnant ainsi comme un rapporteur pour l’activation des récepteurs olfactifs. En fin de compte, les résultats montrent les réponses de la population de récepteurs olfactifs aux odeurs en fonction de la luminescence de chaque puits dans la plaque.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’adénovirale, la transduction des neurones natifs ou l’imagerie calcique, est que cette technique permet à la fois des cribles à haut débit et utilise la deuxième voie de messager médiée par le CM natif pour examiner l’activation des récepteurs olfactifs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’olfaction, telles que l’appariement des ligands olfactifs, donc des récepteurs olfactifs, et l’examen de l’effet de la variation génétique sur l’activation des récepteurs olfactifs. Les trois cellules A Hanna utilisées dans ce protocole sont maintenues dans un milieu M 10 à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2, et doivent être confluentes à 100 % afin de plaquer les cellules pour les milieux d’aspiration par transfection à partir d’une boîte de 10 centimètres de cellules de lavage des cellules.En ajoutant 10 millilitres de PBS en faisant tourner la parabole et en aspirant le PBS, ajoutez trois millilitres de 0,05 % de tripsin EDTA et attendez environ une minute pour que les cellules se dissocient à température ambiante. Inactivez la trypsine en ajoutant cinq millilitres de milieu M 10, brisez les amas cellulaires par tri rating environ 10 fois avec une pipette de 10 millilitres. Pipetez avec précaution pour éviter d’introduire des bulles d’air dans le support.Pour chaque plaque de 96 puits, transférez un millilitre de cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez à 200 fois la gravité pendant cinq minutes et aspirez le surnageant sans perturber la résistance de la pastille cellulaire. Suspendez les cellules dans 12 millilitres de M 10, pipetez 50 microlitres de cellules à chaque puits des plaques de 96 puits et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.Avant de commencer cette procédure, observez les cellules plaquées la veille pour assurer une bonne cohérence d’environ 30 à 50 % par puits. Remettez les plaques dans l’incubateur et continuez. Pour préparer la transfection, mélangez les plasmides pour exprimer les protéines accessoires.La luciférase Firefly et la luciférase à la vanille ont chacune été diluées à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre dans un tampon TE pour faire le mélange plasmidique pipeter les plasmides dans un milieu mem selon les volumes indiqués dans ce tableau. Pour chaque plaque à 96 puits, diluez 18 microlitres de réactif de transfection lipidique dans 450 microlitres de milieu mem pour faire le mélange de transfection lipidique. Ensuite, pipetez le plasmide.Mélangez le plasmide avec le récepteur olfactif marqué à l’opsine et le mélange de transfection lipidique dans une plaque MICROTITER propre. Pour rendre le complexe détaillé dans ce tableau, le calcul du puits plus 10 % est important pour garantir un volume suffisant pour les étapes suivantes. Mélangez la solution par tri curation et incubez à température ambiante pendant 15 minutes.Arrêtez la réaction en ajoutant M 10 selon le tableau. Pour le succès de cette procédure, il est important que les cellules ne soient jamais laissées sans milieu pendant plus de deux minutes. Pendant que les solutions s’ajoutent aux puits.Retirez les cellules de l’incubateur et retournez la plaque cellulaire et tapotez la pipette de média de 50 microlitres de complexe dans chaque puits et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 le lendemain de la transfection des récepteurs olfactifs. Observez les cellules transfectées pour assurer une bonne cofluence de 50 à 80 % par puits et renvoyez les cellules dans l’incubateur. L’odeur a été diluée à une concentration stockaire d’une molaire et le DMSO pour les expériences de dépistage dilue chaque solution mère d’odeur à 100 micromolaires.De plus, préparez un produit anti-odeur contenant uniquement du milieu CD 2 93 pour contrôler l’activation du fond des récepteurs olfactifs. Retirez les cellules de l’incubateur et tapotez le milieu des plaques cellulaires. Pipetez 25 microlitres de solution de stimulation des odeurs dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant quatre heures.Commencez cette procédure. Décongélation d’un millilitre de substrat de luciférase pour 96. Bien plaque préparer une luciférase fraîche luciférase réactif et réactif de substrat de luciférase à la vanille.Environ un millilitre de réactif est nécessaire par plaque de soudure 96. Ensuite, préparez le lecteur de microplaques luminescent dans l’icône du système sous la languette de préchauffage. Cochez la case et réglez la température de la machine sur 25 degrés Celsius sous la languette du distributeur.Amorcez chaque distributeur avec 1000 microlitres d’éthanol à 70 %, suivis de 1000 microlitres d’eau distillée. Utilisez des aliquotes distinctes d’alcool et d’eau pour chaque distributeur. Amorcez chaque distributeur avec 1 500 microlitres de distributeur d’air.L’un avec 1080 microlitres de distributeur de substrat luciférase Firefly. Deux avec substrat ranil luciférase. Veillez à ne pas contaminer les substrats de la luciférase.Configurez le protocole suivant pour lire la luciférase luciférase et la luminescence luciférase vanille dans le logiciel. Dans le menu Fichier. Cliquez sur les protocoles de mise en surbrillance des nouvelles tâches, puis sur en créer de nouveaux.Dans la fenêtre suivante, le cercle à côté de protocole standard doit être sélectionné. Cliquez sur OK. Double-cliquez sur la procédure.Sur le côté gauche de l’écran, distribuez 10 microlitres de substrat luciférase Firefly à tous les puits à l’aide du distributeur un sous le menu des actions, cliquez sur distribuer dans la fenêtre de l’étape de distribution. Réglez le distributeur sur un. Amorçage à aucun.Distribuez le volume à 10 microlitres et le débit à 225 microlitres par seconde, cliquez sur OK. Secouez la plaque pendant 30 secondes dans le menu des actions, cliquez sur secouer dans la fenêtre de l’étape de secousse. Réglez l’intensité sur moyenne et la durée sur 30 clics. D’accord.Lisez la luminescence de tous les puits pendant 0,5 seconde par puits dans le menu des actions. Cliquez sur lire dans la fenêtre de l’étape de lecture, définissez la méthode de détection sur luminescence, le type de lecture sur le point final, le temps d’intégration sur 50, les jeux de filtres sur une émission sur l’optique entière, la position sur le gain maximal à 1, 35 et la hauteur de lecture sur 1,00 millimètres. Cliquez sur OK.Distribuez 10 microlitres de substrat de luciférase dans tous les puits à l’aide du distributeur deux. Réglez les conditions comme indiqué pour l’utilisation du distributeur. Un sauf régler le distributeur sur deux.Secouez l’assiette pendant 30 secondes. Lisez la luminescence de tous les puits pendant 0,5 seconde par puits. Retirez le couvercle de la plaque à 96 puits et placez la plaque dans le lecteur de microplaques.Démarrez le programme précédemment configuré pour lire la luminescence de la plaque une fois la lecture terminée. Nettoyez les pompes distributrices de réactifs à partir de l’icône du système sous l’onglet du distributeur. Purgez 1000 microlitres de substrat de luciférase Firefly du distributeur de luciférase Firefly dans un tube de récupération amorcé.Chaque distributeur avec 1000 microlitres d’eau distillée suivis de 1000 microlitres d’éthanol à 70 %. Et enfin, 1 500 microlitres d’air montrés ici sont les résultats d’un dépistage primaire qui a testé 328 récepteurs olfactifs ou OR contre 26 odeurs à une concentration de 100 micromolaires. Cet histogramme représente la fréquence ou le nombre de valeurs de base de luciférase calculées pour chaque odorant ou paire à l’écran, car les paires d’activation des récepteurs odorants sont rares.La majorité des valeurs sont centrées à zéro et la grande distribution centrale estime la distribution du bruit pour ce test. Des courbes dose-réponse ont été effectuées sur 48 odorants ou paires répartis de manière aléatoire sur la plage des valeurs de référence, comme indiqué par les barres colorées. Les barres bleues sont des paires qui ont été classées comme agonistes sur la base de la relation dose-réponse complète, et les barres rouges sont des paires qui n’ont pas été classées comme agonistes.Le taux de vrais positifs a ensuite été tracé en fonction du taux de faux positifs à l’aide du progiciel statistique R. L’aire sous la courbe ou une CU est de 0,68, ce qui indique que les paires odorantes ou avec des valeurs de criblage de luciférase plus élevées sont plus susceptibles de passer la dose-réponse que celles avec des valeurs plus faibles. Ces données suggèrent que le criblage primaire est une méthode utile pour enrichir l’odorant ou les paires qui seront classées comme agonistes dans une expérience de réponse à la dose complète.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures pour 5 96 plaques ole, à l’exclusion du temps d’incubation si elle est correctement réalisée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse à haut débit des récepteurs olfactifs à l’aide de la stimulation olfactive par transfection et de la mesure de l’activation avec le dosage de la luciférase.

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